一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用，所述抗体为人源磷酸化ElF5BT78特异性位点多克隆抗体，所述抗体一方面为检测磷酸化EIF5BT78位点的表达，验证相关分子机制提供了可能，另一方面该抗体与磷酸化真核翻译起始因子5B(p‑EIF5B)蛋白结合，还提供包含这种抗体的组合物，本发明利用现有的磷酸化蛋白抗体技术，构建特异性磷酸化EIF5BT78位点多克隆抗体，解决了现有技术中EIF5B磷酸化抗体种类少，特异性差等特点，为检测磷酸化EIF5BT78位点的表达、验证相关分子机制提供了可能。

权利要求

1.一种磷酸化EIF5B特异性抗体，其特征在于，所述抗体为人源磷酸化ElF5B T78特异性位点多克隆抗体，所述磷酸化EIF5B特异性抗体通过如下方法制备：制备抗原，根据EIF5B的蛋白序列，如SEQ ID NO:3所示，合成20mg多肽1，所述多肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并取10mg所述多肽1偶联血蓝蛋白，制得抗原；

制备抗体，将偶联有血蓝蛋白的多肽1作为抗原进行免疫处理，得到抗体：采用偶联有KLH的多肽1作为抗原免疫2只新西兰大白兔，免疫周期为20天，免疫完后7‑10天取血，总共免疫4‑5次；免疫处理后还包括抗血清效价检测的步骤，分别检测第三次、第四次免疫后的抗血清效价，若抗血清效价大于1：32000，则效价达到要求，若抗血清效价小于1：32000 ，则增加1‑2次免疫；

抗体纯化，判断抗血清效价是否大于1:32000，若是，则收集含抗体血清，采用抗原特异亲和方式纯化，分别采用多肽1和多肽2制作纯化柱进行纯化，得到修饰性抗体以及去除非修饰性抗体，其中，纯化后的抗体效价大于1:64000；所述多肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:

2所示。

2.根据权利要求1所述的磷酸化EIF5B特异性抗体，其特征在于，所述抗血清效价通过间接ELISA方法检测；所述抗体纯化通过抗原特异亲和纯化进行。

说明书

一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 真核翻译起始因子5B(eukaryotic translation initiation factors,eIF5B)又名翻译起始因子IF‑2，位于2号染色体上，其在翻译启动中发挥着重要作用。在P位点与启动
子‑tRNA和密码子配对，启动蛋白质翻译。同时，EIF5B也是特异性mRNA翻译所必需的，有助
于支持或稳定Met‑tRNA结合。早期的研究发现，EIF5B在CSFV(猪瘟病毒)和HCV(丙型肝炎病
毒)依赖于IRES的翻译启动机制中，将Met‑tRNA递送至核糖体的P位点以启动病毒的翻译。

[0003] EIF5B在多种肿瘤中高表达，且在癌症的病理生理学中，尤其是在癌症的增殖转移中起到决定性作用(Ross,J.A.,Dungen,K.V.,Bressler,K.R.et al.Eukaryotic 
initiation factor 5B(eIF5B)provides a critical cell survival switch to 
glioblastoma cells via regulation of apoptosis.Cell Death Dis 10,57(2019).)。
值得关注的是，在最近的研究中，EIF5B被证实在胶质母细胞瘤(GBM)细胞帽依赖性低氧反
应蛋白翻译过程中作为关键分子发挥重要的作用(Ho,J.J.D.et al.Oxygen‑sensitive 
remodeling of central carbon metabolism by archaic eIF5B.Cell Rep.22,17–26
(2018).)。也有研究表明，EIF5B在肝癌细胞中高表达，能够促进ASAP1对肝癌细胞的增殖和
侵袭能力(Wang Zhen‑Guang,Zheng Hao,Gao Wei et al.eIF5B increases ASAP1 
expression to promote HCC proliferation and invasion.Oncotarget,(2016))。目前
在EIF5B和肿瘤相关性的研究中存在如下技术问题：现有EIF5B抗体种类较少、特异性差。

