一种免疫细胞培养方法转让专利
申请号 : CN202110170617.8
文献号 : CN112779161B
文献日 : 2021-07-27
发明人 : 梅建勋 , 欧阳建华 , 汪凯 , 何伟贤 , 付引梅 , 谭慕华 , 梁键全
申请人 : 广东美赛尔细胞生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种免疫细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：准备工作，培养液及淋巴细胞分离液复温至室温；
S2：样品稀释，将分离血浆后的下层红细胞加入等体积生理盐水稀释，通过吹打混合机构充分吹打混匀，转移至50ml离心管中；
S3：梯度离心，于每管装有淋巴细胞分离液的50ml离心管中缓缓加入准备好的稀释血液，20℃，800g条件下通过第一离心机构离心20min；
S4：收集白膜层，离心后用移液机构的25ml移液管吸取中间白膜层于50ml离心管中，每管加生理盐水至50ml，转速1500rpm通过第二离心机构离心6min；
S5：清洗，倾弃上清，用手指适度弹敲离心管底部，直至细胞沉淀松散，加生理盐水重悬，将各离心管中的细胞悬液合并混匀，总体积30ml ；
S6：清洗，将所需体积的细胞悬液再次离心，转速1500rpm，离心6min，倾弃剩余上清，手指适度弹敲离心管底部，直至细胞沉淀松散；
S7：接种，用15ml完全培养基重悬，接种至培养瓶中；
S8：加滋养细胞，复苏滋养细胞，加生理盐水至40ml重悬，取样计细胞活率，转速
1500rpm离心5min，用15ml完全培养基重悬加入步骤七所述培养瓶中；
S9：起始培养，加入1.5ml浓度5%的自体血浆、30mlNK完全培养基，设置温度37℃在 CO2培养箱中开始培养；
S10：观察记录，肉眼及显微镜观察并进行相关数据检测和记录；
S11：冻存；
所述S2中的吹打混合机构（2）的底部设置有底板（1），且吹打混合机构（2）固定安装在底板（1）的顶部中心，所述吹打混合机构（2）包括处理箱（6）、箱盖（7）、进料口（8）、空心管（9）、缓冲板（10）和吹打管（11），所述底板（1）的顶部中心固定安装有固定架（27），且底板（1）顶部位于固定架（27）内部固定安装有处理箱（6），所述处理箱（6）的顶部安装有箱盖（7），且箱盖（7）顶部的一端设置有进料口（8），所述箱盖（7）的顶部中心固定安装有空心管（9），且空心管（9）的端部伸入处理箱（6）内部，所述空心管（9）位于处理箱（6）内部的一端固定连接有缓冲板（10），且缓冲板（10）整体成圆形结构，所述缓冲板（10）内设置有空腔，所述空心管（9）与缓冲板（10）内部连通，所述缓冲板（10）的底部等距固定连接有吹打管（11），且吹打管（11）均与缓冲板（10）内部连通，所述吹打管（11）的端部成锥形结构，且吹打管（11）的外侧安装有单向气阀；
所述S3中的第一离心机构（3）和步骤四中的第二离心机构（4）均固定安装在底板（1）顶部，所述第一离心机构（3）位于吹打混合机构（2）和第二离心机构（4）之间，所述步骤四中的移液机构（5）固定安装在底板（1）顶部，且移液机构（5）位于第一离心机构（3）和第二离心机构（4）之间；
所述空心管（9）位于箱盖（7）外部的一端固定连接有固定盒（13），且固定盒（13）的整体成圆板形结构，所述空心管（9）与固定盒（13）内部连通，所述固定盒（13）侧壁固定连接有安装盒（18），且安装盒（18）外侧等距开设有三个弧形槽（19），所述安装盒（18）内部通过弧形槽（19）与外部连通，所述固定盒（13）远离固定盒（13）的一侧内部固定连接有支撑弹簧（20），且支撑弹簧（20）的端部固定连接有封堵板（17），所述封堵板（17）配合滑动连接在安装盒（18）内部，所述固定盒（13）位于安装盒（18）的一侧开设有连通口（16），且固定盒（13）通过连通口（16）与安装盒（18）内部连通，所述封堵板（17）位于连通口（16）的一侧固定连接有滑动杆（15），且滑动杆（15）的端部穿过固定盒（13），所述箱盖（7）的顶部滑动连接有立板（14），所述滑动杆（15）的端部与立板（14）固定连接，所述滑动杆（15）外侧位于立板（14）和固定盒（13）之间套设有伸缩弹簧（22）；
