杜梨转录因子PbrWRKY40及其在提高植物总酸含量和抗盐遗传改良中的应用转让专利
申请号 : CN202110016563.X
文献号 : CN112794887B
文献日 : 2022-04-19
发明人 : 张绍铃 , 黄小三 , 林立锟 , 黄咏丹 , 董慧珍 , 谢智华 , 齐开杰 , 王亚茹
申请人 : 南京农业大学
摘要 :
本发明提供了杜梨转录因子PbrWRKY40及其在提高植物总酸含量和抗盐遗传改良中的应用，属于基因工程技术领域。含PbrWRKY40编码基因的拟南芥转化植株的抗盐能力显著高于野生型植株，体内总酸含量也显著高于野生型；另外阳性植株钠离子含量、电导率、过氧化氢含量和超氧阴离子含量均低于野生型拟南芥。将杜梨幼苗体内的PbrWRKY40转录因子沉默后，野生型杜梨幼苗的抗盐能力优于沉默的杜梨幼苗，表明PbrWRKY40转录因子的沉默使杜梨幼苗的抗盐性减弱，体内总酸含量降低。因此，本发明提供了杜梨转录因子PbrWRKY40在提高植物总酸含量和抗盐遗传改良中的应用。
权利要求 :
1.杜梨转录因子PbrWRKY40、所述杜梨转录因子PbrWRKY40的编码基因、克隆所述编码+
基因的引物对或含所述编码基因的重组载体在植物抗盐胁迫中的应用，所述抗盐为Na；
所述转录因子PbrWRKY40的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；
所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
所述引物对包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示的反向引物。
2.杜梨转录因子PbrWRKY40、所述杜梨转录因子PbrWRKY40的编码基因、克隆所述编码基因的引物对或含所述编码基因的重组载体在制备抗盐转基因植物中的应用，所述抗盐为+
Na；
所述转录因子PbrWRKY40的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；
所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
所述引物对包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示的反向引物。
3.杜梨转录因子PbrWRKY40、所述杜梨转录因子PbrWRKY40的编码基因、克隆所述编码+
基因的引物对或含所述编码基因的重组载体在抗盐植物选育中的应用，所述抗盐为Na；
所述转录因子PbrWRKY40的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；
所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
所述引物对包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示的反向引物。
4.根据权利要求1～3任意一项所述应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥或者杜梨。
5.杜梨转录因子PbrWRKY40、所述杜梨转录因子PbrWRKY40的编码基因、克隆所述编码基因的引物对或含所述编码基因的重组载体在提高植物总酸含量中的应用，所述转录因子PbrWRKY40的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；
所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
所述引物对包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示的反向引物。
说明书 :
杜梨转录因子PbrWRKY40及其在提高植物总酸含量和抗盐遗
传改良中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及杜梨转录因子PbrWRKY40及其在提高植物总酸含量和抗盐遗传改良中的应用。
背景技术
[0002] 盐胁迫是一种世界性范围的非生物胁迫，是主要限制作物产量的不利环境因素之一，世界上因为盐害而荒废的土地众多。因此，急需通过提高作物的耐盐性从而提高作物产
量以满足日益增长的人口需求。传统的杂交育种培育周期长，成效进展缓慢，转基因育种具
有周期短、成效快等优点，将会成为今后育种的主要方式。
量以满足日益增长的人口需求。传统的杂交育种培育周期长，成效进展缓慢，转基因育种具
有周期短、成效快等优点，将会成为今后育种的主要方式。
[0003] 与动物不同，植物无法移动，因此植物不得不面对盐害、干旱、低温、病害等不利环境。为了克服这些不利环境，植物进化出了一系列基因调控网络，以外源胁迫信号来诱导相
关应激基因的表达从而保护植物不受胁迫侵害。基因根据功能可以分为两类，功能基因和
转录因子。功能基因位于调控网络下游，可以直接参与应激反应，提高植物对不利条件的抗
性。转录因子则是通过调控功能基因的表达从而提高植物的抗性，位于调控网络中游。
关应激基因的表达从而保护植物不受胁迫侵害。基因根据功能可以分为两类，功能基因和
转录因子。功能基因位于调控网络下游，可以直接参与应激反应，提高植物对不利条件的抗
性。转录因子则是通过调控功能基因的表达从而提高植物的抗性，位于调控网络中游。
[0004] WRKY是一类存在于高等植物中的重要转录因子。WRKY转录因子家族成员均含有60个氨基酸残基序列组成的高度保守的结构域，其N‑端含有WRKYGQK保守序列，与DNA结合活
性有关；C‑端具有一个典型的锌指结构，一般由CX4‑7CX22‑23HXH/C组成，参与蛋白质互作
和辅助DNA结合作用。WRKY蛋白还含有细胞核定位信号肽(NLS)，参与对靶基因的调控作用。
性有关；C‑端具有一个典型的锌指结构，一般由CX4‑7CX22‑23HXH/C组成，参与蛋白质互作
和辅助DNA结合作用。WRKY蛋白还含有细胞核定位信号肽(NLS)，参与对靶基因的调控作用。
[0005] 杜梨作为梨产业中应用较普遍的一种砧木，其耐盐性极高，是研究木本植物耐盐性和克隆有关抗盐基因的理想材料。目前关于杜梨的抗盐相关转录因子的报道十分有限，
因此，克隆杜梨抗盐相关转录因子为抗盐杜梨的选育及改造提供重要基因基础。
因此，克隆杜梨抗盐相关转录因子为抗盐杜梨的选育及改造提供重要基因基础。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种杜梨转录因子PbrWRKY40，可激活提高酸含量和抗盐相关基因表达，有效提高转基因植物的总酸含量和抗盐性。
[0007] 本发明的目的还在于提供杜梨转录因子PbrWRKY40在提高植物总酸含量和抗盐遗传改良中的应用。
[0008] 本发明提供了一种杜梨转录因子PbrWRKY40，所述转录因子PbrWRKY40的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
[0009] 本发明提供了所述的杜梨中转录因子PbrWRKY40的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
[0010] 本发明提供了一种用于克隆所述编码基因的引物对，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示的反向引物。
[0011] 本发明提供了一种包含所述编码基因的重组载体。
[0012] 本发明提供了所述杜梨转录因子PbrWRKY40、所述编码基因、所述引物对或所述重组载体在植物抗盐胁迫中的应用。
[0013] 本发明提供了所述杜梨转录因子PbrWRKY40、所述编码基因、所述引物对或所述重组载体在抗盐转基因植物中的应用。
[0014] 本发明提供了所述杜梨转录因子PbrWRKY40、所述编码基因、所述引物对或所述重组载体在抗盐植物选育中的应用。
[0015] 优选的，所述抗盐包括Na+和K+；
[0016] 优选的，所述抗盐中盐的浓度不高于1000mmol/L。
[0017] 本发明提供了，所述植物包括拟南芥或者杜梨。
[0018] 本发明提供了所述杜梨转录因子PbrWRKY40、所述编码基因、所述引物对或所述重组载体在提高植物总酸含量中的应用。
[0019] 本发明提供了一种杜梨转录因子PbrWRKY40，所述转录因子PbrWRKY40的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。通过分别构建含转录因子PbrWRKY40的编码基因的拟南芥
转化载体和转录因子PbrWRKY40基因沉默杜梨幼苗转化载体，获得阳性植株苗进行盐处理，
结果发现：转基因拟南芥阳性植株苗的电导率较野生型(WT)显著降低，叶绿素含量和总酸
含量较野生型显著升高，转基因株系中Na+含量较低，而K+含量较高，且种子萌发率比野生
型提高2倍，根生长量也比野生有显著增加，表明阳性植株苗比野生型有更强的耐盐能力。
病毒沉默杜梨幼苗植株的中的MDA含量比野生型要高，植株体内叶绿素含量和总酸含量更
+ +
低。这些结果表明，过表达的PbrWRKY40基因能够有效维持细胞内Na/K浓度的平衡，提高植
物总酸含量，保持细胞渗透势稳定，从而使植物更好的适应盐胁迫；相反的，PbrWRKY40基因
的沉默使植株的耐盐能力减弱。这表明，所述转录因子PbrWRKY40通过正向调控达到植物抗
盐胁迫的目的。因此，杜梨中转录因子PbrWRKY40、所述的编码基因或所述的引物对克隆的
编码基因对在提高植物总酸含量和耐盐能力中的应用。
转化载体和转录因子PbrWRKY40基因沉默杜梨幼苗转化载体，获得阳性植株苗进行盐处理，
结果发现：转基因拟南芥阳性植株苗的电导率较野生型(WT)显著降低，叶绿素含量和总酸
含量较野生型显著升高，转基因株系中Na+含量较低，而K+含量较高，且种子萌发率比野生
型提高2倍，根生长量也比野生有显著增加，表明阳性植株苗比野生型有更强的耐盐能力。
病毒沉默杜梨幼苗植株的中的MDA含量比野生型要高，植株体内叶绿素含量和总酸含量更
+ +
低。这些结果表明，过表达的PbrWRKY40基因能够有效维持细胞内Na/K浓度的平衡，提高植
物总酸含量，保持细胞渗透势稳定，从而使植物更好的适应盐胁迫；相反的，PbrWRKY40基因
的沉默使植株的耐盐能力减弱。这表明，所述转录因子PbrWRKY40通过正向调控达到植物抗
盐胁迫的目的。因此，杜梨中转录因子PbrWRKY40、所述的编码基因或所述的引物对克隆的
编码基因对在提高植物总酸含量和耐盐能力中的应用。
附图说明
[0020] 图1为本发明提供的杜梨转录因子PbrWRKY40抗盐胁迫流程示意图；
[0021] 图2为本发明提供的梨转录因子亚细胞定位图，其中，图2‑A是GFP空载质粒在明场(Bright field)、GFP场(GFP)、DAPI场(DAPI)和混合场(Merge)的成像图；图2‑B是
