一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201911067329.9
文献号 : CN112773904B
文献日 : 2022-04-26
发明人 : 冯亚凯 , 高彬 , 王小宇 , 郭锦棠 , 任相魁
申请人 : 天津大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统,其特征在于,按照下述步骤制备:
步骤1,制备预混基因溶液
将携带第一基因的第一质粒和携带第二基因的第二质粒进行混合,以得到预混基因溶液,第一质粒和第二质粒的质量比为(0.5—2):1;第一基因如序列表No.1序列所示,第二基因如序列表No.2序列所示;
步骤2,制备双基因递送系统
将多肽RH‑34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合,以得到三种基因递送系统,即具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统;多肽RH‑34与步骤1预混基因溶液中第一质粒和第二质粒质量之和的质量比为(3—6):1;多肽RH‑34如序列表No.3序列所示。
2.根据权利要求1所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统,其特征在于,第一质粒为质粒pZNF580;第二质粒为质粒pVEGF165;第一质粒和第二质粒的质量比为(1—2):1。
3.根据权利要求1所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统,其特征在于,选择将第一质粒和第二质粒分别均匀分散在水中,以形成水溶液,再将两种水溶液进行混合,在室温20—25摄氏度静置,得到预混基因溶液,静置时间为40—60min。
4.根据权利要求1所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统,其特征在于,在多肽RH‑34的缓冲溶液中,将RH‑34均匀分散在pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中;将多肽RH‑34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合后,在室温20—25摄氏度下静置,得到双基因递送系统,静置时间为20—30min。
5.根据权利要求1所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统,其特征在于,多肽RH‑34与步骤1预混基因溶液中两者质粒质量之和的质量比为(5—6):1。
6.一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统的制备方法,其特征在于,按照下述步骤进行:
步骤1,制备预混基因溶液
将携带第一基因的第一质粒和携带第二基因的第二质粒进行混合,以得到预混基因溶液,第一质粒和第二质粒的质量比为(0.5—2):1;第一基因如序列表No.1序列所示,第二基因如序列表No.2序列所示;
步骤2,制备双基因递送系统
将多肽RH‑34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合,以得到三种基因递送系统,即具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统;多肽RH‑34与步骤1预混基因溶液中第一质粒和第二质粒质量之和的质量比为(3—6):1;多肽RH‑34如序列表No.3序列所示。
7.根据权利要求6所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统的制备方法,其特征在于,选择将第一质粒和第二质粒分别均匀分散在水中,以形成水溶液,再将两种水溶液进行混合,在室温20—25摄氏度静置,得到预混基因溶液,静置时间为40—60min;
第一质粒为质粒pZNF580;第二质粒为质粒pVEGF165;第一质粒和第二质粒的质量比为(1—
2):1。
8.根据权利要求6所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统的制备方法,其特征在于,在多肽RH‑34的缓冲溶液中,将RH‑34均匀分散在pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中,多肽RH‑34与步骤1预混基因溶液中两者质粒质量之和的质量比为(5—6):1。
9.根据权利要求6所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统的制备方法,其特征在于,将多肽RH‑34的缓冲溶液与步骤1的预混基因溶液进行混合后,在室温20—
25摄氏度下静置,得到双基因递送系统,静置时间为20—30min。
10.如权利要求1—5任意一项所述的一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统在制备提高内皮细胞的体外血管化能力药物中的应用。
说明书 :
一种具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系统及其制备
方法和应用
技术领域
背景技术
单纯从基因载体的角度做基因治疗研究也使得治疗效率达到了一个上限,很难再取得重大
突破。这催促着新思路或新技术的出现进一步增强基因治疗的效果。在本专利中,我创造性
地提出了一种“增强基因表达”的研究思路,并通过协同相互作用实现了提高关键基因在
mRNA和蛋白水平上的表达,从而增强了基因的血管生成效果,为基因治疗用递送系统的设
计提供了新型能量。
发明内容
送系统的设计提供了新型能量。
cggctgggccgccacctcctcatcgacgccaatggggtcccctacacatacacggtgcagctggaggaggagcccc