所述箱盖（7）的顶部开设有水平方向的滑槽（12），所述立板（14）的底部设置有限位块，且限位块配合滑动连接在滑槽（12）内部，所述立板（14）通过设置在其上的限位块滑动连接在箱盖（7）顶部，所述箱盖（7）顶部位于立板（14）的侧边对称固定连接有固定板（26），且两个固定板（26）之间的顶端通过转轴转动连接有偏心轮（24），所述偏心轮（24）与立板（14）接触，所述固定板（26）顶端固定安装有转动电机（25），且转动电机（25）的输出轴端部穿过固定板（26）与偏心轮（24）固定连接；
所述第一离心机构（3）和第二离心机构（4）均包括固定座（28）、转台（29）、固定槽（30）、放置架（31）和离心管（32），所述底板（1）顶部位于固定架（27）外部等距固定安装有四个固定座（28），且固定座（28）内转动连接有转台（29），所述转台（29）的顶部等距开设有四个固定槽（30），且四个固定槽（30）内转动连接有放置架（31），所述放置架（31）内卡接有离心管（32），所述固定架（27）的顶部固定安装有水泵（42），且水泵（42）的进液端安装有连接管（43），且连接管（43）的端部与处理箱（6）的底端连接，所述水泵（42）的出水端固定安装有排料管（44），且排料管（44）位于离心管（32）的正上方；
所述转台（29）的底部转动连接有外齿圈（39），所述放置架（31）的底部均转动连接有传动齿轮（38），且四个传动齿轮（38）均与外齿圈（39）啮合连接，所述转台（29）底部固定安装有伺服电机（40），且伺服电机（40）的输出轴端部固定安装有驱动齿轮（41），所述驱动齿轮（41）与外齿圈（39）啮合连接。
2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述封堵板（17）位于固定盒（13）的一侧设置有密封垫（21），且密封垫（21）与固定盒（13）紧密接触，所述封堵板（17）表面位于滑动杆（15）外侧对称固定有限位杆（23），且限位杆（23）的端部滑动穿过固定盒（13）与立板（14）固定连接。
3.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述固定座（28）内壁的底部通过轴承转动连接有传动杆（36），且传动杆（36）外侧固定安装有从动齿轮（34），所述固定座（28）内壁的底部固定安装有驱动电机（37），且驱动电机（37）的输出轴端部固定安装有主动齿轮（35），所述主动齿轮（35）与从动齿轮（34）啮合连接。
4.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述移液机构（5）包括安装架（45）、固定杆（46）、支撑杆（47）、丝杠（48）、滑块（49）、移液电机（50）、电动推杆（51）和移液管（52），所述底板（1）顶部位于第一离心机构（3）和第二离心机构（4）之间固定安装有安装架（45），所述安装架（45）的顶端固定连接有固定杆（46），且固定杆（46）的端部固定连接有支撑杆（47），所述固定杆（46）的表面设置有长度刻度线（53），所述固定杆（46）的顶部开设有水平方向的凹槽，且凹槽内转动连接有丝杠（48），所述丝杠（48）外侧螺纹连接有滑块（49），且滑块（49）配合滑动连接在固定杆（46）内部，所述固定杆（46）端部固定安装有移液电机（50），且移液电机（50）的输出轴端部伸入固定杆（46）内部与丝杠（48）固定连接，所述滑块（49）的端部固定安装有电动推杆（51），且电动推杆（51）的端部固定安装有移液管（52），所述移液管（52）位于离心管（32）的正上方。