PbrWRKY40‑GFP基因在明场(Bright field)、GFP场(GFP)、DAPI场(DAPI)和混合场(Merge)
的成像图；
PbrWRKY40‑GFP基因在明场(Bright field)、GFP场(GFP)、DAPI场(DAPI)和混合场(Merge)
的成像图；
[0022] 图3为本发明提供的超表达拟南芥植株的鉴定图，其中，图3‑A是利用基因的特异性引物进行PCR鉴定拟南芥T0代转基因植株电泳图，其中M：Marker，P：质粒，阳性；WT：野生
型植株，阴性；H2O：阴性对照；26，38，39为三个转基因株系，图3‑B为RT‑PCR鉴定转基因拟南
芥TI代植株的超表达分析，WT为野生型植株，OE26、OE38和OE39为三个超表达系；
型植株，阴性；H2O：阴性对照；26，38，39为三个转基因株系，图3‑B为RT‑PCR鉴定转基因拟南
芥TI代植株的超表达分析，WT为野生型植株，OE26、OE38和OE39为三个超表达系；
[0023] 图4为本发明提供的转基因PbrWRKY40拟南芥阳性苗盐板处理发芽率的测定图，其中，图4‑A为三个转基因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT在100mmol/L浓度盐板MS上发
芽情况以及发芽率统计图，图4‑B为三个转基因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT在
125mmol/L浓度盐板MS上发芽情况以及发芽率统计图；
芽情况以及发芽率统计图，图4‑B为三个转基因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT在
125mmol/L浓度盐板MS上发芽情况以及发芽率统计图；
[0024] 图5为本发明提供的转基因PbrWRKY40拟南芥阳性苗在盐板培养时根生长情况图以及酶活含量，其中，图5‑A为7天苗龄三个转基因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在
125mmol/L浓度盐板MS上生长7天的生长情况和跟生长量统计图；图5‑B为7天苗龄三个转基
因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在150mmol/L浓度盐板MS上生长7天的生长情况和
跟生长量统计图；图5‑C为7天苗龄三个转基因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在
150mmol/L浓度盐板MS上生长7天后的过氧化氢酶(CAT)含量；图5‑D为7天苗龄三个转基因
超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在150mmol/L浓度盐板MS上生长7天后的过氧化物酶
(POD)含量；图5‑E为7天苗龄三个转基因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在150mmol/
L浓度盐板MS上生长7天后的超氧化物歧化酶(SOD)含量；
125mmol/L浓度盐板MS上生长7天的生长情况和跟生长量统计图；图5‑B为7天苗龄三个转基
因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在150mmol/L浓度盐板MS上生长7天的生长情况和
跟生长量统计图；图5‑C为7天苗龄三个转基因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在
150mmol/L浓度盐板MS上生长7天后的过氧化氢酶(CAT)含量；图5‑D为7天苗龄三个转基因
超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在150mmol/L浓度盐板MS上生长7天后的过氧化物酶
(POD)含量；图5‑E为7天苗龄三个转基因超表达株系(OE26，OE38和OE39)和WT的在150mmol/
L浓度盐板MS上生长7天后的超氧化物歧化酶(SOD)含量；
[0025] 图6为本发明提供的转PbrWRKY40的编码基因拟南芥阳性苗盐处理前后的表现型和生理指标，其中，图6‑A是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天前的表型和荧
光叶绿素拍照；图6‑B是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后的表型和荧光叶
绿素拍照；图6‑C是拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的Fv/Fm；图6‑D为拟南芥阳性植
株和野生型植株盐胁迫后的电导率；图6‑E为拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的叶
绿素表型图；图6‑F为拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的叶绿素含量图；图6‑G为拟
南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的丙二醛含量图；图6‑H为拟南芥阳性植株和野生型
+
植株盐胁迫后的总酸含量图；图6‑I为拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的Na 含量
+
图；图6‑J为拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的K 含量图；图6‑K为拟南芥阳性植株
+ +
和野生型植株盐胁迫后的Na/K含量图；
光叶绿素拍照；图6‑B是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后的表型和荧光叶
绿素拍照；图6‑C是拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的Fv/Fm；图6‑D为拟南芥阳性植
株和野生型植株盐胁迫后的电导率；图6‑E为拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的叶
绿素表型图；图6‑F为拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的叶绿素含量图；图6‑G为拟
南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的丙二醛含量图；图6‑H为拟南芥阳性植株和野生型
+
植株盐胁迫后的总酸含量图；图6‑I为拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的Na 含量
+
图；图6‑J为拟南芥阳性植株和野生型植株盐胁迫后的K 含量图；图6‑K为拟南芥阳性植株
+ +
和野生型植株盐胁迫后的Na/K含量图；
[0026] 图7为本发明提供的转基因PbrWRKY40的编码基因拟南芥组织化学染色分析H2O2和‑
O2积累，其中图7‑A是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个
转基因株系活性氧组织化学染色采用硝基四氮唑(NBT)对H2O2进行染色；图7‑B是是苗龄20
天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系活性氧组织化学
‑
染色采用二氨基联苯胺(DAB)对O2进行染色；图7‑C是苗龄7天的拟南芥植株在含有125mM氯
化钠的MS基本培养基上处理7天后野生型植株和三个转基因株系用硝基四氮唑(NBT)对H2O2
进行染色；图7‑D是苗龄7天的拟南芥植株在含有125mM氯化钠的MS基本培养基上处理7天后
‑
未转化植株和三个转基因株系用二氨基联苯胺(DAB)对O2进行染色；图7‑E是苗龄20天的拟
南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系过氧化氢含量测定；图
7‑F是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系抗
超氧阴离子含量测定；
O2积累，其中图7‑A是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个
转基因株系活性氧组织化学染色采用硝基四氮唑(NBT)对H2O2进行染色；图7‑B是是苗龄20
天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系活性氧组织化学
‑
染色采用二氨基联苯胺(DAB)对O2进行染色；图7‑C是苗龄7天的拟南芥植株在含有125mM氯
化钠的MS基本培养基上处理7天后野生型植株和三个转基因株系用硝基四氮唑(NBT)对H2O2
进行染色；图7‑D是苗龄7天的拟南芥植株在含有125mM氯化钠的MS基本培养基上处理7天后
‑
未转化植株和三个转基因株系用二氨基联苯胺(DAB)对O2进行染色；图7‑E是苗龄20天的拟
南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系过氧化氢含量测定；图
7‑F是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系抗
超氧阴离子含量测定；
[0027] 图8为本发明提供的PbrWRKY40基因沉默的杜梨幼苗株系(pTRV‑1，pTRV‑2和pTRV‑3)及野生型植株(WT)250mM氯化钠浇20天的表型和生理指标测定结果，其中图8‑A是苗龄45
天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天前的表型以及荧光叶绿素拍照；图8‑B是苗龄45天的
杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的表型以及荧光叶绿素拍照；图8‑C是苗龄45天的杜梨
幼苗在250mM盐溶液处理20天后的叶绿素提取；图8‑D是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM盐溶
液处理20天后的Fv/Fm；图8‑E为PbrWRKY40基因病毒沉默瞬时转化杜梨幼苗沉默效率鉴定，
实时定量PCR(RT‑PCR)分析秋子梨不同病毒沉默株系中的PbrWRKY40的编码基因的表达量,
其中，WT为野生型植株，pTRV‑1，pTRV‑2，pTRV‑3为三个沉默系；图8‑F是苗龄45天的杜梨幼
苗在250mM氯化钠处理20天前的MDA含量；图8‑G是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理