发明内容

[0004] 为此，本发明所要解决的技术问题在于目前EIF5B抗体尤其是EIF5B磷酸化抗体种类少、特异性差的问题从而提出一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

[0006] 本发明第一方面提供一种磷酸化EIF5B特异性抗体，所述抗体为人源磷酸化ElF5B T78特异性位点多克隆抗体。

[0007] 本发明第二方面提供一种制备所述的磷酸化EIF5B特异性抗体的方法，其包括如下步骤：

[0008] 制备抗原，合成多肽1，所述多肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并取部分所述多肽1偶联血蓝蛋白制得抗原；

[0009] 制备抗体，将偶联有血蓝蛋白的多肽1作为抗原进行免疫处理，得到抗体；

[0010] 抗体纯化。

[0011] 作为优选，还包括制备用于抗体纯化的多肽2的步骤，所述多肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0012] 作为优选，所述免疫处理包括至少4次，免疫处理后还包括抗血清效价检测的步骤，分别检测第三次、第四次免疫后的抗血清效价，若抗血清效价大于1：32000，则效价达到
要求，若抗血清效价小于1：32000，则增加1‑2次免疫。

[0013] 作为优选，所述抗体纯化包括：

[0014] 判断抗血清效价是否大于1:32000，若是，则收集含抗体血清，分别采用多肽1和多肽2制作纯化柱进行纯化，得到修饰性抗体。

[0015] 作为优选，纯化后的抗体效价大于1:64000。

[0016] 作为优选，所述抗血清效价通过间接ELISA方法检测；所述抗体纯化通过抗原特异亲和纯化进行。

[0017] 本发明第三方面提供一种所述的抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0018] 作为优选，所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌肿瘤中的至少一种。

[0019] 作为优选，所述抗肿瘤药物包括所述抗体及赋形剂。

[0020] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

[0021] 本发明所述的磷酸化EIF5B特异性抗体，所述抗体为人源磷酸化ElF5B T78特异性位点多克隆抗体，所述抗体一方面为检测磷酸化EIF5B T78位点的表达，验证相关分子机制
提供了可能，另一方面该抗体与磷酸化真核翻译起始因子5B(p‑EIF5B)蛋白结合，还提供包
含这种抗体的组合物，本发明利用现有的磷酸化蛋白抗体技术，构建特异性磷酸化EIF5B 
T78位点多克隆抗体，解决了现有技术中EIF5B磷酸化抗体种类少，特异性差等特点，为检测
磷酸化EIF5B T78位点的表达、验证相关分子机制提供了可能。

附图说明

[0022] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

[0023] 图1是本发明实施例所述的多肽1的质谱图；

[0024] 图2是本发明实施例所述的偶联有KLH的多肽1的质谱图；

[0025] 图3是本发明实验例所述的蛋白质免疫印迹验证中的凝胶成像结果；

[0026] 图4是本发明实验例中，肺癌肿瘤切片的倒置显微镜图片；

[0027] 图5(a)为肝癌肿瘤切片的倒置显微镜图片；

[0028] 图5(b)为肝癌旁组织的倒置显微镜图片；

[0029] 图6(a)为前列腺癌肿瘤切片的倒置显微镜图片；

[0030] 图6(b)为前列腺癌旁组织的倒置显微镜图片；

[0031] 图7(a)为胃癌肿瘤切片的倒置显微镜图片；

[0032] 图7(b)为正常胃组织的倒置显微镜图片。

具体实施方式

[0033] 实施例

[0034] 本实施例提供一种磷酸化EIF5B特异性抗体，所述抗体具体为人源磷酸化ElF5B T78特异性位点多克隆抗体。

[0035] 磷酸化ElF5B T78特异性位点多克隆抗体通过如下方法制备：

[0036] S1、制备抗原，首先根据EIF5B的蛋白序列(如SEQ ID NO:3所示)合成20mg多肽1，所述多肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：KADRET(p)VAVKPTENN‑Cys，SEQ ID NO:1中，
该位点的苏氯酸(T)被磷酸化。取10mg多肽1偶联血蓝蛋白(KLH)，制得抗原。多肽1及偶联有
KLH的多肽的质谱结果如图1‑2所示。

