一种抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体及应用转让专利
申请号 : CN202010417353.7
文献号 : CN112812190B
文献日 : 2022-07-08
发明人 : 王玉芳 , 查长春 , 刘川 , 刘郧飞 , 王春焦 , 唐静秋
申请人 : 上海百英生物科技有限公司
摘要 :
本发明公开了一种抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体及应用，所述纳米抗体至少具有重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3之一，该抗体能够以高亲和力特异性识别小鼠和家兔，且与人IgG没有交叉。可用于制备鼠兔通用二抗，具有重要的应用价值。
权利要求 :
1.一种抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体重链包括重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3；重链CDR1即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26—34；重链CDR2即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50—56；重链CDR3即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基95—105。
2.根据权利要求1所述的抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.编码权利要求1或2所述抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体的核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
5.具有权利要求4所述的核酸的表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体或哺乳系统表达载体。
7.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述原核表达载体为pET28a，所述哺乳系统表达载体为pcDNA3.1。
8.具有权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21或CHO。
10.根据权利要求1或2所述的抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体，其特征在于，所述抗体具有标记，所述标记为辣根过氧化物酶（HRP）。
11.根据权利要求10所述HRP标记的抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体用于制备鼠兔通用型二抗中的用途。
说明书 :
一种抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体及应用，属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 鼠或者兔等第一来源的抗体被称为第一抗体，第二抗体是能和第一抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗在间接酶联免疫、免疫层析等实验中发挥了巨大作用。传统二抗的制备是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白，具有制备周期长，操作繁琐的缺点。抗体库技术是一种将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原或抗体筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体的技术。抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还～10具有许多独特的优点，抗体库技术无需免疫，从理论上讲，10 的库容就可能包容所有的抗体。利用抗原或抗体即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选到针对该物种自身抗原的抗体。
[0003] 纳米抗体，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子，其分子量约为15KD。与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单、能够在大肠杆菌中大量表达等优势。因此，应用纳米抗体技术研发同时抗小鼠和家兔IgG且与人IgG没有交叉的纳米抗体具有广阔的应用前景。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种同时抗小鼠和家兔IgG，且与人IgG没有交叉的纳米抗体，同时还提供该抗体的应用。
[0005] 本发明采取的具体技术方案是：
[0006] 一种抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体，所述纳米抗体由单重链构成，所述抗体至少具有以下技术特征之一：
[0007] i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26—34；
[0008] ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50—56；
[0009] iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基95—105。
[0010] 优选地，所述重链包括重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3；重链CDR1即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基26—34；重链CDR2即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基50—56；重链CDR3即SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基95—105。
