一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用

摘要

本发明公开了一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用。本发明的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，可通过基因工程技术进行大规模标准化批量生产，抗原质量稳定，结果重复性好。本发明的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，既可用于曼氏血吸虫病免疫诊断又可用于埃及血吸虫病免疫诊断，且具有极高的灵敏度。本发明的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP抗原成分单一，SmSAP‑ELISA对血吸虫病免疫诊断具有极好的特异度，且不与其他寄生虫病患者血清发生交叉反应，应用前景广阔。

权利要求

1.曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP在制备输入性血吸虫病免疫诊断试剂中的应用，所

述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP 的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊

断中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其在血吸虫病免疫诊断中的应用。

背景技术

[0002] 血吸虫病是一种严重威胁人类健康的传染性寄生虫疾病，主要流行于亚非拉的76个国家和地区，全球血吸虫感染人数超2亿人。寄生于人体的血吸虫主要有6种，包括日本血
吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、间插血吸虫、湄公血吸虫和马来血吸虫，其中以日本血吸
虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫引起的血吸虫病流行范围最广其危害最大。日本血吸虫病主
要流行于我国长江流域及东南亚等国家，曼氏血吸虫主要流行于非洲及南美洲等国家，埃
及血吸虫主要流行于非洲及中东地区。随着经济全球化的不断推进，中非贸易和援外项目
增多，出国务工和旅行人员日增加，我国输入性曼氏血吸虫病例和埃及血吸虫病例呈逐年
增加趋势。

[0003] 目前，我国对输入性血吸虫病病例的诊断多依赖于传统的形态学检测方法。这种方法主要通过检查病人肠道组织、粪便或尿液中的血吸虫虫卵来确诊疾病，不但费时费力，
而且对轻度血吸虫感染病例诊断的灵敏度较低，极易漏检轻度感染血吸虫病人。

[0004] 相比于形态学诊断方法，免疫学诊断方法具有操作简便快捷和灵敏度高等优点。但是，目前用于血吸虫病免疫学诊断的最常用的抗原是血吸虫虫体混合抗原组分，例如虫
卵可溶抗原，成虫可溶抗原等，由于这种粗提抗原的成分复杂，容易与其他寄生虫病人血清
发生交叉反应，导致该类血吸虫病诊断方法的特异性不足，且生产的试剂不宜标准化。

[0005] 依靠基因工程技术生产的血吸虫重组抗原具有成分单一、交叉反应少、可大规模批量生产等优点，被认为是理想的血吸虫病诊断抗原分子。近几年，我国科学家报道了多个
日本血吸虫病免疫诊断抗原，例如SjSP‑13、SjSAPLP4和SjSAPLP5抗原，以该类抗原建立的
酶联免疫吸附试验(Enzyme‑linked immune sorbent assay，ELISA)诊断方法对日本血吸
虫病诊断具有极高的灵敏度和特异度。但是，由于日本血吸虫蛋白与曼氏血吸虫同源蛋白
的序列同存在较大差异，因此已有的日本血吸虫病免疫诊断方法不能完全满足曼氏血吸虫
病免疫诊断需求。

[0006] 曼氏血吸虫基因组的破译为血吸虫病防治的研究提供了空前丰富的信息资源和平台。本发明利用生物信息学方法对曼氏血吸虫全基因组编码基因预测分析发现曼氏血吸
虫基因组中存在一个鞘脂激活蛋白样蛋白(Schistosoma mansoni Saposin‑like 
protein，SmSAP)基因家族，其编码蛋白中含有一个或多个SapB保守功能结构域。本发明利
用基因合成方法将其中两个SmSAP基因进行基因融合并构建重组融合蛋白表达载体，并利
用原核表达系统进行重组蛋白制备，ELISA试验确认所得重组融合蛋白用于曼氏血吸虫病
和埃及血吸虫病的免疫诊断具有高灵敏度和特异度，是潜在的输入性血吸虫病免疫诊断抗
原候选靶标，从而完成了本发明。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP及其制备方法，本发明的另一目的是提供曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP在血吸虫病免疫诊断中的应用，为此还
提供了一种具有高灵敏度和特异度的输入性血吸虫病免疫诊断试剂盒。

[0008] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

[0009] 本发明首先提供了一种经大肠杆菌密码子优化的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其编码的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP的
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 本发明还提供了一种重组质粒pET28a‑SmSAP，其包含上述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP编码基因。