[0037] S2、制备抗体，将偶联有血蓝蛋白的多肽1作为抗原进行免疫处理，得到抗体。采用偶联有KLH的多肽1作为抗原免疫2只新西兰大白兔，免疫试剂及抗原计量如表1所示：

[0038] 表1

[0039]免疫时间 剂量(/只)
一免(Day1) 0.5mg
二免(Day14) 0.5mg
三免(Day28) 0.5mg
四免(Day42) 0.5mg

[0040] 抗体制备具体包括如下步骤：

[0041] 1、兔子的准备：挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只(约2Kg)，使其适应新的生活环境，稳定几天进行首次取血。

[0042] 预采血(作阴性参照用)：

[0043] 将兔子小心置于固定的架中，剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见，用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)，将收集的血液置于37℃灭活30min，最后置于4℃过夜使
其凝结释放血清，将凝结好的血液在10000r/min离心10min，收集上清，即为血清。

[0044] 2、兔子的免疫

[0045] 2.1注射两只兔子的抗原为1ml，抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂，每只兔子初次免疫400μg抗原比较适合，也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为
100μg即可。

[0046] 2.2将1ml的佛氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)与准备好的1ml抗原充分混匀，呈乳白色。

[0047] 2.3小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可)，每个部位250μl，针头呈45度角插入皮下1‑2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

[0048] 2.4免疫周期为20天，免疫完后7‑10天取血(包括中途测试取血和最终放血)，总共免疫4‑5次。

[0049] S3、抗血清效价检测，分别用间接ELISA方法检测第三次及第四次免疫后的抗血清效价，若抗血清效价大于1：32000，则效价达到要求，若抗血清效价小于1：32000，则增加1‑2
次免疫。

[0050] S4、抗体纯化，判断抗血清效价是否大于1:32000，若是，则收集含抗体血清，采用抗原特异亲和方式纯化，分别采用多肽1和多肽2制作纯化柱进行纯化，得到修饰性抗体以
及去除非修饰性抗体，纯化后进一步检测抗体效价，纯化抗体效价大于1:64000。

[0051] 所述抗体效价通过如下方式检测：

[0052] 1、选取两个参照：阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液)；阳性参照为以前阳性血清。

[0053] 2、于96孔板中每孔滴加100ul，1μg/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。

[0054] 3、倒掉抗原溶液，每孔加入200μl的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。

[0055] 4、倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体，用洗涤液洗板三次，每次尽量拍干残留液体，若要放置一段时间，37℃烘干并用封口袋封好于‑20℃存放。

[0056] 5、取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100μl，第二孔加入阳性参照液100μl，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1小时。

[0057] 6、倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100μl的HRP标记的小鼠抗兔IgG(1：2000稀释)，于37℃孵育45分钟。

[0058] 7、倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100μl的TMB底物(Sigma单组份TMB)37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。

[0059] 8、每孔加入50μl的终止液(2N H2SO4)，在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。

[0060] 抗体的抗原特异亲和纯化通过如下步骤进行：

[0061] 1、亲和柱的制备，取1mg CNBr‑Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol/L的盐酸中，4℃过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。

[0062] 2、将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol/L的盐酸洗介质3次。

[0063] 3、用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液pH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。

[0064] 4、将溶解在5ml偶联缓冲液中的5‑10mg的抗原加入凝胶中。

[0065] 5、室温下轻轻混合摇动2‑4小时，或4℃过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。