[0011] 优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 本发明还提供：
[0013] 编码前文所述抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体的核酸。
[0014] 优选地，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015] 本发明还提供：
[0016] 具有前文所述的核酸的表达载体，包括原核表达载体和哺乳系统表达载体。
[0017] 优选地，原核表达载体为pET28a，哺乳系统表达载体为pcDNA3.1。
[0018] 本发明还提供：
[0019] 具有前文所述表达载体的宿主细胞。
[0020] 优选地，原核表达宿主细胞为大肠杆菌BL21，哺乳系统表达宿主细胞为CHO。
[0021] 本发明还提供：
[0022] 具有标记的前文所述抗小鼠和家兔IgG的真核重组纳米抗体。
[0023] 优选地，所述标记为辣根过氧化物酶(HRP)。
[0024] 本发明还提供：
[0025] HRP标记的抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体在制备鼠兔通用二抗中的应用。
[0026] 本发明还提供：
[0027] 前文所述的核酸用于制备抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体、鼠兔通用型二抗中的用途。
[0028] 本发明还提供：
[0029] 前文所述的宿主细胞用于制备鼠兔通用型二抗中的用途。
[0030] 本发明的有益效果是：本发明通过噬菌体展示技术获得了靶向小鼠和家兔IgG的纳米抗体，该抗体能够以高亲和力特异性识别小鼠和家兔，且与人IgG没有交叉，可用于制备鼠兔通用二抗，具有重要的应用价值。
附图说明
[0031] 图1为实施例1中ELISA检测每轮淘选富集噬菌体对鼠和兔的结合情况图。
[0032] 图2为实施例1中ELISA检测单克隆噬菌体对抗原蛋白的结合情况图。
[0033] 图3为实施例1的单克隆富集率分析图。
[0034] 图4为实施例2的原核表达载体和哺乳系统表达载体示意图。
[0035] 图5为实施例2的原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。
[0036] 图6为实施例3的原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的结合ELISA结果图。
[0037] 图7为实施例4的ELISA检测HRP标记的原核表达的鼠兔通用二抗的结果图。
具体实施方式
[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
[0039] 实施例1、筛选抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体
[0040] 分别以Mouse IgG1、Rabbit IgG1、Mouse IgG2a为正筛抗原，以Human IgG为负筛9
抗原，应用噬菌体展示技术从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库(文库大小为1.47x10)中筛淘抗小鼠和家兔IgG，且与人IgG没有交叉的纳米抗体。
抗原，应用噬菌体展示技术从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库(文库大小为1.47x10)中筛淘抗小鼠和家兔IgG，且与人IgG没有交叉的纳米抗体。
[0041] 采用固相淘选的方法，将100ug/mL的Human IgG包被到ELISA板条上，每孔100uL，4℃过夜包被。PBST洗三遍，每孔加入200uL3％的酪蛋白，37℃封闭2小时。PBST洗三遍后加入12
噬菌体展示库(约有1x10 CFU)，37℃孵育1小时，收集未结合的噬菌体，重复负筛三次以去除与Human IgG结合的噬菌体。将负筛后的噬菌体加到封闭好的包被了100ug/mL Mouse IgG1被到ELISA板条上，37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，PBST洗10遍。每孔加100uL的甘氨酸‑盐酸(PH＝2.2)溶液，37℃反应7分钟，轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗脱下来，然后加入Tris‑HCl(PH＝8.8)溶液中和至中性。洗脱的噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增回收后的噬菌体，用于下一轮淘选。
噬菌体展示库(约有1x10 CFU)，37℃孵育1小时，收集未结合的噬菌体，重复负筛三次以去除与Human IgG结合的噬菌体。将负筛后的噬菌体加到封闭好的包被了100ug/mL Mouse IgG1被到ELISA板条上，37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，PBST洗10遍。每孔加100uL的甘氨酸‑盐酸(PH＝2.2)溶液，37℃反应7分钟，轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗脱下来，然后加入Tris‑HCl(PH＝8.8)溶液中和至中性。洗脱的噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增回收后的噬菌体，用于下一轮淘选。
[0042] 经过三轮淘选后，用Phage‑ELISA进行验证是否特异性富集。分别将2ug/mL的Mouse IgG、Rabbit IgG1、Mouse IgG2a、Human IgG包被到ELISA板条上，4℃过夜包被。PBST洗三遍后用3％的酪蛋白37℃封闭2小时。PBST洗5遍后加入三轮淘选的噬菌体展示库，首孔12
约1x10 CFU，4倍梯度稀释，末孔空白，37℃结合1小时。PBST洗5遍后加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加TMB显色液室温避光显色5‑10分钟，最后用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值并做Phage‑ELISA结合曲线。