ggggcccgccccagcgcgaggcgcccccaggagagcccggccctcgcaagggctacagctgcccggagtgcgcccg
tgtctttgccagccctctgcggctgcagagccaccgcgtgtcgcactcggacctcaagcccttcacgtgcggcgcc
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acacctgcccgctctgcccacgccgcttccaggacgccgcggagctggcgcagcacgtgcgcctccactaa。
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中第一质粒和第二质粒质量之和的质量比为(3—6):1
His‑His‑His‑His‑His‑His‑His‑His‑His。
和pVEGF165高效递送至血管内皮细胞,并且pZNF580和pVEGF165在细胞内协同表达,显著提
升了相关mRNA和蛋白的表达量,实现了“1+1>2”的协同效果,并且在血管生成实验中协同
效果也被证实,增强了基因治疗的效果。
附图说明
具体实施方式
pVEGF165购买与生工生物工程(上海)股份有限公司。
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ggggcccgccccagcgcgaggcgcccccaggagagcccggccctcgcaagggctacagctgcccggagtgcgcccg
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acacctgcccgctctgcccacgccgcttccaggacgccgcggagctggcgcagcacgtgcgcctccactaa。
cgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggacatcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttca
agccatcctgtgtgcccctgatgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgagga
gtccaacatcaccatgcagattatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatgagcttcctacag
cacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaaaatccctgtgggccttgctcagagcgga
gaaagcatttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggcgag
gcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtga。
溶液,分别记作p1:2,p1:1和p2:1。
温下静置30min,得到三种基因递送系统,即具有协同表达功能的纳米尺度双基因递送系
统,分别记作dual‑p1:2,dual‑p1:1和dual‑p2:1。
His‑His‑His‑His‑Hi s。
作single‑pZNF580。
记作single‑pVEGF165。
径,右纵坐标为Zeta电位,在每一组柱状图中,左侧柱状图对应该组的粒径数值,右侧柱状
图对应该组的Zeta电位数值。实验结果表明:各系统的粒径和Zeta电位数值非常接近,分别
为120±2nm和+20±2mV,利于细胞转染。
×10/孔接种到6孔板,在37℃环境孵化24h,换成无血清DMEM培养基。培养12h后,加入新鲜
制备的基因递送系统,继续培养4h,换成新鲜完全培养基,继续培养24h。倒掉培养液,用磷
酸盐缓冲液洗三遍,加100μL细胞裂解液,在冰上裂解30min,收集到EP管中。4℃,13000rpm
条件离心,取上清液,标准化浓度,水煮沸腾5min,检测蛋白的表达水平,然后用Image J软
件分析实验结果,见图2。A为对照组;B为实施例3中的基因递送系统single‑pZNF580;C为实
施例4的基因递送系统single‑pVEGF165;D为实施例2获得的基因递送系统dual‑p1:2;E为
实施例2获得的基因递送系统dual‑p1:1;F为实施例2获得的基因递送系统dual‑p2:1;在每
一组柱状图中,左侧柱状图对应该组的ZNF580蛋白表达水平,右侧柱状图对应该组的
VEGF165蛋白表达水平。实验结果表明,相比于单基因递送系统,双基因递送系统组能够同
时显著提高ZNF580和VEGF165蛋白在内皮细胞中的表达。
实施例3和实施例4中制备的基因递送系统转染内皮细胞24h。取出转染的细胞,用胰酶消
4
化,离心,重悬于无血清培养基,以4×10 细胞/孔的密度将其接种于基质胶上。37℃、5%
CO2环境下培养6h凝胶化。用显微镜下观察血管形成情况,拍照保存,并用Image J统计各组
的血管数量,见图3。A为对照组;B为实施例3中的基因递送系统single‑pZNF580;C为实施例
4的基因递送系统single‑pVEGF165;D为实施例2获得的基因递送系统dual‑p1:2;E为实施
例2获得的基因递送系统dual‑p1:1;F为实施例2获得的基因递送系统dual‑p2:1。实验结果
表明,相比于单基因递送系统,双基因递送系统组能够同时显著提高内皮细胞的体外血管
化能力,即本发明的双基因递送系统在制备提高内皮细胞的体外血管化能力药物中的应
用。
明的核心的情况下,任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳
动的等同替换均落入本发明的保护范围。