[0011] 本发明还提供了一种大肠肝菌宿主细胞，其包含上述的重组质粒pET28a‑SmSAP。

[0012] 本发明还提供了一种曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0013] 具体地，上述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，其由去除信号肽序列的曼氏血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白SmSAP1和曼氏血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白SmSAP2组成，SmSAP1蛋白
和SmSAP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

[0014] 本发明还提供了上述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP在输入性血吸虫病免疫诊断中的应用。

[0015] 具体提供了一种血吸虫病SmSAP‑ELISA免疫诊断试剂盒，其包被抗原为上述的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP。

[0016] 与现有技术相比，本发明的技术效果：

[0017] 本发明的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，可通过基因工程技术进行大规模标准化批量生产，抗原质量稳定，结果重复性好。本发明的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，既可
用于曼氏血吸虫病免疫诊断又可用于曼氏血吸虫病免疫诊断，且具有极高的灵敏度。本发
明的曼氏血吸虫重组融合蛋白SmSAP，该抗原成分单一，SmSAP‑ELISA对血吸虫病免疫诊断
具有极好的特异度，且不与其他寄生虫病患者血清发生交叉反应。

附图说明

[0018] 为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一
些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0019] 图1为本发明实施例1构建的曼氏血吸虫pET28a‑SmSAP重组质粒结构示意图。

[0020] 图2是本发明实施例2中SmSAP重组蛋白的SDS‑PAGE分析结果示意图。泳道M为蛋白分子量标准、泳道1为未诱导全菌对照、泳道2为诱导后4小时全菌、泳道3为诱导后菌体裂解
后上清、泳道4为诱导后菌体裂解后沉淀、泳道5为纯化的SmSAP重组蛋白。

[0021] 图3为本发明实施例3中SmSAP重组蛋白抗原与小鼠抗His标签抗体、不同血吸虫病人血清及健康人血清的Western blotting分析结果示意图。泳道M为蛋白分子量标准、泳道
1为小鼠抗His标签抗体阳性对照、泳道2为曼氏血吸虫病患人血清、泳道为3埃及血吸虫病
人血清、泳道4为日本血吸虫病人血清、泳道为5健康人血清。

[0022] 图4为本发明实施例5中SmSAP‑ELISA与已有研究报道的SjSAP‑ELISA用于血吸虫病免疫诊断评价比较的结果示意图。其中A为SmSAP‑ELISA的检测结果，B为SjSAP‑ELISA的
检测结果。

具体实施方式

[0023] 本发明的总体技术方案如下：

[0024] 首先我们利用生物信息学方法对曼氏血吸虫全基因组编码的SmSAP基因进行预测，然后利用基因合成技术制备曼氏血吸虫SmSAP融合基因，并克隆至表达质粒载体pET‑
28a(+)构建成曼氏血吸虫SmSAP融合基因原核表达的重组质粒pET28a‑SmSAP，通过转化筛
选，质粒测序鉴定确认后，转化至大肠肝菌宿主细胞中进行SmSAP重组融合蛋白诱导表达；
包涵体蛋白经变性和镍柱亲和层析纯化，最终制备获得SmSAP重组融合蛋白。我们利用
Western blotting技术验证了制备的SmSAP重组融合蛋白可被曼氏血吸虫病和埃及血吸虫
病患者血清抗体免疫识别。进而，我们以纯化的SmSAP重组融合蛋白为免疫诊断抗原进行血
吸虫病诊断试剂和试剂盒的制备，通过ELISA技术分析评价了其在输入性曼氏血吸虫病和
埃及血吸虫病免疫诊断中的应用价值。

[0025] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的
实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获
得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说
明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店
购买得到的。

[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。

[0027] 实施例1曼氏血吸虫SmSAP融合蛋白基因合成及原核表达载体构建

[0028] 利用生物信息学方法对曼氏血吸虫全基因组编码的SmSAP基因进行预测，曼氏血吸虫SmSAP融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，SmSAP融合蛋白由去除信号
肽序列的曼氏血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白1(SmSAP1)和曼氏血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2
(SmSAP2)组成，SmSAP1蛋白和SmSAP2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID 
NO.3所示序列。根据大肠杆菌的密码子偏好性设计出SmSAP融合蛋白编码基因，然后利用基
因合成技术制备曼氏血吸虫SmSAP融合基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示序
列，同时在基因5’端和3’端分别设计Nde I和Xho I酶切位点，由苏州金唯智生物科技有限
公司通过人工合成方法合成SmSAP融合蛋白编码基因。