约1x10 CFU，4倍梯度稀释，末孔空白，37℃结合1小时。PBST洗5遍后加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加TMB显色液室温避光显色5‑10分钟，最后用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值并做Phage‑ELISA结合曲线。
[0043] ELISA检测结果如图1所示，以辅助噬菌体为阴性对照，在三轮富集后，噬菌体群对小鼠和家兔IgG的亲和力逐轮升高，对Human IgG的亲和力逐轮降低。
[0044] 对第三轮富集的噬菌体单克隆进行抗原结合分析，具体过程为：
[0045] 用第三轮富集的噬菌体库感染TG1细胞，并从中随机挑取440个单克隆，扩增并回收噬菌体。将2ug/mL的Mouse IgG、Rabbit IgG1、Mouse IgG2a、Human IgG分别包被到ELISA板条上，4℃过夜包被。PBST洗三遍后用3％酪蛋白37℃封闭2小时。将440个扩增后的单克隆噬菌体以1:1比例与含3％酪蛋白的PBST溶液室温孵育1小时，将孵育好的噬菌体加到封闭好的酶标板中，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃孵育1小时。PBST洗5遍后加TMB室温避光显色5‑10分钟，最后用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值，吸光值在阴性对照(辅助噬菌体)两倍以上的为阳性克隆。分析单克隆噬菌体对Mouse IgG、RabbitIgG1、Mouse IgG2a、Human IgG的结合能力，检测结果如图2所示。440单克隆噬菌体中有59个与Mouse IgG、Rabbit IgG1、Mouse IgG2都有结合且与Human IgG没有结合的克隆(三阳一阴)。
[0046] 对这59个阳性克隆进行测序分析，得到8个Unique sequence，其中Unique 1为优势富集克隆(如图3所示)。
[0047] Unique 3的抗体DNA序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
[0048] SEQ ID NO：1：gaggtgcaggtggtggagtctgggggaggcttggtgcaggcgggggggtctctgagactctcctgtgtagcctctggtacgtatcgtatccatcccatggcctggtaccgccaggctccagggaaggagcgcgagttggtcgcagttattactactgatggtcagacaaggtataccgactccgtgaagggccgattcaccatttccagagccaacgacaagaacacggcggaattgcaaatgaacagcctaaagtctgaggacacaggcgtttattactgtagtctccgtaacttgaggattggatttaattactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcc
[0049] SEQ ID NO：2：EVQVVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGTYRIHPMAWYRQAPGKERELVAVITTDGQTRYTDSVKGRFTISRANDKNTAELQMNSLKSEDTGVYYCSLRNLRIGFNYWGQGTQVTVSS
[0050] 在氨基酸序列中，氨基酸残基26‑34(即GTYRIHPMA)为重链CDR1，氨基酸残基50‑56(即ITTDGQT)为重链CDR2，氨基酸残基95‑105(即SLRNLRIGFNY)为重链CDR3。
[0051] 实施例2：抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体的原核表达纯化和哺乳系统表达纯化
[0052] 原核表达纯化
[0053] 构建实施例1中Unique3纳米抗体的原核表达载体pET28a(GST标签)，如图4所示，然后以此制备质粒。提取质粒并热激转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达。第二天将菌液离心收集用80mL PBS重悬菌体后进行超声破碎，条件为200w，破碎3s，间歇3s。然后4℃，8000g离心收集上清，过GST 4FF介质(百英内部提供)，纳米抗体吸附到层析介质上，用1×PBS洗去杂蛋白，加入20mM还原型谷胱甘肽洗脱，在得到的纳米抗体溶液中加入PBS进行超滤(3600rpm/min，12min，重复3次)，得到的纳米抗体是溶在PBS中，纯化的纳米抗体进行SDS‑PAGE，实验结果如图5所示。
[0054] 哺乳系统表达纯化
[0055] 构建实施例1中Unique1纳米抗体的哺乳系统表达载体pcDNA3.1，如图4所示，然后以此制备质粒。运用脂质体转染法将构建成功的重组载体转染293F细胞。取对数生长期6
293F细胞接种至6孔板中，细胞密度为1.5×10cell/mL，37℃、5％CO2培养箱中微孔板振荡器600rpm培养，2h后进行转染。将脂质体一载体混合液加入细胞孔，培养2、4、6天补料补液，第7天收样纯化。用20mL 1xPBS，1mL/min的流速平衡层析柱，1mL/min的流速上样，20mL
1xPBS，1mL/min的流速洗杂，用柠檬酸缓冲液(PH3.4)洗脱，流速1mL/min，分管收集，每管约
500uL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。将高浓度蛋白吸至透析袋放
1XPBS的烧杯中透析。收集纯化好的抗体其还原条件下的SDS‑PAGE结果如图5。
293F细胞接种至6孔板中，细胞密度为1.5×10cell/mL，37℃、5％CO2培养箱中微孔板振荡器600rpm培养，2h后进行转染。将脂质体一载体混合液加入细胞孔，培养2、4、6天补料补液，第7天收样纯化。用20mL 1xPBS，1mL/min的流速平衡层析柱，1mL/min的流速上样，20mL
1xPBS，1mL/min的流速洗杂，用柠檬酸缓冲液(PH3.4)洗脱，流速1mL/min，分管收集，每管约