5.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述放置架（31）内壁的顶端设置有密封圈（33），所述放置架（31）的顶端与固定槽（30）内壁密封连接，且放置架（31）内部与固定槽（30）内部连通。
6.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述转台（29）的顶部中心开设有圆柱槽，且圆柱槽内固定安装有加热板（57），所述转台（29）上的圆柱槽内设置有水箱（54），且水箱（54）的顶部中心设置有把手（58），所述水箱（54）的顶部安装有气泵（55），所述气泵（55）的进气端与外界连通，且气泵（55）的出气端安装有通气管（56），且通气管（56）的端部伸入水箱（54）内部，所述通气管（56）位于水箱（54）内部的一段成螺旋状设置。
说明书 :
一种免疫细胞培养方法
技术领域
背景技术
质，免疫细胞在医学上有着重要的作用，因此需要对免疫细胞进行培养。
的细胞较少，培养效率较为低下，为此，我们提出一种免疫细胞培养方法。
发明内容
述底板的顶部中心固定安装有固定架，且底板顶部位于固定架内部固定安装有处理箱，所
述处理箱的顶部安装有箱盖，且箱盖顶部的一端设置有进料口，所述箱盖的顶部中心固定
安装有空心管，且空心管的端部伸入处理箱内部，所述空心管位于处理箱内部的一端固定
连接有缓冲板，且缓冲板整体成圆形结构，所述缓冲板内设置有空腔，所述空心管与缓冲板
内部连通，所述缓冲板的底部等距固定连接有吹打管，且吹打管均与缓冲板内部连通，所述
吹打管的端部成锥形结构，且吹打管的外侧安装有单向气阀；
固定安装在底板顶部，且移液机构位于第一离心机构和第二离心机构之间。
外侧等距开设有三个弧形槽，所述安装盒内部通过弧形槽与外部连通，所述固定盒远离固
定盒的一侧内部固定连接有支撑弹簧，且支撑弹簧的端部固定连接有封堵板，所述封堵板
配合滑动连接在安装盒内部，所述固定盒位于安装盒的一侧开设有连通口，且固定盒通过
连通口与安装盒内部连通，所述封堵板位于连通口的一侧固定连接有滑动杆，且滑动杆的
端部穿过固定盒，所述箱盖的顶部滑动连接有立板，所述滑动杆的端部与立板固定连接，所
述滑动杆外侧位于立板和固定盒之间套设有伸缩弹簧。
部，所述箱盖顶部位于立板的侧边对称固定连接有固定板，且两个固定板之间的顶端通过
转轴转动连接有偏心轮，所述偏心轮与立板接触，所述固定板顶端固定安装有转动电机，且
转动电机的输出轴端部穿过固定板与偏心轮固定连接。
接有转台，所述转台的顶部等距开设有四个固定槽，且四个固定槽内转动连接有放置架，所
述放置架内卡接有离心管，所述固定架的顶部固定安装有水泵，且水泵的进液端安装有连
接管，且连接管的端部与处理箱的底端连接，所述水泵的出水端固定安装有排料管，且排料
管位于离心管的正上方。
电机的输出轴端部固定安装有驱动齿轮，所述驱动齿轮与外齿圈啮合连接。
与立板固定连接。
电机，且驱动电机的输出轴端部固定安装有主动齿轮，所述主动齿轮与从动齿轮啮合连接。
述安装架的顶端固定连接有固定杆，且固定杆的端部固定连接有支撑杆，所述固定杆的表
面设置有长度刻度线，所述固定杆的顶部开设有水平方向的凹槽，且凹槽内转动连接有丝
杠，所述丝杠外侧螺纹连接有滑块，且滑块配合滑动连接在固定杆内部，所述固定杆端部固
定安装有移液电机，且移液电机的输出轴端部伸入固定杆内部与丝杠固定连接，所述滑块
的端部固定安装有电动推杆，且电动推杆的端部固定安装有移液管，所述移液管位于离心
管的正上方。
泵，所述气泵的进气端与外界连通，且气泵的出气端安装有通气管，且通气管的端部伸入水
箱内部，所述通气管位于水箱内部的一段成螺旋状设置。