[0029] 将人工合成的目的基因及表达载体pET‑28a(+)分别用Nde I和Xho I内切酶进行双酶切并进行胶回收纯化；使用T4 DNA连接酶将目的基因片段和表达载体片段连接，将连
接产物转化至大肠杆菌Trans1‑T1感受态细胞，将转化后的感受态细胞涂至LB培养基平板
(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜；挑取阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司进行
DNA测序。测序分析结果表明插入的目的基因片段序列正确，重组质粒pET28a‑SmSAP构建成
功，重组质粒图谱如图1所示。

[0030] 实施例2曼氏血吸虫SmSAP融合蛋白的原核表达及纯化

[0031] 将测序正确的pET28a‑SmSAP重组质粒转化至表达感受态细胞Transetta(DE3)，将转化后的感受态细胞涂至LB培养基平板(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜；将阳性克隆
接种到LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)15mL，37℃培养过夜，第二天取10mL培养基转接
入1L LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)，继续培养至OD600nm值为0.8，再加入终浓度为1mM的
IPTG进行诱导表达4小时，离心收集菌体，‑80℃冻存备用。

[0032] 取少量诱导前和诱导后的菌体重悬于PBS缓冲液中，加入SDS‑PAGE上样缓冲液，混匀后于沸水浴中煮5min使蛋白变性；每个上样孔中分别加入诱导前和诱导后的样品各10μ
l，进行12％SDS‑PAGE凝胶电泳分析；如图所示2，将pET28a‑SmSAP重组质粒转化表达感受态
细胞，经IPTG诱导表达后在42kDa分子量位置出现一条明显表达条带，其分子量大小与目的
重组蛋白的理论相对分子量相符。

[0033] 将诱导后的菌体重悬于40mL细菌裂解液中，超声破碎，4℃，12,000rpm离心30min，分别收集包涵体沉淀和上清液；将包涵体沉淀和上清液进行SDS‑PAGE凝胶电泳分析，鉴定
重组蛋白的溶解性。结果如图2所示，SmSAP重组蛋白主要存在于包涵体沉淀中。

[0034] 将包涵体重悬于含1％Triton‑X100的PBS溶液超声洗涤5min，12,000rpm离心15min收集包涵体沉淀；将包涵体重悬于8M尿素，4℃旋转混匀过夜，充分溶解包涵体，12,
000rpm离心30min收集上清液；将上清液过镍离子螯合胶柱(QIAGEN公司)使带有6个组氨酸
标签的重组SmSAP融合蛋白结合在胶柱上，用50mM咪唑冲洗杂蛋白，再用250mM咪唑洗脱重
组蛋白，收集洗脱液；纯化所得重组蛋白经SDS‑PAGE凝胶电泳分析检测蛋白纯度。电泳结果
如图2所示，结果表明经镍离子螯合胶柱纯化后获得了纯度较高的SmSAP重组融合蛋白。使
用BCA蛋白质定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)测定重组蛋白的浓度，按照说
明书进行操作。

[0035] 实施例3曼氏血吸虫SmSAP重组蛋白的抗原性检测

[0036] 取SmSAP重组蛋白200ng上样，进行SDS‑PAGE凝胶电泳；采用湿转法将PAGE胶中的蛋白转移至PVDF膜；将PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭2h，TBST缓冲液洗涤3次；以小鼠抗
His标签抗体为阳性对照和健康人血清为阴性对照，分别加入曼氏血吸虫病患者血清、埃及
血吸虫病患者血清和日本血吸虫病患者血清(用封闭液1:100稀释)，4℃孵育过夜，TBST缓
冲液洗涤3次；分别加入荧光标记的抗小鼠IgG抗体或抗人IgG抗体(用封闭液1:10,000稀
释)，37℃避光孵育1h，TBST缓冲液洗涤3次；使用Odyssey红外激光成像系统扫描成像。结果
如图3所示，在42kDa处有一明显的条带可被小鼠抗His标签抗体、曼氏血吸虫病患者血清和
埃及血吸虫病患者血清免疫识别，日血吸虫病患者血清和健康人血清在42kDa处没有免疫
识别条带。

[0037] 实施例4血吸虫病SmSAP‑ELISA免疫诊断试剂盒制备

[0038] 1)试剂盒的主要组分包括：

[0039] 包被抗原的固相载体：用碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)稀释SmSAP重组蛋白至1μg/mL，包被于聚苯乙烯反应孔中，100μL/孔。

[0040] 酶标抗体：碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白(γ‑chain specific)抗体(sigma公司)

[0041] 底物：pNPP(sigma公司)