[0066] 6、加入15m l 1％BSA(牛血清白蛋白)溶液室温下孵育2小时或4℃过夜。

[0067] 7、用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上。

[0068] 8、抗原固相化完成，可用于纯化，若不立即使用或者使用后，用20％的乙醇封存。

[0069] 抗血清的纯化和保存：

[0070] 1、抗血清用PBS等体积稀释，5000‑10000r/min离心15分钟，取上清。

[0071] 2、用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。

[0072] 3、将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。

[0073] 4、室温下轻轻混合摇动2‑4小时，或4℃过夜。

[0074] 5、用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白。

[0075] 6、用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体。

[0076] 7、用10倍体积PBS平衡柱子。

[0077] 8、用20％的酒精封存柱子，4℃下保存。

[0078] 在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加
40‑50％甘油置于‑20℃可长期保存。

[0079] 本实施例中优选地，步骤S3之前还包括合成用于效价检测和抗体纯化的多肽2的步骤，所述多肽2的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示：KADRETVAVKPTENN‑Cys，本实施例中，
合成10mg的多肽2，多肽1、多肽2的纯度均大于90％。

[0080] 所述多肽通过如下工艺制备：

[0081] 1、树脂溶涨，将2‑Chlorotrityl Chloride Resin(2‑氯三苯甲基氯树脂)树脂放入反应管中，加DMF(二甲基甲酰胺)(15ml/g)，振荡30min。

[0082] 2、接第一个氨基酸，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc‑L‑Gly‑OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA(N,N‑二异丙基乙胺)，最后加入DMF溶解，振荡30min。

[0083] 3、脱保护，去除DMF，加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡5min，去掉再加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡15min。

[0084] 4、检测，抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN(氰化钾)、苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

[0085] 5、洗涤，依次用DMF(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，DMF(10ml/g)洗涤两次。

[0086] 6、缩合，方法a：保护氨基酸(FOMC‑Asp‑OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM(N‑甲基吗啡啉)十倍过量，反应30min。

[0087] 方法b：保护氨基酸三倍过量，HOBt(1‑羟基苯并三唑)三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIC(N,N'‑二异丙基碳二亚胺)三倍过量，反应30min。

[0088] 7、洗涤，依次用DMF(10ml/g)洗涤一次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，DMF(10ml/g)洗涤两次。

[0089] 8、重复步骤2‑7，从右到左连接序列中的氨基酸。

[0090] 9、最后一个氨基酸连接后，脱保护，并按照如下顺序洗涤树脂：

[0091] DMF(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，DMF(10ml/g)洗涤两次，DCM(10ml/g)洗涤两次，抽干10min。

[0092] 10、从树脂上切割多肽，首先配制切割液(10ml/g)：TFA 94.5％；水2.5％；EDT(1,2‑乙二硫醇)2.5％；TIS(三异丙基硅烷)1％，切割时间：120min。

[0093] 11、吹干洗涤，将裂解液用氮气吹干，用乙醚洗涤6次，然后常温挥干。

[0094] 12、用HPLC(高效液相色谱)纯化多肽，将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化：

[0095] Pump A:0.1％trifluoroacetic(三氟乙酸)置于100％水中，

[0096] Pump B:0.1％trifluoroacetic(三氟乙酸)置于100％乙腈中，

[0097] Total Flow(总流速):1.0ml/min，

[0098] Volume(体积):30μl，

[0099] wave‑length(波长):220nm，

[0100] Gradient(斜率):

[0101]Time(时间)(min) A B
05.00 90％ 10％
30.00 20％ 80％

[0102] 30.10min，停止。

[0103] Column:Venusi MRC‑ODS C1830x250mm。

[0104] 13、将纯化后的溶液冻干，得到成品。

[0105] 14、鉴定，分别取少量成品多肽，做MS的分子量鉴定和HPLC分析的纯度鉴定。

[0106] 15、将白色粉末状多肽密封包装，在‑20℃保存。

[0107] 本实施例还提供一种所述抗体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌肿瘤中的至少一种，另外，所述抗肿瘤药物包括上述抗体作为活性成分
以及赋形剂，在制备药物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以
胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材
料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，药物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆
剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、
微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟
基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