动推动滑动杆滑动，滑动杆推动封堵板在安装盒内部滑动，封堵板向支撑弹簧处滑动过程
中，支撑弹簧和伸缩弹簧压缩，此时连通口处于打开状态，外部的气体通过弧形槽和连通口
进入固定盒内，当偏心轮的端部远离立板时看，立板在伸缩弹簧和支撑弹簧的作用下恢复
位置，此时封堵板将连通口封堵住，气体通过吹打管向处理箱内部吹打，转动电机工作中吹
打管不断地向处理箱内部吹打，避免了以往人工手动操作对细胞培养液吹打费时费力且吹
打效果差的情况，提高了吹打效率，通过设置了第一离心机构和第二离心机构能够实现对
细胞培养液的离心处理，通过控制转台的间歇式转动，使转台上的每个离心管中置入原料，
接着控制加热板工作将水箱内部的水加热，然后气泵工作，气体经过水箱内部的热水进行
一定程度的加热，使热气进入固定槽内部，对离心管进行加热，同时控制系统控制伺服电机
工作使驱动齿轮转动，通过驱动齿轮与外齿圈的啮合连接使四个传动齿轮转动，进而使放
置架转动，从而实现离心管的转动，能够对离心管内部的液体进行离心处理，过程操作连
续，节省了时间，提高了离心效率，装置通过一次性在吹打混合机构外部设置四个第一离心
机构和四个第二离心机构，多工位操作，能够一次性进行大量免疫细胞的培养，效率高，便
于推广。
附图说明
板；15、滑动杆；16、连通口；17、封堵板；18、安装盒；19、弧形槽；20、支撑弹簧；21、密封垫；
22、伸缩弹簧；23、限位杆；24、偏心轮；25、转动电机；26、固定板；27、固定架；28、固定座；29、
转台；30、固定槽；31、放置架；32、离心管；33、密封圈；34、从动齿轮；35、主动齿轮；36、传动
杆；37、驱动电机；38、传动齿轮；39、外齿圈；40、伺服电机；41、驱动齿轮；42、水泵；43、连接
管；44、排料管；45、安装架；46、固定杆；47、支撑杆；48、丝杠；49、滑块；50、移液电机；51、电
动推杆；52、移液管；53、长度刻度线；54、水箱；55、气泵；56、通气管；57、加热板；58、把手。
具体实施方式
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本发明保护的范围。
30ml NK完全培养基重悬后加入原来的培养瓶中，并加入1.5ml自体血浆。第4天到第6天每
天肉眼及显微镜观察，观察细胞是否抱团明显，根据观察情况添加培养液和自体血浆。第6
天转至瓶中培养。第7天肉眼及显微镜观察，加A2及加培养液：复苏A2(滋养细胞)，添加培养
基，自体血浆，转移至2个T175瓶中培养(第7天为过渡时期，血浆浓度最好为2‑3％，后续培
养浓度为1％)第8天到第9天每天肉眼及显微镜观察，添加培养基，自体血浆，一般第8‑9天
入袋培养，总体积至少250ml以上。
体积未达到1800ml，可根据情况适当加液，第14天不再进行任何操作。吹打均匀，取样检测
细胞浓度及活率。第14天以后肉眼及显微镜观察至细胞状态，并收获：将培养袋中液体充分
混匀，取样Pre计细胞浓度和活率及流式检测，将培养液转移至50ml离心管中，1400rpm离心
5min，弃上清，将培养液再次转移至此50ml离心管中离心(最多重复利用1次)，弃上清，将细
胞沉淀用生理盐水重悬至40ml，取样Post计细胞浓度和活率，将细胞悬液1400rpm，离心
5min，取上清液进行无菌检测及支原体和内毒素检测，配制冻存液：ml(90％FBS+10％
DMSO)，根据计数结果(以Pre为标准，Post为参考)冻存NK细胞：4ml/管。
测降温过程，将细胞转移至液氮罐中长期保存，并打印程序降温曲线；
9、缓冲板10和吹打管11，所述底板1的顶部中心固定安装有固定架27，且底板1顶部位于固
定架27内部固定安装有处理箱6，通过固定架27起到对处理箱6的固定支撑作用；
心管9位于处理箱6内部的一端固定连接有缓冲板10，且缓冲板10整体成圆形结构，所述缓