20天后的总酸含量；图8‑H是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钠离子含
量；图8‑I是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钾离子含量；图8‑J是苗龄45
天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钠钾比。
天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天前的表型以及荧光叶绿素拍照；图8‑B是苗龄45天的
杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的表型以及荧光叶绿素拍照；图8‑C是苗龄45天的杜梨
幼苗在250mM盐溶液处理20天后的叶绿素提取；图8‑D是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM盐溶
液处理20天后的Fv/Fm；图8‑E为PbrWRKY40基因病毒沉默瞬时转化杜梨幼苗沉默效率鉴定，
实时定量PCR(RT‑PCR)分析秋子梨不同病毒沉默株系中的PbrWRKY40的编码基因的表达量,
其中，WT为野生型植株，pTRV‑1，pTRV‑2，pTRV‑3为三个沉默系；图8‑F是苗龄45天的杜梨幼
苗在250mM氯化钠处理20天前的MDA含量；图8‑G是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理
20天后的总酸含量；图8‑H是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钠离子含
量；图8‑I是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钾离子含量；图8‑J是苗龄45
天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钠钾比。
具体实施方式
[0028] 本发明提供了一种杜梨转录因子PbrWRKY40，所述转录因子PbrWRKY40的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1(MDYSAAYDDDTSLDLNSMPLRLFNDTPMIKKEVHSKILIDFGRQLSPKEESG
ALLEELHRVSAENKKLTEMLTVMGENYNALRNQLLEYMSKNPEKELSPISKKRKSESSNNNTNSNNIMNGAVNRNS
ESSSSDGESYKKPREEIVKAKISRACVQTEASDTSLVVKDGYQWRKYGQKVTRDNPCPRAYFKCSFAPSCPVKKKV
QRSVEDQSILVATYEGEHNHPNPSQIEATSGSNHCVAIGSVPCSTSLGSTGPTITLDLTKSKSSTSDAKSTKTRTE
TPEVRKFLVQQMASSLTKDPDFTKALAAAISGRILQHNTY*)所示。所述PbrWRKY40编码320个氨基酸，
+ +
分子量为35.42KDa。所述转录因子PbrWRKY40具有维持植物细胞Na/K 平衡，降低植物在盐
胁迫下的MDA含量，从而说明该转录因子具有抗盐胁迫的功能，同时该转录因子还可以提高
载体植物体内总酸含量。在本发明中，所述转录因子通过将所述转录因子的编码基因进行
重组表达得到。所述重组表达的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组表达方式即
可。
ALLEELHRVSAENKKLTEMLTVMGENYNALRNQLLEYMSKNPEKELSPISKKRKSESSNNNTNSNNIMNGAVNRNS
ESSSSDGESYKKPREEIVKAKISRACVQTEASDTSLVVKDGYQWRKYGQKVTRDNPCPRAYFKCSFAPSCPVKKKV
QRSVEDQSILVATYEGEHNHPNPSQIEATSGSNHCVAIGSVPCSTSLGSTGPTITLDLTKSKSSTSDAKSTKTRTE
TPEVRKFLVQQMASSLTKDPDFTKALAAAISGRILQHNTY*)所示。所述PbrWRKY40编码320个氨基酸，
+ +
分子量为35.42KDa。所述转录因子PbrWRKY40具有维持植物细胞Na/K 平衡，降低植物在盐
胁迫下的MDA含量，从而说明该转录因子具有抗盐胁迫的功能，同时该转录因子还可以提高
载体植物体内总酸含量。在本发明中，所述转录因子通过将所述转录因子的编码基因进行
重组表达得到。所述重组表达的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组表达方式即
可。
[0029] 本发明提供了所述的杜梨中转录因子PbrWRKY40的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2(ATGGACTACTCAGCTGCATATGATGATGATACTTCTTTGGATCTTA
ATTCCATGCCTCTCAGACTTTTCAATGACACTCCGATGATCAAAAAAGAGGTGCATAGCAAAATATTGATCGACTT
TGGGAGGCAGCTTTCACCTAAAGAAGAGAGCGGTGCCCTATTGGAAGAATTGCACCGAGTGAGTGCAGAGAACAAG
AAGCTAACCGAAATGTTGACGGTGATGGGAGAGAACTACAATGCTTTGAGAAACCAACTGTTGGAGTACATGAGCA
AGAACCCGGAGAAGGAGCTTAGCCCAATTTCAAAGAAAAGAAAGTCCGAAAGCAGCAACAACAACACAAACAGTAA
TAATATCATGAATGGAGCAGTGAATAGAAACTCGGAGAGCAGTTCCAGTGATGGAGAGTCCTACAAGAAACCAAGA
GAAGAGATCGTCAAGGCTAAGATTTCAAGGGCTTGTGTCCAGACAGAAGCATCTGATACAAGCTTGGTTGTGAAAG
ATGGATATCAATGGAGGAAATATGGCCAAAAAGTTACTAGGGATAATCCTTGTCCTAGAGCTTACTTCAAATGCTC
TTTTGCTCCAAGCTGCCCTGTCAAAAAGAAGGTTCAAAGAAGTGTTGAGGACCAATCTATTTTGGTGGCAACTTAT
GAAGGTGAACACAACCACCCCAACCCTTCCCAAATTGAAGCAACATCGGGCTCAAACCACTGCGTGGCAATAGGAT
CCGTCCCTTGCTCAACCTCCCTTGGCTCAACTGGACCTACAATTACTCTTGACTTGACCAAATCCAAGTCCAGTAC
TTCGGATGCCAAGAGCACAAAAACAAGAACTGAAACACCCGAAGTTCGCAAATTTTTGGTGCAGCAGATGGCTTCT
TCCTTGACAAAGGATCCCGATTTCACGAAAGCACTTGCAGCAGCCATATCAGGAAGAATACTTCAACATAATACTT
ATTGA)所示。所述编码基因优选通过克隆方式获得。
ATTCCATGCCTCTCAGACTTTTCAATGACACTCCGATGATCAAAAAAGAGGTGCATAGCAAAATATTGATCGACTT
TGGGAGGCAGCTTTCACCTAAAGAAGAGAGCGGTGCCCTATTGGAAGAATTGCACCGAGTGAGTGCAGAGAACAAG
AAGCTAACCGAAATGTTGACGGTGATGGGAGAGAACTACAATGCTTTGAGAAACCAACTGTTGGAGTACATGAGCA
AGAACCCGGAGAAGGAGCTTAGCCCAATTTCAAAGAAAAGAAAGTCCGAAAGCAGCAACAACAACACAAACAGTAA
TAATATCATGAATGGAGCAGTGAATAGAAACTCGGAGAGCAGTTCCAGTGATGGAGAGTCCTACAAGAAACCAAGA
GAAGAGATCGTCAAGGCTAAGATTTCAAGGGCTTGTGTCCAGACAGAAGCATCTGATACAAGCTTGGTTGTGAAAG
ATGGATATCAATGGAGGAAATATGGCCAAAAAGTTACTAGGGATAATCCTTGTCCTAGAGCTTACTTCAAATGCTC
TTTTGCTCCAAGCTGCCCTGTCAAAAAGAAGGTTCAAAGAAGTGTTGAGGACCAATCTATTTTGGTGGCAACTTAT
GAAGGTGAACACAACCACCCCAACCCTTCCCAAATTGAAGCAACATCGGGCTCAAACCACTGCGTGGCAATAGGAT
CCGTCCCTTGCTCAACCTCCCTTGGCTCAACTGGACCTACAATTACTCTTGACTTGACCAAATCCAAGTCCAGTAC
TTCGGATGCCAAGAGCACAAAAACAAGAACTGAAACACCCGAAGTTCGCAAATTTTTGGTGCAGCAGATGGCTTCT
TCCTTGACAAAGGATCCCGATTTCACGAAAGCACTTGCAGCAGCCATATCAGGAAGAATACTTCAACATAATACTT
ATTGA)所示。所述编码基因优选通过克隆方式获得。
[0030] 本发明提供了一种用于克隆所述编码基因的引物对，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3(ATGGACTACTCAGCTGCATATGATG)所示的正向引物和核苷酸序列如序列表中SEQ
ID NO：4(ATAAGTATTATGTTGAAGTATTCTTCCTGATATG)所示的反向引物。本发明对所述引物对
的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的生物合成公司合成即可。在本发明实施例中，所
述引物对委托上海生工生物工程有限公司合成。
ID NO：4(ATAAGTATTATGTTGAAGTATTCTTCCTGATATG)所示的反向引物。本发明对所述引物对
的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的生物合成公司合成即可。在本发明实施例中，所
述引物对委托上海生工生物工程有限公司合成。
[0031] 在本发明中，所述引物对克隆所述编码基因的方法，优选包括以下步骤：
[0032] 1)提取杜梨的RNA；
[0033] 2)对所述RNA进行逆转录，得到cDNA；