[0042] 洗涤缓冲液：TPBS

[0043] 稀释液：5g脱脂奶粉溶于TPBS缓冲液100mL。

[0044] 底物缓冲液：二乙醇胺0.1mol/L(9.7ml)，MgCl2 1mmol/L(10mg),浓盐酸调pH至9.8，蒸馏水定容至100mL。

[0045] 反应终止液：12g NaOH溶于蒸馏水中，最后定容至100mL。

[0046] 2)试剂盒的操作程序及检测方法：

[0047] 封闭：甩干孔内液体，加稀释液200μL/孔，37℃，封闭1h，用PBST洗涤三次，200μL/孔，最后一次拍干。

[0048] 加待检样本：待检样本血清和稀释液按1:100比例稀释，同时设阳性、阴性和空白对照(仅加样本稀释液)，100μL/孔，37℃孵育30min。

[0049] 洗涤：甩干孔内液体，用PBST洗涤三次，200μL/孔，最后一次拍干。

[0050] 加酶标抗体：加入1:5000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗人IgG(γ‑chain specific)抗体，100μL/孔，37℃孵育30min，如上洗涤，拍干。

[0051] 显色：加入酶底物显色液，100μL/孔，37℃避光孵育15min，加入终止液，25μL/孔。

[0052] 数据读取及处理：用酶标仪读取OD405nm数值，以阴性对照样品的OD均值的2.1倍作为判断阴阳性的临界值(cut‑off)。

[0053] 实施例5SmSAP‑ELISA对血吸虫病免疫诊断价值评价

[0054] 1)SmSAP‑ELISA灵敏度评价

[0055] 病原学确诊的曼氏血吸虫患者血清17份，埃及血吸虫患者血清20份，日本血吸虫患者血清30份，评价SmSAP‑ELISA的灵敏度，并与SjSAP‑ELISA[Liu S,et al.J Infect 
Dis.2016,214(8):1225‑34.]进行比较，ELISA实验操作同实施例4。

[0056] SmSAP‑ELISA结果如表1和图4A所示，17份曼氏血吸虫病人血清中，16份血清被SmSAP‑ELISA免疫诊断为抗体阳性，SmSAP‑ELISA对曼氏血吸虫病免疫诊断的灵敏度为
94.1％(95％置信区间，69.2％‑99.7％)；20份埃及血吸虫病人血清中，19份血清被SmSAP‑
ELIS免疫诊断为抗体阳性，SmSAP‑ELISA对埃及血吸虫病免疫诊断的灵敏度为95％(95％置
信区间，73.1％‑99.7％)；30份日本血吸虫病人血清被SmSAP‑ELISA免疫诊断为抗体阴性。

[0057] SjSAP‑ELISA结果如表1和图4B所示，30份日本血吸虫病人血清均被SjSAP‑ELISA免疫诊断为抗体阳性，SjSAP‑ELISA对日本血吸虫病免疫诊断的灵敏度为100％(95％置信
区间，85.9％‑100％)；17份曼氏血吸虫病人血清和20份埃及血吸虫病人血清均被SjSAP‑
ELISA免疫诊断为抗体阴性。

[0058] 本发明的SmSAP‑ELISA对曼氏血吸虫病和埃及血吸虫病免疫诊断具有极高的灵敏度，但不适用于日本血吸虫病免疫诊断；SjSAP‑ELISA对日本血吸虫病免疫诊断具有极高的
灵敏度，但不适用于曼氏血吸虫病和埃及血吸虫病免疫诊断。

[0059] 表1 SmSAP‑ELISA与SjSAP‑ELISA对血吸虫病诊断灵敏度比较

[0060]

[0061] 2)SmSAP‑ELISA特异度评价

[0062] 收集非血吸虫病流行地区健康人血清样本50份，华支睾吸虫病患者血清19份，肝包虫病患者血清22份，恶性疟患者血清20份，评价SmSAP‑ELISA对血吸虫病诊断的特异度，
以及与其它寄生虫病患者血清的交叉反应情况，并与SjSAP‑ELISA进行比较，ELISA实验操
作同实施例4。

[0063] SmSAP‑ELISA结果如表2和图4A所示，50份健康人血清均被SjSAP‑ELISA与SmSAP‑ELISA免疫诊断为抗体阴性，两种ELISA的特异度为100％(95％置信区间，91.1％‑100％)；
所有华支睾吸虫病患者血清、肝包虫病患者血清及恶性疟患者血清均被两种ELISA诊断为
阴性，无交叉反应。

[0064] 表2 SmSAP‑ELISA与SjSAP‑ELISA对血吸虫病诊断特异度的比较分析

[0065]

[0066] 以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所
描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明
权利要求保护范围的限制。