冲板10内设置有空腔，所述空心管9与缓冲板10内部连通，所述缓冲板10的底部等距固定连
接有吹打管11，且吹打管11均与缓冲板10内部连通，所述吹打管11的端部成锥形结构，且吹
打管11的外侧安装有单向气阀；
间，所述步骤四中的移液机构5固定安装在底板1顶部，且移液机构5位于第一离心机构3和
第二离心机构4之间，通过第一离心机构3和第二离心机构4能够进行离心处理，通过移液机
构5的设置能够将第一离心机构3上的离心管32内的液体转移至第二离心机构4上的离心管
32内部。
接有安装盒18，且安装盒18外侧等距开设有三个弧形槽19，所述安装盒18内部通过弧形槽
19与外部连通，所述固定盒13远离固定盒13的一侧内部固定连接有支撑弹簧20，且支撑弹
簧20的端部固定连接有封堵板17，通过封堵板17的设置能够对连通口16进行封堵；
17位于连通口16的一侧固定连接有滑动杆15，且滑动杆15的端部穿过固定盒13，所述箱盖7
的顶部滑动连接有立板14，所述滑动杆15的端部与立板14固定连接，所述滑动杆15外侧位
于立板14和固定盒13之间套设有伸缩弹簧22，通过装置预设的电力控制系统控制转动电机
25工作使偏心轮24转动，偏心轮24转动过程中不断地推动立板14在箱盖7上滑动，立板14向
固定盒13处滑动推动滑动杆15滑动，滑动杆15推动封堵板17在安装盒18内部滑动，封堵板
18向支撑弹簧20处滑动过程中，支撑弹簧20和伸缩弹簧22压缩，此时连通口16处于打开状
态，外部的气体通过弧形槽19和连通口16进入固定盒13内，当偏心轮24的端部远离立板14
时看，立板14在伸缩弹簧22和支撑弹簧20的作用下恢复位置，此时封堵板17将连通口16封
堵住，气体通过吹打管11向处理箱6内部吹打。
动连接在箱盖7顶部，所述箱盖7顶部位于立板14的侧边对称固定连接有固定板26，且两个
固定板26之间的顶端通过转轴转动连接有偏心轮24，所述偏心轮24与立板14接触，所述固
定板26顶端固定安装有转动电机25，且转动电机25的输出轴端部穿过固定板26与偏心轮24
固定连接。
装有四个固定座28，且固定座28内转动连接有转台29，所述转台29的顶部等距开设有四个
固定槽30，且四个固定槽30内转动连接有放置架31，所述放置架31内卡接有离心管32，所述
固定架27的顶部固定安装有水泵42，且水泵42的进液端安装有连接管43，且连接管43的端
部与处理箱6的底端连接，所述水泵42的出水端固定安装有排料管44，且排料管44位于离心
管32的正上方；
热，同时控制系统控制伺服电机40工作使驱动齿轮41转动，通过驱动齿轮41与外齿圈39的
啮合连接使四个传动齿轮38转动，进而使放置架31转动，从而实现离心管32的转动，能够对
离心管32内部的液体进行离心处理。
定安装有伺服电机40，且伺服电机40的输出轴端部固定安装有驱动齿轮41，所述驱动齿轮
41与外齿圈39啮合连接，通过伺服电机40巩固走使驱动齿轮41转动，通过驱动齿轮41与外
齿圈39的啮合连接使外齿圈39转动，通过外齿圈39与四个传动齿轮38的啮合连接实现放置
架31的转动，进而实现离心管32的转动，从而实现对离心管32内细胞的离心处理。
的端部滑动穿过固定盒13与立板14固定连接，通过密封垫21能够进行更好的密封，使封堵
板17和固定盒13之间紧密接触，能够将连通口16密封住，避免气体进入固定盒13内部。
部固定安装有驱动电机37，且驱动电机37的输出轴端部固定安装有主动齿轮35，所述主动
齿轮35与从动齿轮34啮合连接，通过控制驱动电机37工作使主动齿轮35转动，通过主动齿
轮35与从动齿轮34的啮合连接实现传动杆36的转动，传动杆36带动转台29转动，从而实现
转台29的转动，通过装置设置的控制系统控制驱动电机37工作，进而控制转台29的间歇式
转动，能够控制离心管32的转动位置。
机构4之间固定安装有安装架45，安装架45起到较好的固定支撑作用；