[0034] 3)以所述cDNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0035] 本发明对提取杜梨的RNA的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的RNA提取方法即可，例如TRIzol法或试剂盒法。所述逆转录优选采用逆转录试剂盒进行，例如可参考
TOYOBO反转录试剂盒操作手册进行。
TOYOBO反转录试剂盒操作手册进行。
[0036] 在本发明中，所述PCR扩增的扩增体系优选：1μL模板cDNA、5μL PCR buffer、1μL dNTD Mix(10mmol/L)、正向引物和反向引物各1μL、0.5μL Taq DNA聚合酶(5U)和10.5μL无
核酶水。所述PCR扩增的扩增程序优选：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火60s，72℃
延伸60s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。
核酶水。所述PCR扩增的扩增程序优选：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火60s，72℃
延伸60s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。
[0037] 本发明提供了一种包含所述编码基因的重组载体。
[0038] 在本发明中，所述重组载体优选为超表达载体。所述超表达载体的载体骨架优选为pEASY。本发明对所述pEASY质粒的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的pEASY质粒即
可。所述编码基因的插入多克隆位点优选为Kpn I/SalI。
可。所述编码基因的插入多克隆位点优选为Kpn I/SalI。
[0039] 在本发明中，所述重组载体的构建方法，优选包括以下步骤：
[0040] A.将克隆得到的编码基因片段和骨架载体分别采用双酶切，得到两端带有酶切位点的编码基因片段和线性骨架载体；
[0041] B.将所述两端带有酶切位点的编码基因片段和线性骨架载体进行连接，得到重组载体。
[0042] 在本发明中，所述克隆得到的编码基因片段在双酶切前优选进行纯化。所述纯化优选采用切胶回收试剂盒进行。本发明对所述双酶切的方法不做具体限定，采用本领域所
熟知的双酶切方法即可。
熟知的双酶切方法即可。
[0043] 在本发明中，所述连接优选采用T4连接酶进行。本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的连接方法即可。
[0044] 在本发明中，所述连接后，还优选对连接产物进行验证。所述验证的方法将连接产物转入大肠杆菌感受态中，筛选培养，测序，阳性菌提取质粒，得到重组载体。所述转入大肠
杆菌的方法优选采用热激法进行。所述测序委托南京诺唯赞生物科技集团完成。
杆菌的方法优选采用热激法进行。所述测序委托南京诺唯赞生物科技集团完成。
[0045] 本发明提供了所述杜梨转录因子PbrWRKY40、所述编码基因、所述引物对或所述重组载体在植物抗盐胁迫中的应用。本发明还提供了所述杜梨转录因子PbrWRKY40、所述编码
基因、所述引物对或所述重组载体在抗盐转基因植物中的应用。
基因、所述引物对或所述重组载体在抗盐转基因植物中的应用。
[0046] 在本发明中，所述抗盐转基因植物的构建方法，优选采用农杆菌介导的遗传转化方法进行。具体为将上述制备的重组载体转入农杆菌感受态细胞中，得到重组农杆菌；将所
述重组农杆菌转化植物，阳性植株筛选，得到抗盐转基因植物。
述重组农杆菌转化植物，阳性植株筛选，得到抗盐转基因植物。
[0047] 在本发明中，所述植物优选包括拟南芥或者杜梨，更优选为杜梨。所述植物耐盐的盐浓度优选为不高于1000mmol/L，更优选为10～800mmol/L，进一步优选为50～500mmol/L，
+ +
再进一步优选为100～250mmol/L。所述植物耐盐的盐优选包括Na或K。所述植物优选包括
拟南芥或梨，更优选为杜梨。
+ +
再进一步优选为100～250mmol/L。所述植物耐盐的盐优选包括Na或K。所述植物优选包括
拟南芥或梨，更优选为杜梨。
[0048] 在本发明中，所述阳性转基因植株的筛选方法优选采用PCR扩增的方法进行。所述筛选时，PCR扩增用引物的正向引物具有如序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；所述
PCR扩增用引物反向引物具有如序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。所述PCR扩增的
反应程序见表1。
PCR扩增用引物反向引物具有如序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。所述PCR扩增的
反应程序见表1。
[0049] 表1PCR扩增的反应程序
[0050]
[0051] 所述PCR扩增的反应体系见表2。
[0052] 表2PCR扩增的反应体系
[0053]
[0054]
[0055] 所述PCR扩增结束后，如果待检测植株系能扩增出预期大小的片段(963bp)，这表明它们为阳性转基因株系。
[0056] 为了验证所述转录因子PbrWRKY40的功能，本发明还构建了阳性基因沉默植株。所述阳性基因沉默植株的构建方法，优选包括构建阳性基因沉默载体，由农杆菌介导转入植
株中，筛选，得到阳性基因沉默植株。
株中，筛选，得到阳性基因沉默植株。
[0057] 在本发明中，所述阳性基因沉默载体优选为病毒沉默载体。所述病毒沉默载体的构建方法优选为用Xba I和Sma I对病毒沉默载体pTRV2进行双酶切；
[0058] 设计上、下游引物(SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)，并对转录因子PbrWRKY40的编码基因进行扩增，得到扩增产物；
[0059] 将所述扩增产物进行双酶切后，插入至所述载体pTRV2上，得到重组载体pTRV2‑PbrWRKY40。将pTRV2‑PbrWRKY40转入农杆菌GV3101感受态中，得到含病毒沉默载体的农杆
菌。本发明对所述农杆菌介导的方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的农杆菌介导方法
即可。
菌。本发明对所述农杆菌介导的方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的农杆菌介导方法
即可。
[0060] 在本发明中，所述阳性基因沉默植株的筛选方法优选采用qRT‑PCR检验其基因表达量的方法进行。所述筛选时，qRT‑PCR所用引物的正向引物具有如序列表中SEQ ID NO：5
所示的核苷酸序列；所述PCR扩增用引物反向引物具有如序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷
酸序列；内参Tublin的扩增用引物具有如列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸
序列，所述实时定量PCR反应程序见表3。
所示的核苷酸序列；所述PCR扩增用引物反向引物具有如序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷
酸序列；内参Tublin的扩增用引物具有如列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸
序列，所述实时定量PCR反应程序见表3。
[0061] 表3实时定量PCR反应程序
[0062]
[0063] 所述实时定量PCR反应体系见表4。
[0064] 表4实时定量PCR反应体系
[0065]反应组分 用量(μl)
模板cDNA 0.1
正向引物 0.2
反向引物 0.2
2×SYBR荧光引物 5
无核酶水 4.5
模板cDNA 0.1
正向引物 0.2
反向引物 0.2
2×SYBR荧光引物 5
无核酶水 4.5
[0066] 所述实时定量PCR扩增结束后，如果待检测植株系扩增出的基因表达量显著低于野生型植株中该基因的表达量，这表明它们为阳性沉默株系。
[0067] 在本发明中，将得到的阳性转基因株系和基因沉默株系进行盐处理，测定处理后得到的阳性转基因株系和基因沉默株系的表型、生理指标和总酸含量，以验证其耐盐和提
高总酸含量的功能。所述总酸含量采用滴定法测定，准确称取野生型和阳性苗叶片各2g，洗
净吸干后加入适量去离子水研磨，将得到的匀浆过滤，滤液用去离子水定容至100mL即为待
测样品，取25mL待测样品用0.1mol/L NaOH滴定，记录用量并计算植物总酸含量。
高总酸含量的功能。所述总酸含量采用滴定法测定，准确称取野生型和阳性苗叶片各2g，洗
净吸干后加入适量去离子水研磨，将得到的匀浆过滤，滤液用去离子水定容至100mL即为待
测样品，取25mL待测样品用0.1mol/L NaOH滴定，记录用量并计算植物总酸含量。
[0068] 在本发明中，所述活性氧的测定方法优选为用DAB和NBT组织化学染色法对植株叶‑
片H2O2和O2积累情况进行分析(根据染色的深浅及程度)，用肉眼观察并拍照。测定的活性
‑
氧包括分别过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2)。通过测定阳性转基因株系和野生型拟南芥
植株活性氧含量变化发现：在盐胁迫7天之后，用DAB染色的叶片，野生株系型出现深褐色且
染色叶面积明显比转基因株系要大，用NBT染色的叶片，野生型株系比转基因株系的蓝色更
‑
深，面积更大，这表明，阳性转基因株系在盐胁迫下较野生型有更低的ROS(H2O2和O2)积累，
从而保证细胞损伤更小。通过测定阳性基因沉默株系和野生型杜梨幼苗活性氧含量变化发
现：盐胁迫7天之后，用DAB和NBT染色的叶片，基因沉默株系被染色的叶面积和颜色深度都
‑
明显大于野生型杜梨幼苗，表明PbrWRKY40编码的基因沉默导致植物细胞中ROS(H2O2和O2)
的过度积累，对细胞膜造成更严重的损伤，植物耐盐能力下降。
片H2O2和O2积累情况进行分析(根据染色的深浅及程度)，用肉眼观察并拍照。测定的活性
‑
氧包括分别过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2)。通过测定阳性转基因株系和野生型拟南芥
植株活性氧含量变化发现：在盐胁迫7天之后，用DAB染色的叶片，野生株系型出现深褐色且
染色叶面积明显比转基因株系要大，用NBT染色的叶片，野生型株系比转基因株系的蓝色更
‑
深，面积更大，这表明，阳性转基因株系在盐胁迫下较野生型有更低的ROS(H2O2和O2)积累，
从而保证细胞损伤更小。通过测定阳性基因沉默株系和野生型杜梨幼苗活性氧含量变化发
现：盐胁迫7天之后，用DAB和NBT染色的叶片，基因沉默株系被染色的叶面积和颜色深度都
‑
明显大于野生型杜梨幼苗，表明PbrWRKY40编码的基因沉默导致植物细胞中ROS(H2O2和O2)