[0108] 实验例

[0109] 1、抗体内源验证

[0110] 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)验证：

[0111] 采用的主要仪器如下表2所示：

[0112] 表2

[0113]

[0114] 采用的主要试剂如下表3所示：

[0115] 表3

[0116]

[0117] 检测过程具体包括如下步骤：

[0118] 样品制备：使用A549及143B细胞制备磷酸化EIF5B激活细胞样本，收集细胞，使用RIPA裂解液((RIPA Lysis Buffer))在4℃条件下裂解细胞，将细胞裂解液于4℃下以
12000rpm的速度离心20min，将上清转移到一个新的EP管中。BCA法测定蛋白的浓度，根据裂
解液的体积加入5×SDS loading bufer，100℃煮沸5min。为防止蛋白降解，操作尽量在冰
上进行。

[0119] SDS‑PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)：按需要夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板(1.0mm或1.5mm)，将现配制好的SDS聚丙烯酰胺分离胶(8％、10％或12％)迅速加入玻璃板
缝隙中至玻璃板的2/3处，用异丙醇封胶。待分离胶凝固后，倒出异丙醇，用滤纸吸出残留液
体。将现配置好的5％的积层胶加到分离胶上，立即插入梳子。带胶完全凝固后拔出梳子用
水冲洗加样孔。将电泳装置固定，加Tris‑甘氨酸电泳缓冲液，按顺序加入样品20μl和预染
Marker。将电泳装置与电源连接，将电压调到80V，待溴酚蓝跑到分离胶时，将电压调为
120V，直到溴酚蓝跑到分离胶底部，关闭电源。分离胶各成分所需体积如表4所示：

[0120] 表4

[0121]

[0122] 浓缩胶各成分所需体积如表5所示：

[0123] 表5

[0124]

[0125]

[0126] 检测步骤如下：

[0127] (1)转膜：将凝胶取下，除去积层胶和多余部分，在转膜缓冲液中浸泡；剪取和胶大小相等的4张滤纸和1张PVDF(聚偏氟乙烯)膜，用铅笔在膜的一角做一标记。将PVDF膜依次
在100％甲醇中泡约1min，在ddH2O中浸泡2min，之后在转膜缓冲液中浸泡。将转移装置的阴
极板放平，放一层用转膜缓冲液浸泡过的海绵，在海绵上整齐地放两层转膜缓冲液浸泡过
的滤纸，用玻璃棒赶出气泡。将凝胶平放于滤纸上，精确对齐滤纸，赶尽气泡。将处理好的
PVDF膜放在凝胶上，做标记的一面朝下。将剩下的两张浸泡过的滤纸整齐地放在PVDF膜上，
同样保证没有气泡。最后放一层转膜缓冲液浸泡过的海绵，将阳极板覆盖在海绵上，夹紧夹
子。将装置置于电转槽中，加满预冷的转膜缓冲液，接通电源，200mA电转1.5h。

[0128] (2)封闭：将电转好的PVDF膜取出用TBST洗一遍，用5％milk/TBST室温摇床封闭1h。

[0129] (3)洗涤：用TBST漂洗2min。

[0130] (4)一抗和靶蛋白结合：用1％BSA/PBST按推荐稀释比稀释一抗，用杂交袋将膜封闭起来，4℃冰箱过夜。

[0131] (5)洗涤：用PBST洗涤3次，每次10min。

[0132] (6)二抗和一抗温育：将PVDF膜放入用5％milk/PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000)中，室温摇床孵育1h。

[0133] (7)洗涤：用PBST洗涤3次，每次10min。

[0134] (8)显色：取等量的Enhanced Luminol Reagent(增强鲁米诺试剂)和Oxidizing Reagent(氧化试剂)，用适量ddH2O稀释，混匀后滴加在封口膜上。将PVDF膜的正面朝下接触
发光试剂，显色1.5～2.0min，将PVDF翻转过来，用凝胶成像系统观察结果，测试结果如图3
所示。

