乌药提取物在制备治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用

摘要

本发明首次公开乌药提取物在治疗急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用。所述乌药提取物为乌药的醇提液。本发明采用LPS构建ARDS模型，结果表明经口给予乌药提取物能有效改善LPS诱导的模型小鼠肺水肿程度，减轻肺组织病理改变、抑制血清和肺泡灌洗液中TNF‑α、IL‑6等炎症因子表达，并降低NF‑κB通路中关键蛋白p‑p65表达。证实了经口给予乌药提取物对ARDS具有理想保护作用。因此，乌药提取物可应用于治疗急性呼吸窘迫综合征患者，有广泛的临床应用价值。

权利要求

1.乌药提取物在制备治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用，所述急性呼吸窘迫综合征是由内毒素诱导产生的，所述乌药提取物为乌药的醇提液，且乌药提取物是作为唯一的活性成分在制备治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用；

所述乌药提取物的制备方法如下：取乌药粗粉100g，加入80％乙醇200ml回流提取

1.5h，滤取药液，药渣继用80％乙醇以相同条件提取lh，滤取药液，合并2次药液，减压回收乙醇并浓缩，即得乌药醇提取物。

2.根据权利要求1所述的乌药提取物在制备治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用，其特征在于，所述乌药的醇提液浓度为1g生药/ml。

说明书

乌药提取物在制备治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域及药物治疗学领域，具体涉及乌药提取物在制备治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用。

背景技术

[0002] 急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由肺内原因和/或肺外原因引起的，以顽固性低氧血症为显著特征的临床综合征，是重症患者发生
死亡的常见原因。ICU入院患者中约有10％发生ARDS，其医院死亡率可达40％。因此，寻找有
效的治疗方法对于降低ARDS的高病死率、减轻社会经济负担极具价值。目前临床用于治疗
ARDS的激素、抗炎药物等存在作用靶点单一、抑制免疫细胞功能等问题，疗效欠佳。近来发
现，中药具有多途径和多靶点作用的特色，能够辩证调控复杂的炎症应答，在治疗ARDS方面
具有独特的优势。

[0003] 微生物如细菌等对细胞的感染激活了炎症反应，研究最多的细菌毒力因子是内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。LPS是多种革兰氏阴性细菌细胞壁的成分，细胞膜
上的受体可特异性识别LPS，并激活NF‑κB等信号通路导致炎症因子释放。LPS已经被广泛用
于诱导动物的急性炎症模型，用于候选抗炎药物的临床前评估。本发明采用LPS诱导的急性
呼吸窘迫综合征模型。

[0004] 乌药为樟科山胡椒属植物乌药[Lindera aggregata(Sims)Kosterm]的块根，现代药理学研究表明其在抗炎、镇痛、胃肠运动调节、抗氧化、抗肿瘤、保护肝损伤等多方面具有
作用。但是其在ARDS中的作用尚未见报道。

发明内容

[0005] 发明目的：本发明的目的是为临床治疗急性呼吸窘迫综合征提供一种疗效好、不良反应低的药物，研究发现乌药提取物在治疗急性呼吸窘迫综合征中有显著效果。

[0006] 为实现上述目的，本发明首次公开乌药提取物在治疗急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用。

[0007] 所述乌药提取物为乌药的醇提液。

[0008] 所述乌药提取物的制备方法如下：取乌药粗粉100g，加入80％乙醇200ml回流提取1.5h，滤取药液，药渣继用80％乙醇以相同条件提取lh，滤取药液，合并2次药液，减压回收
乙醇并浓缩，即得乌药醇提取物。所述乌药的醇提液浓度为1g生药/ml(1ml混合溶液含有1g
乌药醇提取物)。

[0009] 所述急性呼吸窘迫综合征疾病是由内毒素(LPS)诱导产生的。

[0010] 本发明采用LPS构建ARDS模型，结果表明经口给予乌药提取物能有效改善LPS诱导的模型小鼠肺水肿程度，减轻肺组织病理改变、抑制血清和肺泡灌洗液(bronchoalveolar 
lavage fluid，BALF)中TNF‑α、IL‑6等炎症因子表达，并降低NF‑κB通路中关键蛋白p‑p65表
达。证实了经口给予乌药提取物对ARDS具有理想保护作用。因此，乌药提取物可应用于治疗
急性呼吸窘迫综合征患者，有广泛的临床应用价值。

附图说明

[0011] 图1为乌药提取物对LPS诱导的小鼠肺组织湿/干重比值。

[0012] 图2为乌药提取物对LPS诱导的ARDS小鼠血/BALF上清液中TNF‑α、IL‑6含量的影响。A、B为血TNF‑α、IL‑6含量测定结果，C、D为BALF上清液中TNF‑α、IL‑6含量测定结果。

[0013] 图3为光镜观察乌药提取物对LPS诱导的小鼠肺组织病理学改变的影响。A‑D为小鼠肺组织HE染色(100倍)，A假手术组，B模型组，C乌药低剂量组，D乌药高剂量组；E‑H为小鼠
肺组织HE染色(200倍)，E假手术组，F模型组，G乌药低剂量组，H乌药高剂量组。

[0014] 图4为乌药提取物对LPS诱导的小鼠肺组织p65蛋白的磷酸化水平的影响，以β‑Actin作为内参。

具体实施方式

[0015] 为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

[0016] 本发明所使用的药物为乌药的醇提液。

[0017] 本发明中，经动物实验，发现乌药提取液对急性呼吸窘迫综合征具有显著治疗作用，实验方法与结果如下：

[0018] 实施例1实验材料

[0019] 1.1主要试剂

[0020] Western Blot所用抗体包括NF‑κB信号通路相关的p‑p65，另有β‑Actin、HRP标记抗鼠IgG、HRP标记抗兔IgG，上述抗体均购自Cell Signaling Technology(美国)；LPS
(E.coli O111:B4)购自Sigma‑Aldrich(美国)；mouse TNF‑α、IL‑6ELISA试剂盒购自RD(美
国)。