的过度积累，对细胞膜造成更严重的损伤，植物耐盐能力下降。
[0069] 分析电导率和叶绿素的测定结果发现：阳性转基因植株苗的电导率较野生型(WT)显著降低，叶绿素含量较野生型显著升高，且种子萌发率比野生型提高了2倍，根生长量比
野生型增加了60％左右，表明阳性转基因植株苗比野生型有更强的抗盐能力。与转基因植
株相反，基因沉默阳性苗的电导率较野生型(WT)显著升高，叶绿素含量较野生型有明显的
下降，表明因沉默阳性苗的抗盐能力比野生型更弱。
野生型增加了60％左右，表明阳性转基因植株苗比野生型有更强的抗盐能力。与转基因植
株相反，基因沉默阳性苗的电导率较野生型(WT)显著升高，叶绿素含量较野生型有明显的
下降，表明因沉默阳性苗的抗盐能力比野生型更弱。
[0070] 在本发明中，电导率测定和叶绿素的提取和测定方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取和测定方法即可。
[0071] 基于PbrWRKY40基因增强转基因植株的总酸含量，因此本发明提供了所述杜梨转录因子PbrWRKY40、所述编码基因、所述引物对或所述重组载体在在提高植物总酸含量中的
应用。
应用。
[0072] 本发明提供了所述杜梨转录因子PbrWRKY40、所述编码基因、所述引物对或所述重组载体在抗盐植物选育中的应用。
[0073] 在本发明中，所述抗盐优选包括Na+和K+。所述抗盐中盐的浓度优选不高于1000mmol/L，更优选为10～800mmol/L，进一步优选为50～500mmol/L，再进一步优选为100
～250mmol/L。所述植物优选包括拟南芥或者杜梨，更优选为杜梨。
～250mmol/L。所述植物优选包括拟南芥或者杜梨，更优选为杜梨。
[0074] 在本发明中，所述抗盐植物选育的方法，优选对每代得到的子代采用qPCR的方法检测转录因子PbrWRKY40的表达，选择高表达或超标达的子代用于后续筛选。
[0075] 下面结合实施例对本发明提供的杜梨转录因子PbrWRKY40及其在提高植物总酸含量和抗盐遗传改良中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的
限定。
限定。
[0076] 实施例1
[0077] PbrWRKY40基因克隆及超表达载体构建
[0078] 1、RNA提取
[0079] 研究材料杜梨种植在南京农业大学梨工程中心，其苗龄为60d。挑选生长势健壮的杜梨幼苗，随机称取0.1g样品，迅速用液氮进行速冻。RNA的提取采用索来宝公司的总RNA提
取试剂盒，具体方法如下：
取试剂盒，具体方法如下：
[0080] (1)样品处理：取新鲜或‑80℃冻存0.1g组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀，得到匀浆样品；
[0081] (2)将处理后的样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
[0082] (3)向室温放置后的匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3到5min，得到混悬液；
[0083] (4)将混悬液在4℃、12000rpm的条件下离心10min，RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀，得到上清液；
[0084] (5)吸附柱前处理：在吸附柱中加入500μL洗柱液，室温放置2min，2到8℃，12000rpm离心2min，弃废液；
[0085] (6)第(4)步收集的上清液中加入200μL无水乙醇混匀，加入吸附柱并静置2min，在12000rpm下离心2min，弃废液；
[0086] (7)向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，在12000rpm下离心2min，弃废液；
[0087] (8)向吸附柱中加入600μL漂洗液，2到8℃，12000rpm离心2min，弃废液；
[0088] (9)12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数min将吸附柱中残余的漂洗液去除；
[0089] (10)将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50～100μL的RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到杜梨RNA。
[0090] 将提取到的杜梨RNA立即于‑80℃超低温冰箱中保存以备用。取1～2μL杜梨RNA用于琼脂糖凝胶电泳，用Nano‑drop仪进行检测，检测其浓度为300ng/μL。
[0091] 2、基因扩增
[0092] 取1μg杜梨RNA经1U的DNase I 37℃处理30min后立即放入冰上，加入1μL 50mM EDTA，65℃水浴10min后立即置于冰上。cDNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒操作手
册进行，将提取得到的杜梨RNA反转录为cDNA。所得的第一链cDNA用于PbrWRKY40基因的扩
增。
册进行，将提取得到的杜梨RNA反转录为cDNA。所得的第一链cDNA用于PbrWRKY40基因的扩
增。
[0093] 所述PCR扩增体系为：1μL模板cDNA、5μL PCR buffer、1μL dNTD Mix(10mmol/L)、正向引物和反向引物各1μL、0.5μL Taq DNA聚合酶(5U)和10.5μL无核酶水。
[0094] PCR按以下程序完成：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火6s，72℃延伸6s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。
[0095] 3、超表达载体构建
[0096] 凝胶回收选用AxyPrep DNA试剂盒对扩增产物进行回收。然后把纯化的DNA片段和中间载体(pEASY)进行连接，采用热激法将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α中，采用北
京全式金生物技术有限公司生产的中间载体(pEASY)和大肠感受态，以目的基因序列引物
进行PCR验证并测序(由南京诺唯赞生物科技集团完成)。超表达载体双酶切体系见表5，连
接体系见表6，流程图如图1。
京全式金生物技术有限公司生产的中间载体(pEASY)和大肠感受态，以目的基因序列引物
进行PCR验证并测序(由南京诺唯赞生物科技集团完成)。超表达载体双酶切体系见表5，连
接体系见表6，流程图如图1。
[0097] 表5双酶切体系
[0098]
[0099] 表6连接体系
[0100]
[0101] 将测序结果正确的大肠杆菌，用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen，USA)盒提取质粒，质粒命名为PMV‑PbrWRKY40。将构建好的测序正确的PMV‑PbrWRKY40重组载体采用
冻融法转入农杆菌感受态细胞(GV3101)备用。
冻融法转入农杆菌感受态细胞(GV3101)备用。
[0102] 实施例2
[0103] 转录因子PbrWRKY40的编码基因的亚细胞定位
[0104] 根据转录因子PbrWRKY40的编码基因的核苷酸序列和pJIT166‑GFP载体图，在基因序列前后分别加入Xba I和BamHI酶切位点。将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模
板，用加入酶切位点的引物(SEQ ID NO：9，ATGGACTACTCAGCTGCATATGATG和SEQ ID NO：10，
ATAAGTATTATGTTGAAGTATTCTTCCTGATATG)扩增，所用PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性
30s，58℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。基因3′去除了终止密码子TAG，
目的是让基因与GFP融合。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条
带。用XbaI和BamHI限制性内切酶对pJIT166‑GFP载体质粒进行酶切，37℃酶切4小时后纯化
回收。酶切过后的pJIT166‑GFP载体与凝胶回收PbrWRKY40片段经重组连接酶连接，在37℃
下连接30min，转化至大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性
的菌液送至公司测序，提取测序结果正确菌液的质粒，将得到的重组载体命名为GFP‑
PbrWRKY40。
板，用加入酶切位点的引物(SEQ ID NO：9，ATGGACTACTCAGCTGCATATGATG和SEQ ID NO：10，
ATAAGTATTATGTTGAAGTATTCTTCCTGATATG)扩增，所用PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性
30s，58℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。基因3′去除了终止密码子TAG，
目的是让基因与GFP融合。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条
带。用XbaI和BamHI限制性内切酶对pJIT166‑GFP载体质粒进行酶切，37℃酶切4小时后纯化
回收。酶切过后的pJIT166‑GFP载体与凝胶回收PbrWRKY40片段经重组连接酶连接，在37℃
下连接30min，转化至大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性
的菌液送至公司测序，提取测序结果正确菌液的质粒，将得到的重组载体命名为GFP‑
PbrWRKY40。
[0105] 农杆菌介导烟草瞬时转化：重组的GFP‑PbrWRKY40载体质粒转化至含农杆菌感受态GV3101中，将活化的含重组质粒的农杆菌在含505mg/mL卡娜和50mg/mL利福平的LB液体
培养基，250rpm、28℃恒温摇床中扩繁。6000rpm离心10min，并用侵染液(100mL：10mL 100mM
MgCl2，10mL 100mM MES，75μL 200mM AS，ddH2O 80mL)重悬至OD600为0.8。室温孵育3～4h侵
染洋葱内表皮细胞，将侵染后的洋葱表皮细胞置于MS培养基上避光培养48～72h，培养完成
后用细胞核DAPI染色，用于标记细胞核，并制片。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss
LSM 780)拍照。
培养基，250rpm、28℃恒温摇床中扩繁。6000rpm离心10min，并用侵染液(100mL：10mL 100mM
MgCl2，10mL 100mM MES，75μL 200mM AS，ddH2O 80mL)重悬至OD600为0.8。室温孵育3～4h侵
染洋葱内表皮细胞，将侵染后的洋葱表皮细胞置于MS培养基上避光培养48～72h，培养完成
后用细胞核DAPI染色，用于标记细胞核，并制片。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss
LSM 780)拍照。
[0106] 结果见图2。图2是转录因子PbrWRKY40的编码基因亚细胞定位，其中图2‑A，GFP基因(对照)分别在明场、GFP场、DAPI场以及三者叠加场的成像；图2‑B为PbrWRKY40基因分别
在明场、GFP场、DAPI场以及三者叠加场的成像。根据细胞定位图能够得到PbrWRKY40定位在
细胞核部位。
在明场、GFP场、DAPI场以及三者叠加场的成像。根据细胞定位图能够得到PbrWRKY40定位在
细胞核部位。
[0107] 实施例3
[0108] 拟南芥的遗传转化
[0109] 1.植物转化载体构建
[0110] 根据PCMBIA1300载体的多克隆位点和PbrWRKY40基因的编码区序列，加入酶切位点Xba I和BamHI，按照引物设计一般原则用primerprimier 5.0软件设计出上、下游PCR引
物(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)。以PbrWRKY40基因的克隆子为模板用所述PCR引物进行
PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃，PCR反应体系及扩增程序与PbrWRKY40基因克隆相同。
在扩增过后进行胶纯化回收。PCMBIA1300载体双酶切反应体积为40μl，其中：有PCMBIA1300
的载体质粒10μl，10×M缓冲液4μl，Xba I及BamHI各1μl，加双蒸水24μl。放置于37℃酶切3
～4h后纯化回收。在连接反应体系中加入PbrWRKY40基因与载体PCMBIA1300的摩尔比为2:
1，反应总体积为10μl。其中含有：10×buffer 1μl，DNA重组酶1μl，双酶切回收的PbrWRKY40
基因4μl，双酶切回收的PCMBIA1300载体产物2μl，双蒸水2μl，在37℃反应30min得到连接产
物。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素的LB固体平板中培养16h。将筛
选出的阳性克隆挑点后摇菌，抽提质粒进行PCR鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有
插入目的片段的重组克隆，将其命名为p1300‑PbrWRKY40重组载体，应用冻融法将重组载体
p1300‑PbrWRKY40导入到农杆菌GV3101中。
物(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)。以PbrWRKY40基因的克隆子为模板用所述PCR引物进行
PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃，PCR反应体系及扩增程序与PbrWRKY40基因克隆相同。
在扩增过后进行胶纯化回收。PCMBIA1300载体双酶切反应体积为40μl，其中：有PCMBIA1300
的载体质粒10μl，10×M缓冲液4μl，Xba I及BamHI各1μl，加双蒸水24μl。放置于37℃酶切3
～4h后纯化回收。在连接反应体系中加入PbrWRKY40基因与载体PCMBIA1300的摩尔比为2:
1，反应总体积为10μl。其中含有：10×buffer 1μl，DNA重组酶1μl，双酶切回收的PbrWRKY40
基因4μl，双酶切回收的PCMBIA1300载体产物2μl，双蒸水2μl，在37℃反应30min得到连接产
物。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素的LB固体平板中培养16h。将筛
选出的阳性克隆挑点后摇菌，抽提质粒进行PCR鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有
插入目的片段的重组克隆，将其命名为p1300‑PbrWRKY40重组载体，应用冻融法将重组载体
p1300‑PbrWRKY40导入到农杆菌GV3101中。
[0111] 2.农杆菌介导的拟南芥遗传转化步骤如下：
[0112] (1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB的平板上划线，置于28℃培养箱培养36～48小时，刮取划线菌
斑，加入液体MS(2.37g/LMS+50g/L蔗糖+0.1mg/L IBA，pH＝5.8)培养基中，28℃转30min振
荡培养，菌液浓度达到OD600nm＝0.8～1.0时加入表面活性剂silwet77200μl/L作浸染。
斑，加入液体MS(2.37g/LMS+50g/L蔗糖+0.1mg/L IBA，pH＝5.8)培养基中，28℃转30min振
荡培养，菌液浓度达到OD600nm＝0.8～1.0时加入表面活性剂silwet77200μl/L作浸染。
[0113] (2)浸染：取茎高约为10cm的野生型拟南芥植株，去除全部种荚，倒置于含有制备好的根癌农杆菌菌液的玻璃瓶中，抽真空，维持0.05Mpa压力5min，避光侧放24小时。
[0114] (3)培养：按常规方法培育植株至结实，收获成熟种子(T0代)。
[0115] 3.转基因阳性苗的的筛选
[0116] 按照上述方法得到转PbrWRKY40基因拟南芥T0代种子，将T0代种子表面灭菌，均匀的散布于含50mg/L潮霉素和50mg/L特美汀的MS选择培养基上，置于22℃光照16h/d培养，生
长一周后挑选生长快根长较长的植株，移栽至灭菌的营养土中，生长一段时间。
长一周后挑选生长快根长较长的植株，移栽至灭菌的营养土中，生长一段时间。
[0117] 3.1转基因拟南芥DNA提取
[0118] 按照上述方法得到转PbrWRKY40基因拟南芥，把每株拟南芥提取DNA，设计基因内引物进行PCR扩增鉴定阳性苗。
[0119] (1)取适量拟南芥叶片用液氮研磨至粉末状，然后加入500μl 65℃预热的CTAB(100mmol/L Tris‑HCl pH值为8.0，1.5mmol/LNaCl，50mmol/L EDTA pH＝8.0，2％w/v
CTAB，65℃水浴充分溶解备用)和10μlβ‑巯基乙醇，混匀。
CTAB，65℃水浴充分溶解备用)和10μlβ‑巯基乙醇，混匀。
[0120] (2)在65℃水浴锅中加热30min，每隔10min取出上下轻轻颠倒混匀；10000g常温离心10min；取上清，加500μl氯仿异戊醇(氯仿：异戊醇体积比为24：1)，颠倒混匀；
[0121] (3)10000g离心10min，取上清液450μl至新的1.5ml离心管，加入450μl异丙醇，上下颠倒混匀。
[0122] (4)10000g，离心10min，弃去上清，用1mL 75％的乙醇漂洗2次，10000g，离心10min，将乙醇彻底去除，放在超净工作台通风干燥，直至DNA呈无色透明状
[0123] (5)加入50μl超纯水，放置于65℃培养箱中溶解40min，做胶检测。
[0124] 3.2阳性转基因植株检测
[0125] 采用引物基因特异引物进行PCR扩增。反应程序及体系分别见表1、表2。采用基因上游引物和载体下游引物(SEQ ID NO.11，ATGGACTACTCAGCTGCATATGATG和SEQ ID NO.12，
ATAAGTATTATGTTGAAGTATTCTTCCTGATATG)进行PCR扩增(反应程序见表1，反应体系见表2)，
在选取的转基因株系中能扩增出预期大小的片段的，表明它们为阳性转基因株系。
ATAAGTATTATGTTGAAGTATTCTTCCTGATATG)进行PCR扩增(反应程序见表1，反应体系见表2)，
在选取的转基因株系中能扩增出预期大小的片段的，表明它们为阳性转基因株系。
[0126] 通过农杆菌介导在拟南芥中表达PbrWRKY40基因。通过分子遗传分析，鉴定得到了单拷贝纯合插入、从T1～T2代均稳定表达PbrWRKY40的转基因拟南芥，因此表型性状能够稳
定遗传。插入位点分析证明分别转PbrWRKY40转基因材料的表型变化不是由转基因操作影
响其他基因而引起的。因此该转基因材料为本项目的研究提供了材料保障。利用PCR鉴定T0
代转基因植物如图3‑A所示，利用RT‑PCR鉴定T1代转基因植物，结果如图3‑B所示，鉴定结果
表明OE‑26、OE‑38和OE‑39为三个超表达系。
定遗传。插入位点分析证明分别转PbrWRKY40转基因材料的表型变化不是由转基因操作影
响其他基因而引起的。因此该转基因材料为本项目的研究提供了材料保障。利用PCR鉴定T0
代转基因植物如图3‑A所示，利用RT‑PCR鉴定T1代转基因植物，结果如图3‑B所示，鉴定结果
表明OE‑26、OE‑38和OE‑39为三个超表达系。
[0127] 实施例4
[0128] 杜梨幼苗的瞬时转化
[0129] 1.病毒诱导基因沉默载体构建
[0130] 按照实施例4的方法构建病毒沉默载体。病毒沉默载体pTRV2双酶切位点为Xba I和Sma I，按照引物设计一般原则用primer primier5.0软件设计上、下游引物(SEQ ID
NO.13，CACAACCACCCCAACCCTT和SEQ ID NO.14，ATAAGTATTATGTTGAAGTATTCTTCCTGATATG)将
PbrWRKY40基因扩增并插入至该载体上的两个酶切位点中间，得到重组载体pTRV2‑
PbrWRKY40，并转入农杆菌GV3101感受态中。
NO.13，CACAACCACCCCAACCCTT和SEQ ID NO.14，ATAAGTATTATGTTGAAGTATTCTTCCTGATATG)将
PbrWRKY40基因扩增并插入至该载体上的两个酶切位点中间，得到重组载体pTRV2‑
PbrWRKY40，并转入农杆菌GV3101感受态中。
[0131] 2.病毒诱导杜梨幼苗基因沉默
[0132] (1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB液体培养基中28℃，220rpm振荡培养12h。将培养后的菌液
6000g离心10min收集菌体，用侵染液(成分为10mM MgCl2、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH
值5.6)重悬沉淀，至浓度达到OD600nm＝0.8‑1.0；