500uL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。将高浓度蛋白吸至透析袋放
1XPBS的烧杯中透析。收集纯化好的抗体其还原条件下的SDS‑PAGE结果如图5。
[0056] 实施例3原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的结合ELSIA
[0057] 用ELISA对原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体进行验证。将2ug/mL的Mouse IgG1、Rabbit IgG1、Mouse IgG2a、Human IgG分别包被到ELISA板条，4℃过夜，3％的酪蛋白
37℃封闭1小时，将实施例2中两种系统表达抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体稀释至2.5ug/mL作为首孔浓度，4倍梯度稀释，末孔为空白，37℃孵育1小时，PBST洗板5次后拍干，用HRP标记的Anti‑VHH做二抗，37℃孵育1小时，PBST洗板5次后拍干。每孔加100uL TMB室温避光反应
5‑10min，用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值。
37℃封闭1小时，将实施例2中两种系统表达抗小鼠和家兔IgG的纳米抗体稀释至2.5ug/mL作为首孔浓度，4倍梯度稀释，末孔为空白，37℃孵育1小时，PBST洗板5次后拍干，用HRP标记的Anti‑VHH做二抗，37℃孵育1小时，PBST洗板5次后拍干。每孔加100uL TMB室温避光反应
5‑10min，用2M硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值。
[0058] 结果如图6所示，两种系统表达的纳米抗体与Mouse IgG1、Rabbit IgG1、Mouse IgG2a都有结合，与Human IgG都没有结合。
[0059] 实施例4用原核表达的抗小鼠和家兔IgG纳米抗体制备HRP标记的鼠兔通用型二抗[0060] 按照抗体－HRP标记试剂盒操作说明书对原核表达的抗小鼠和家兔IgG纳米抗体进行标记，具体为实验前30分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(18～25℃)。配制CB(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6，25℃)和PBS(10mM磷酸盐、0.9％NaCl缓冲液，pH 7.2，25℃)各1500mL。5mg/mL的原核表达的抗小鼠和家兔IgG纳米抗体溶液于50mM CB(pH 9.6)4℃透析过夜，换液2～3次。在避光条件下取0.4mL的超纯水加入HRP管中，充分混匀，取1mL超纯水加入过碘酸钠(NaIO3)管中，充分混匀。取溶好的NaIO3溶液45uL加入到溶好的HRP溶液中，边加边混匀，室温暗置反应20min。取乙二醇40uL加入到上述溶液中，充分混匀，室温暗置反应
30min。将上述氧化好的HRP溶液加入到原核表达的抗小鼠和家兔IgG纳米抗体溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。交联透析液为50mM CB(pH 9.6)缓冲液。取0.5mL超纯水加入硼氢化钠(NaBH4)管，颠倒数次混匀。将交联完毕的抗体－HRP溶液从透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80uL，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻轻摇匀一次。将还原完毕的抗体‑HRP溶液置于10mM PBS(pH 7.2)溶液中4℃透析过夜(18小时以上)。换液3～4次，第一次换液时间间隔2小时。收获标记好的抗体－HRP溶液，备用(可加等量甘油或其他蛋白保护剂)。
30min。将上述氧化好的HRP溶液加入到原核表达的抗小鼠和家兔IgG纳米抗体溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。交联透析液为50mM CB(pH 9.6)缓冲液。取0.5mL超纯水加入硼氢化钠(NaBH4)管，颠倒数次混匀。将交联完毕的抗体－HRP溶液从透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80uL，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻轻摇匀一次。将还原完毕的抗体‑HRP溶液置于10mM PBS(pH 7.2)溶液中4℃透析过夜(18小时以上)。换液3～4次，第一次换液时间间隔2小时。收获标记好的抗体－HRP溶液，备用(可加等量甘油或其他蛋白保护剂)。
[0061] 分别用Mouse IgG、Mouse IgG2a、Rabbit IgG和Human‑IgG包被酶标板，首孔2.5ug/mL，四倍梯度稀释，末孔空白，4℃过夜。第二天用PBST洗3‑5次，拍干后每孔加200uL
3％酪蛋白，37℃封闭1h，用PBST洗3‑5次，拍干后每孔加100uL HRP标记的纳米抗体(1mg/mL，1:2000稀释使用)，37℃孵育1h，用PBST洗3‑5次，拍干后每孔加100uL TMB，37℃避光反应5‑10min，最后每孔加50uL 2M硫酸终止显色，读取450nm处的吸光值。
3％酪蛋白，37℃封闭1h，用PBST洗3‑5次，拍干后每孔加100uL HRP标记的纳米抗体(1mg/mL，1:2000稀释使用)，37℃孵育1h，用PBST洗3‑5次，拍干后每孔加100uL TMB，37℃避光反应5‑10min，最后每孔加50uL 2M硫酸终止显色，读取450nm处的吸光值。
[0062] 结果如图7所示，HRP标记的原核表达的抗小鼠和家兔IgG纳米抗体与Mouse IgG1、Rabbit IgG1、Mouse IgG2a都有结合，与Human IgG都没有结合，可用于制备鼠兔通用型二抗。
[0063] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
[0064] 尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。