块49移动的位置，所述固定杆46的顶部开设有水平方向的凹槽，且凹槽内转动连接有丝杠
48，所述丝杠48外侧螺纹连接有滑块49，且滑块49配合滑动连接在固定杆46内部，所述固定
杆46端部固定安装有移液电机50，且移液电机50的输出轴端部伸入固定杆46内部与丝杠48
固定连接，通过控制移液电机50工作，使螺纹杆48转动，通过螺纹杆48与滑块49的螺纹连接
实现滑块49的移动，进而带动移液管52移动；
第一离心机构3上离心管32内的中间白膜层于50ml第二离心机构4上的离心管32中。
起到较好的密封效果，另一方面能够进行一定的防滑，防止离心管32发生晃动。
过把手58的设置便于提拉出水箱54，通过圆柱槽便于安装水箱54，通过圆柱槽内部安装的
加热板57便于对水箱54内部的水进行加热；
于水箱54内部的一段成螺旋状设置，通过控制气泵55工作能够对固定槽30内部的离心管32
进行加热，气泵55工作将外部的气体置于通气管56内部，通过水箱54内部的热水对通气管
56进行加热，使热气体进入固定槽30内部，实现对离心管32的加热。
浆后的下层红细胞，通过进料口8向处理箱6内部加入等体积生理盐水稀释，通过装置预设
的电力控制系统控制转动电机25工作使偏心轮24转动，偏心轮24转动过程中不断地推动立
板14在箱盖7上滑动，立板14向固定盒13处滑动推动滑动杆15滑动，滑动杆15推动封堵板17
在安装盒18内部滑动，封堵板18向支撑弹簧20处滑动过程中，支撑弹簧20和伸缩弹簧22压
缩，此时连通口16处于打开状态，外部的气体通过弧形槽19和连通口16进入固定盒13内，当
偏心轮24的端部远离立板14时看，立板14在伸缩弹簧22和支撑弹簧20的作用下恢复位置，
此时封堵板17将连通口16封堵住，气体通过吹打管11向处理箱6内部吹打，转动电机25工作
中吹打管11不断地向处理箱6内部吹打，使处理箱6内部被稀释的液体充分吹打混匀，然后
水泵42工作将液体抽至离心管32转移至50ml第一离心机构3上的离心管32中，转移过程中
控制驱动电机37工作使主动齿轮35转动，通过主动齿轮35与从动齿轮34的啮合连接使传动
杆36转动，进而使转台29转动，控制系统控制转台29间歇式转动，使转台29上的每个离心管
32中置入原料，接着控制加热板57工作将水箱54内部的水加热，然后气泵55工作，气体经过
水箱54内部的热水进行一定程度的加热，使热气进入固定槽30内部，对离心管32进行加热，
同时控制系统控制伺服电机40工作使驱动齿轮41转动，通过驱动齿轮41与外齿圈39的啮合
连接使四个传动齿轮38转动，进而使放置架31转动，从而实现离心管32的转动，能够对离心
管32内部的液体进行离心处理，离心完成后，控制移液电机50工作，使螺纹杆48转动，通过
螺纹杆48与滑块49的螺纹连接实现滑块49的移动，进而带动移液管52移动，电动推杆51配
合移液管52使第一离心机构3上离心管32内的中间白膜层于50ml第二离心机构4上的离心
管32中，每管加生理盐水至50ml，1500rpm离心6min(加速9，刹车9)。
NK2002 2020.10.16 91.33
NK2003 2020.10.17 93.19
NK2004 2020.10.22 92.27
NK2005 2020.10.23 91.31
NK2006 2020.10.24 92.08
在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖
非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要
素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备
所固有的要素。
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。