6000g离心10min收集菌体，用侵染液(成分为10mM MgCl2、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH
值5.6)重悬沉淀，至浓度达到OD600nm＝0.8‑1.0；
[0133] (2)菌液诱导：将调好OD600nm值的菌液放在黑暗、转速100rpm条件下，常温诱导4h；
[0134] (3)梨苗注射：pTRV1和pTRV2菌液按照1:1比例混合作为对照组，pTRV1和pTRV2‑PbrWRKY40菌液按照1:1比例混合作为实验组，分别注射苗龄45天，生长状况一致且健壮的
杜梨实生苗幼苗。
杜梨实生苗幼苗。
[0135] 3.病毒诱导基因沉默抑制阳性苗鉴定
[0136] 将注射完成后的梨苗在常温下黑暗处理12h，然后恢复正常培养5天，每个株系独立取样，提取对照组和实验组梨苗样品RNA，通过跑胶检测其结构完整，利用Nanodrop测定
其浓度后(浓度均在200～1000ng/μl)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，再用梨
的Tublin作为内参进行扩增。Tublin引物核苷酸序列为：
其浓度后(浓度均在200～1000ng/μl)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，再用梨
的Tublin作为内参进行扩增。Tublin引物核苷酸序列为：
[0137] Tublin正向引物：5’‑TGGGCTTTGCTCCTCTTAC‑3’(SEQ ID NO.7)
[0138] Tublin反向引物：5’‑CCTTCGTGCTCATCTTACC‑3’(SEQ ID NO.8)
[0139] 用Tublin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，然后用PbrWRKY40特异引物和梨内参引物Tublin进行qRT‑PCR检测(反应程序见表3，反应体系见表
4)，分析待检测株系的表达量，用于PbrWRKY40基因的特异扩增引物核苷酸序列为：
4)，分析待检测株系的表达量，用于PbrWRKY40基因的特异扩增引物核苷酸序列为：
[0140] 正向引物：5’‑AAGAGAGCGGTGCCCTATTG‑3’(SEQ ID NO.5)；
[0141] 反向引物：5’‑CTCCGGGTTCTTGCTCATGT‑3’(SEQ ID NO.6)。根据PbrWRKY40基因的表达量，选择表达量较低的三个植株作为病毒沉默阳性株系，命名为pTRV‑1，pTRV‑2，pTRV‑
3。
3。
[0142] 结果见图8所示。图8‑E是利用基因特异引物和内参引物Tublin进行qRT‑PCR检测基因沉默阳性植株的基因表达量。图8表明病毒沉默杜梨幼苗阳性株系的PbrWRKY40基因被
沉默。
沉默。
[0143] 实施例5
[0144] PbrWRKY40转基因抗性植株抗性鉴定
[0145] 1.转基因拟南芥植株的抗盐分析
[0146] 为了鉴定PbrWRKY40转基因拟南芥是否和抗盐胁迫有关，将对照系和转基因系进行短时间的盐胁迫和长期的盐逆境处理。同一批次收到的PbrWRKY40转基因系(OE26、OE38、
OE39)拟南芥种子和野生型(WT)种子灭菌处理后分别播于MS筛选培养基和常用的MS无抗培
养基上，等发芽后约3天将其移栽到土里进行培养。取不同苗龄的转基因植株进行不同浓度
的盐(100mM、125mM、150mM)处理，观察其处理后的表型，统计发芽率，测定电导率及叶绿素、
根长等。
OE39)拟南芥种子和野生型(WT)种子灭菌处理后分别播于MS筛选培养基和常用的MS无抗培
养基上，等发芽后约3天将其移栽到土里进行培养。取不同苗龄的转基因植株进行不同浓度
的盐(100mM、125mM、150mM)处理，观察其处理后的表型，统计发芽率，测定电导率及叶绿素、
根长等。
[0147] 图4‑A是拟南芥种子在100mM MS培养基上生长6天的发芽率情况以及发芽率统计结果；图4‑B是拟南芥种子在125Mm MS培养基上生长6天的发芽率情况以及发芽率统计结
果；图5‑A是苗龄7天的拟南芥植株在125mM MS培养基上处理5天的根长情况以及根长统计
结果；图5‑B是苗龄7天的拟南芥植株在150mM MS培养基上处理5天的根长情况以及根长统
计结果；图6为转PbrWRKY40的编码基因株系及野生型(WT)氯化钠处理前后的表型和生理指
标测定，其中图6‑A是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天前的表型以及荧光叶
绿素拍照；图6‑B是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的表型已经荧光叶绿
素拍照；图6‑C是苗龄7天的拟南芥植株在是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15
天后的Fv/Fm；图6‑D是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的电导率值；图6‑
E是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的叶绿素提取；图6‑F是苗龄20天的
拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的叶绿素含量；图6‑G是苗龄20天的拟南芥植株在
150mM氯化钠处理15天后的MDA含量；图6‑H是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15
天后的总酸含量；图6‑I是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钠离子含
量；图6‑J是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钾离子含量；图6‑K是苗龄
20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钠钾比；上述指标的测定均为评价其抗盐
性的重要衡量指标，图6中能够得到PbrWRKY40基因增强了转基因植株的抗盐性和总酸含
量。
果；图5‑A是苗龄7天的拟南芥植株在125mM MS培养基上处理5天的根长情况以及根长统计
结果；图5‑B是苗龄7天的拟南芥植株在150mM MS培养基上处理5天的根长情况以及根长统
计结果；图6为转PbrWRKY40的编码基因株系及野生型(WT)氯化钠处理前后的表型和生理指
标测定，其中图6‑A是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天前的表型以及荧光叶
绿素拍照；图6‑B是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的表型已经荧光叶绿
素拍照；图6‑C是苗龄7天的拟南芥植株在是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15
天后的Fv/Fm；图6‑D是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的电导率值；图6‑
E是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的叶绿素提取；图6‑F是苗龄20天的
拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的叶绿素含量；图6‑G是苗龄20天的拟南芥植株在
150mM氯化钠处理15天后的MDA含量；图6‑H是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15
天后的总酸含量；图6‑I是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钠离子含
量；图6‑J是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钾离子含量；图6‑K是苗龄
20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钠钾比；上述指标的测定均为评价其抗盐
性的重要衡量指标，图6中能够得到PbrWRKY40基因增强了转基因植株的抗盐性和总酸含
量。
[0148] 2.组织化学染色分析H2O2和O2‑积累
[0149] 在转基因株系中，电导率较低表明他们可能具有比WT有更强的抗ROS的能力。那么通过鉴定植株中ROS的积累量便成为必要。用DAB和NBT组织化学染色法对植株叶片进行染
‑
色，分别用来检测过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子(O2)的含量。
‑
色，分别用来检测过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子(O2)的含量。
[0150] 结果如图7所示。图7为PbrWRKY40的编码基因拟南芥组织化学染色分析H2O2和O2‑积累，图7‑A和图7‑B是苗龄20天的拟南芥植株在200mM氯化钠处理7天后未转化植株和三个
转基因株系活性氧组织化学染色采用硝基四氮唑(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)分别对H2O2
‑
(图7‑A)和O2(图7‑B)进行染色；图7‑C和图7‑D是苗龄7天的拟南芥植株在含有100mM氯化钠
的MS基本培养基上处理3天后未转化植株和三个转基因株系分别用硝基四氮唑(NBT)和二
‑
氨基联苯胺(DAB)对H2O2(图7‑C)和O2 (图7‑D)进行染色。图7‑E是苗龄20天的拟南芥植株在
150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系过氧化氢含量测定；图7‑F是苗龄20
天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系抗超氧阴离子含
量测定结果。
转基因株系活性氧组织化学染色采用硝基四氮唑(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)分别对H2O2
‑
(图7‑A)和O2(图7‑B)进行染色；图7‑C和图7‑D是苗龄7天的拟南芥植株在含有100mM氯化钠
的MS基本培养基上处理3天后未转化植株和三个转基因株系分别用硝基四氮唑(NBT)和二
‑
氨基联苯胺(DAB)对H2O2(图7‑C)和O2 (图7‑D)进行染色。图7‑E是苗龄20天的拟南芥植株在
150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系过氧化氢含量测定；图7‑F是苗龄20