[0135] 测试结果表明，在内参很强表达几乎一致的情况下，R1抗体(1号兔子纯化的抗体)检测8个样本(1号和5号为理论上的阴性对照，其余为推测阳性样本)，2、6和8号能爆出条
带，说明可能存在T78磷酸化。R2(2号兔子纯化的抗体)检测8个样本的条带与预期大小
138KD不符，8个样本在180KD左右有条带，其中5‑8四个样本在75KD左右。结合两个抗体的效
价检测结果，R1比R2针对磷酸化多肽更有区分度且效价更高。

[0136] 上述测试采用的凝胶信息如表6所示：

[0137] 表6

[0138]

[0139] 采用的一抗抗体稀释比例信息如表7所示：

[0140] 表7

[0141]

[0142] 采用的二抗抗体稀释比例如表8所示：

[0143] 表8

[0144]

[0145] 抗原蛋白EIF5B一共1220AAs，大小138.82KDa；pI 5.39；无信号肽，无跨膜螺旋，疏水性一般。蛋白会被酶切成两部分，其中一部分的大小为55KD左右，由于蛋白存在多个位点
的磷酸化(磷酸化后蛋白分子量会变大)，因此R2抗体爆出来的条带在180KD和75KD左右是
合理的，针对R1爆出来的条带，说明2号，6号和8号样本是发生了T78磷酸化。

[0146] 2、IHC(免疫组化)验证

[0147] IHC验证采用的主要仪器信息如下表9所示：

[0148] 表9

[0149]

[0150] IHC验证采用的主要试剂信息如下表3所示：

[0151] 表10

[0152]

[0153]

[0154] 验证过程包括如下步骤：

[0155] (1)收集临床组织样本(包括肺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌及其癌旁)固定在4％多聚甲醛20min后用石蜡包埋

[0156] (2)切片机将组织样本切至3um厚

[0157] (3)脱蜡二甲苯，室温，两次，每次20分钟。

[0158] (4)水合100％→100％→95％→90％→80％→70％乙醇→蒸馏水，每级5分钟。

[0159] (5)3％过氧化氢，室温孵育10分钟。蒸馏水冲洗。PBS浸洗5分钟。

[0160] (6)抗原修复。

[0161] (7)PBS洗涤3分钟，3次。

[0162] (8)封闭用血清，室温孵育10‑30分钟，倾去血清，勿洗。

[0163] (9)滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育60‑90分钟，或者4℃过夜。

[0164] (10)PBS洗涤3分钟，3次。

[0165] (11)辣根过氧化物酶标记抗兔IgG多聚体，室温30分钟。

[0166] (12)PBS洗涤3分钟，3次。

[0167] (13)显色剂(DAB)显色反应，5‑10分钟。光镜下控制显色程度。蒸馏水洗终止显色反应。

[0168] (14)细胞核复染苏木素3‑5分钟。流水冲洗蓝化。

[0169] (15)脱水70％→80％→90％→95％→100％→100％，每级5分钟。

[0170] (16)透明二甲苯2次，每次5分钟。

[0171] (17)中性树胶封固。

[0172] (18)倒置显微镜拍摄图片并分析，测试结果如图2‑所示。

[0173] 其中，图4为肺癌肿瘤切片的倒置显微镜图片，图5(a)为肝癌肿瘤切片的倒置显微镜图片，图5(b)为肝癌旁组织的倒置显微镜图片，图6(a)为前列腺癌肿瘤切片的倒置显微
镜图片，图6(b)为前列腺癌旁组织的倒置显微镜图片，图7(a)为胃癌肿瘤切片的倒置显微
镜图片，图7(b)为正常胃组织的倒置显微镜图片。

[0174] 从上述图片可见，在肝癌肿瘤组织与前列腺癌肿瘤组织中，可观察到阳性结果。

[0175] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或
变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或
变动仍处于本发明创造的保护范围之中。