[0021] 1.2实验动物

[0022] C57BL/J小鼠，雄性，体重20～25g，扬州大学实验动物中心提供。空调控制室温20～25℃，湿度40～70％，自由饮水，摄食。

[0023] 1.3药物准备

[0024] 乌药醇提取物制备：取乌药100g，加入80％乙醇200ml回流提取1.5h，滤取药液，药渣继用80％乙醇以相同条件提取lh，滤取药液，合并2次药液，减压回收乙醇并浓缩，即得乌
药醇提取物(浓度相当于1g生药/ml)。

[0025] 实施例2实验方法

[0026] 2.1动物分组及造模

[0027] C57BL/J小鼠32只随机分为假手术组、模型组、乌药低剂量组、乌药高剂量组，每组8只。小鼠麻醉后切开颈部皮肤，分离气管，直视下穿刺注射LPS(5mg/kg)建立小鼠ARDS模
型。乌药低剂量组和乌药高剂量组分别给予乌药醇提物1g/kg和5g/kg灌胃，模型组给予等
量生理盐水灌胃，均为每日一次，建模前先预给药3天，建模后继续给药2天。

[0028] 2.2取材及主要实验方法

[0029] 造模后24小时取材。各组小鼠腹腔麻醉后行气管插管，右心取血离心取血清，作ELISA检测(TNF‑α、IL‑6)。结扎左侧肺门，以PBS液灌洗右肺并回收支气管肺泡灌洗液，每次
0.5ml，共3次，离心后取上清备ELISA检测(TNF‑α、IL‑6)。取右肺提取蛋白，用于蛋白印迹检
测(磷酸化p65)，左肺上叶取出测定肺湿/干重比值(W/D)，左肺下叶放入4％多聚甲醛中固
定，石蜡切片，行HE染色。

[0030] 2.3统计方法：

[0031] 数据均以均值±标准误表示。使用SPSS软件进行方差齐性、One‑way ANOVA分析。P＜0.05为有统计学差异。*表示相应两组P<0.05；**表示相应两组P<0.01；***表示相应两组
P<0.001。

[0032] 实施例3实验结果

[0033] 3.1肺水肿参数检测

[0034] 取小鼠左肺，用吸水纸吸干表面水分和血液,电子天秤称湿重质量，再将左肺置于70℃烘箱内烘烤48h，至恒重后称定质量记为干重，并计算左肺W/D。结果如图1，可见模型组
较假手术组湿/干重比值(W/D)明显增高(P<0.01)；而给予乌药后W/D降低，尤其是乌药高剂
量组与模型组W/D存有明显差异(P<0.01)。表明经口给予乌药可减轻ARDS模型小鼠肺水肿
的程度。

[0035] 3.2血/BALF上清液中TNF‑α、IL‑6含量测定

[0036] 采用ELISA试剂盒进行血/BALF上清液中TNF‑α、IL‑6含量测定。如图2，结果显示，模型组血/BALF中TNF‑α、IL‑6浓度较假手术组明显增高(P<0.001)；与模型组比较，乌药高
剂量组血/BALF中TNF‑α、IL‑6浓度明显降低(P<0.01)。表明给予5g/kg乌药可通过降低炎性
因子水平而减轻ARDS全身及肺部炎症反应。

[0037] 3.3肺组织病理学光镜观察

[0038] 小鼠肺组织经4％多聚甲醛固定后，经梯度脱水、石蜡包埋、石蜡切片机切片，再按照H&E染色程序染色后封片，经显微镜拍照观察并进行损伤程度评价，分别在100倍和200倍
视野观察病理学改变。结果可见假手术组肺组织结构正常,肺泡结构清晰。模型组镜下可见
肺组织水肿，肺组织间隙中有红细胞渗出，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增厚，肺泡坍
塌，肺泡腔变窄。而乌药低剂量组上述病理特征有所减轻，乌药高剂量组效果更为显著。见
图3，结果提示乌药提取物可以有效地减轻ARDS的肺组织病理变化。

[0039] 3.4小鼠肺组织p65的蛋白磷酸化水平检测

[0040] 取小鼠肺组织提取蛋白后行Western blot检测，指标为磷酸化p65。如图4，结果显示模型组p‑p65均较假手术组增高，提示小鼠行ARDS造模后其NF‑κB通路中的相关蛋白被磷
酸化激活；而给予乌药后尤其是乌药高剂量组p‑p65表达较模型组降低，提示乌药可通过抑
制炎症通路NF‑κB的激活，减少下游TNF‑α、IL‑6等炎症因子产生，从而减轻LPS诱导的ARDS
肺部炎症反应。进一步说明乌药提取物能够有效抑制LPS诱导的炎症反应，是一个理想的治
疗LPS诱导的ARDS患者的药物。

[0041] 结论

[0042] 本实验研究结果表明，经口给予乌药提取物能有效改善LPS诱导的小鼠肺湿/干重比值，减轻肺组织病理改变、抑制血清和肺泡灌洗液中TNF‑α、IL‑6等炎症因子表达，并降低
炎症通路NF‑κB中关键蛋白p‑p65表达。证实了经口给予乌药提取物具有减轻肺水肿、肺炎
症反应和急性肺损伤病理学病变的作用，能作为防治ARDS的有效药物。本发明具有重要的
临床应用价值，也为寻找ARDS疾病的治疗药物提供了新的方向。

[0043] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影
响本发明的实质内容。