天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理14天后野生型植株和三个转基因株系抗超氧阴离子含
量测定结果。
[0151] 如图7‑A和图7‑B为盐胁迫7天之后，用DAB染色的叶片，野生株系型出现褐色的叶面积明显比转基因株系要大，且颜色更深，用NBT染色的叶片，野生型株系比转基因株系的
蓝色更深，面积更大；图7‑C和图7‑D表明苗龄7天的拟南芥组培苗在胁迫3天后野生型植株
的DAB和DBT染色面积和颜色深度都明显大于转基因系植株，转基因株系在盐胁迫下较野生
‑ ‑
型有更低的ROS(H2O2和O2)积累。同时转基因植株中的过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子(O2)的
含量活性均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。
蓝色更深，面积更大；图7‑C和图7‑D表明苗龄7天的拟南芥组培苗在胁迫3天后野生型植株
的DAB和DBT染色面积和颜色深度都明显大于转基因系植株，转基因株系在盐胁迫下较野生
‑ ‑
型有更低的ROS(H2O2和O2)积累。同时转基因植株中的过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子(O2)的
含量活性均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。
[0152] 3.植物细胞中Na+和K+含量测定
[0153] 植物在发生盐胁迫时，易因渗透势差而导致细胞失水。为了使细胞能从外界高盐+
环境中正常吸水，降低细胞渗透势维持细内的离子平衡，Na将进行逆浓度梯度运输，被外
+ +
排或者区隔化到液泡中。除此之外K区隔化到液泡中，使细胞质中产生K降低的信号，从而
+ + +
激活质膜上高亲和K 的转运体。被激活的高亲和性K转运体可以特异性地从低K 环境将更
+ + +
多的K转运至细胞内，从而维持细胞内稳定的Na/H ，避免水分胁迫。因此在转基因株系中，
+ +
Na含量较低和K含量较高表明他们可能具有比WT有更强的抗盐能力。
环境中正常吸水，降低细胞渗透势维持细内的离子平衡，Na将进行逆浓度梯度运输，被外
+ +
排或者区隔化到液泡中。除此之外K区隔化到液泡中，使细胞质中产生K降低的信号，从而
+ + +
激活质膜上高亲和K 的转运体。被激活的高亲和性K转运体可以特异性地从低K 环境将更
+ + +
多的K转运至细胞内，从而维持细胞内稳定的Na/H ，避免水分胁迫。因此在转基因株系中，
+ +
Na含量较低和K含量较高表明他们可能具有比WT有更强的抗盐能力。
[0154] Na+和K+含量测定的步骤如下：将处理过后的野生型植株和转基因植株去除地下部分，地上部分将样品置于烘箱中105℃杀青30分钟，使各个组织部位的酶失活，防止离子移
动。杀青结束后将样品置于65℃烘箱中烘干至恒重，一般烘3～4天即可。烘干后的样品研磨
至粉末状，称取0.05g样品于15ml离心管，加入2ml 0.5mol/l的HCl溶液浸提3天，然后吸出
1ml HCl再加入5ml去离子水浸提一昼夜，浸提结束后吸取1ml浸提液加入去离子水定容至
+ +
10ml待用。配制Na、K标样制作标准曲线，所用试剂为NaCl和KCl，标样浓度按需求在0～100
+ + + +
μg/ml之间配制。将上述浸提液和Na 、K标样用火焰光度计进行测定。样品中Na或K含量(μ
g/g)＝ρ*稀释倍数*总体积/测量所取的样品干重。
动。杀青结束后将样品置于65℃烘箱中烘干至恒重，一般烘3～4天即可。烘干后的样品研磨
至粉末状，称取0.05g样品于15ml离心管，加入2ml 0.5mol/l的HCl溶液浸提3天，然后吸出
1ml HCl再加入5ml去离子水浸提一昼夜，浸提结束后吸取1ml浸提液加入去离子水定容至
+ +
10ml待用。配制Na、K标样制作标准曲线，所用试剂为NaCl和KCl，标样浓度按需求在0～100
+ + + +
μg/ml之间配制。将上述浸提液和Na 、K标样用火焰光度计进行测定。样品中Na或K含量(μ
g/g)＝ρ*稀释倍数*总体积/测量所取的样品干重。
[0155] 结果如图6所示。图6‑I是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钠离子含量；图6‑J是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钾离子含量；图6‑K
是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钠钾比。
是苗龄20天的拟南芥植株在150mM氯化钠处理15天后的钠钾比。
[0156] 综合结果表明，超表达PbrWRKY40拟南芥植株细胞吸钠排钾能力高于野生型拟南芥。
[0157] 实施例6
[0158] PbrWRKY40病毒沉默植株抗性鉴定
[0159] 病毒沉默杜梨幼苗的抗盐分析
[0160] 为了鉴定转录因子PbrWRKY40的编码基因是否与植物耐盐性有密切联系，将野生型和病毒沉默阳性杜梨幼苗一定时间盐逆境处理。将苗龄一致生长状况良好野生型和病毒
沉默阳性杜梨幼苗(pTRV‑1，pTRV‑2和pTRV‑3)在相同培养条件下用200mM的氯化钠溶液浇
灌20天，观察其处理后的表型，测定电导率、叶绿素等。
沉默阳性杜梨幼苗(pTRV‑1，pTRV‑2和pTRV‑3)在相同培养条件下用200mM的氯化钠溶液浇
灌20天，观察其处理后的表型，测定电导率、叶绿素等。
[0161] 图8为转录因子PbrWRKY40的编码基因沉默株系及野生型(WT)氯化钠处理前后的表型和生理指标测定，其中图8‑A是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天前的表型
以及荧光叶绿素拍照；图8‑B是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的表型已经
荧光叶绿素拍照；图8‑C是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM盐溶液处理20天后的叶绿素提取；
图8‑D是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM盐溶液处理20天后的Fv/Fm；图8‑F是苗龄45天的杜梨
幼苗在250mM氯化钠处理20天前的MDA含量；图8‑G是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处
理20天后的总酸含量；图8‑H是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钠离子含
量；图8‑I是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钾离子含量；图8‑J是苗龄45
天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钠钾比。
以及荧光叶绿素拍照；图8‑B是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的表型已经
荧光叶绿素拍照；图8‑C是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM盐溶液处理20天后的叶绿素提取；
图8‑D是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM盐溶液处理20天后的Fv/Fm；图8‑F是苗龄45天的杜梨
幼苗在250mM氯化钠处理20天前的MDA含量；图8‑G是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处
理20天后的总酸含量；图8‑H是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钠离子含
量；图8‑I是苗龄45天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钾离子含量；图8‑J是苗龄45
天的杜梨幼苗在250mM氯化钠处理20天后的钠钾比。
[0162] 由图8结果显示，PbrWRKY40基因的沉默使杜梨幼苗的耐盐性减弱，阳性苗的电导率较野生型(WT)显著升高，而叶绿素含量较野生型有明显的下降，病毒沉默PbrWRKY40杜梨
植株吸钠排钾能力低于野生植株。
植株吸钠排钾能力低于野生植株。
[0163] 综合上述实施例结果表明，将PbrWRKY40基因转入拟南芥中后鉴定其功能，发现转基因超表达株系与对照野生型相比抗盐能力有了很大提升。在发生盐胁迫时通过叶绿素含
量、电导率、发芽率及根生长情况等指标测定表明转基因拟南芥的生长状态均优于野生型
‑
拟南芥。同时转基因植株中的过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子(O2)的含量活性均要比野生型
+ +
要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。转基因株系中，较低的Na含量和较高的K
含量表明转基因株系能够更好的进行跨膜离子运输，维持细胞内渗透势平衡，防止水分胁
迫和离子积累带来的毒害。与此同时，将杜梨幼苗体内的PbrWRKY40基因沉默后，通过观察
在盐胁迫后野生型和基因沉默杜梨幼苗的表型，以及对它们的叶绿素含量和电导率测定，
ROS染色测定，发现野生型杜梨幼苗的抗盐能力优于沉默的杜梨幼苗，表明PbrWRKY40基因
的沉默使杜梨幼苗的抗盐性减弱。
量、电导率、发芽率及根生长情况等指标测定表明转基因拟南芥的生长状态均优于野生型
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拟南芥。同时转基因植株中的过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子(O2)的含量活性均要比野生型
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要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。转基因株系中，较低的Na含量和较高的K
含量表明转基因株系能够更好的进行跨膜离子运输，维持细胞内渗透势平衡，防止水分胁
迫和离子积累带来的毒害。与此同时，将杜梨幼苗体内的PbrWRKY40基因沉默后，通过观察
在盐胁迫后野生型和基因沉默杜梨幼苗的表型，以及对它们的叶绿素含量和电导率测定，
ROS染色测定，发现野生型杜梨幼苗的抗盐能力优于沉默的杜梨幼苗，表明PbrWRKY40基因
的沉默使杜梨幼苗的抗盐性减弱。
[0164] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。
视为本发明的保护范围。