一种作为核酸-抗体共缀物通用载体的ProA/G-dRep融合蛋白及其应用

摘要

本发明提供了一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白及其应用，特别涉及基因工程领域。本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白，从N端至C端包括依次连接的蛋白A/G的融合蛋白、柔性肽和鸭环状病毒复制酶。本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白能够准确的确定抗体和单链DNA的连接数量，且合成方法简单，能够广泛应用于核酸‑蛋白质共缀物的研究中。

权利要求

1.一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白，其特征在于，从N端至C端包括依次连接的蛋白A/G的融合蛋白、柔性肽和鸭环状病毒复制酶。

2.根据权利要求1所述ProA/G‑dRep融合蛋白，其特征在于，所述ProA/G‑dRep融合蛋白的氨基酸如序列SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述ProA/G‑dRep融合蛋白，其特征在于，所述蛋白A/G的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述鸭环状病毒复制酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.一种表达权利要求1～3任一项所述ProA/G‑dRep融合蛋白的重组表达载体，其特征在于，所述载体的基础质粒是pET‑28a。

5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，在所述pET‑28a的NdeI和XhoI酶切位点处插入编码所述ProA/G‑dRep融合蛋白的核苷酸序列。

6.一种包含权利要求1～3任一项所述ProA/G‑dRep融合蛋白或权利要求4所述重组表达载体的工程菌。

7.权利要求1～3任一项所述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用权利要求6所述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白在检测肌红蛋白中的应用。

8.一种检测肌红蛋白的试剂，其特征在于，所述试剂的有效成分包括权利要求1～3任一项所述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用权利要求6所述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白。

9.一种检测肌红蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1～3任一项所述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用权利要求6所述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白。

说明书

一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白

及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白及其应用。

背景技术

[0002] 核酸和蛋白质是构成生命基础的最重要两类生物大分子。目前常用的核酸与抗体的连接方法主要是依靠化学偶联剂的共价连接方法，常用的方法如下：1.在化学偶联剂EDC
的作用下将抗体和核酸的羧基和氨基进行偶联，完成核酸与抗体的连接，但该方法无法控
制偶联的位置，可能会导致抗体失活；2.将核酸进行马来酰亚胺基团修饰，与单链抗体上的
游离巯基进行偶联，完成核酸与抗体的连接，该方法无法控制偶联的位置且无法控制偶联
TM
数量；3.利用Thermofisher的商品化试剂盒SiteClick Antibody Azido Modification 
Kit将抗体Fc端的糖链进行叠氮化，再与5’端修饰了DBCO的核酸进行偶联反应，完成核酸与
抗体的连接，尽管该方法能够控制偶联位置，但需要引入昂贵的碱基修饰和其他的纯化步
骤，且不能控制偶联数量。由此可见，现有技术中的方法仍存在成本高、无法确定抗体和单
链DNA的连接数量的缺点。

发明内容

[0003] 为了解决上述问题，本发明提供了一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白及其应用，所述ProA/G‑dRep融合蛋白能够准确的确定抗体和单链DNA的连接
数量，且合成方法简单，能够广泛应用于核酸‑蛋白质共缀物的研究中。

[0004] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0005] 本发明提供了一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白，从N端至C端包括依次连接的蛋白A/G的融合蛋白、柔性肽和鸭环状病毒复制酶。

[0006] 优选的，所述ProA/G‑dRep融合蛋白的氨基酸如序列SEQ ID No.1所示。

[0007] 优选的，所述蛋白A/G的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述鸭环状病毒复制酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所
示。

[0008] 本发明提供了一种表达上述ProA/G‑dRep融合蛋白的重组表达载体，其特征在于，所述载体的基础质粒是pET‑28a。

[0009] 优选的，在所述pET‑28a的NdeI和XhoI酶切位点处插入编码所述ProA/G‑dRep融合蛋白的核苷酸序列。

[0010] 本发明提供了一种包含上述ProA/G‑dRep融合蛋白或上述重组表达载体的工程菌。

[0011] 本发明提供了上述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用上述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白在检测肌红蛋白中的应用。

[0012] 本发明提供了一种检测肌红蛋白的试剂，所述试剂的有效成分包括上述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用上述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白。

[0013] 本发明提供了一种检测肌红蛋白的试剂盒，所述试剂盒中包括上述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用上述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白。

[0014] 有益效果：本发明提供了一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白，从N端至C端包括依次连接的蛋白A/G的融合蛋白、柔性肽和鸭环状病毒复制酶(即蛋
白A/G的融合蛋白‑柔性肽‑鸭环状病毒复制酶)。本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白通过酶
连接反应快速连接单链DNA，通过亲和反应快速连接IgG抗体；本发明所述ProA/G‑dRep融合
蛋白作为单链脱氧核糖核酸‑抗体共缀物的通用载体，能够快速的连接任意单链DNA(5’端
包含dRep特异性识别及连接的序列)和任意被ProA/G识别及结合的IgG抗体，准确的确定抗
体和单链DNA的连接数量，且合成方法简单，能够广泛应用于核酸‑蛋白质共缀物的研究中。
本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白能够用于0.1～5000ng/ml范围内的肌红蛋白检测，相关
系数r＝0.9979，灵敏度高。

附图说明

[0015] 图1为重组融合蛋白(ProA/G‑dRep)的结构示意图；

[0016] 图2为单链脱氧核糖核酸‑抗体共缀物(ssDNA‑Antibody conjugate)图；

[0017] 图3为实施例3中连接反应电泳图；

[0018] 图4为实施例4中western blot结果图；

[0019] 图5为实施例5中肌红蛋白的标准曲线图。

具体实施方式

[0020] 如无特殊要求，本发明具体实施例中采用的时间均为本领域技术人员常规购买所得。

[0021] 本发明提供了一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白，从N端至C端的结构如图1所示，包括依次连接的蛋白A/G的融合蛋白‑柔性肽‑鸭环状病毒复制
酶。在本发明中，所述ProA/G‑dRep融合蛋白的氨基酸优选如序列SEQ ID No.1所示：VDNKF
NKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSGGGGSGGGGSMAKSGNYS
YKRWVFTINNPTFEDYVHVLEFCTLDNCKFAIVGEEKGANGTPHLQGFLNLRSNARAAALEESLGGRAWLSRARGS
DEDNEEYCAKESTYLRVGEPVSKGRSSDLAEATSAV。

[0022] 本发明对所述ProA/G‑dRep融合蛋白的制备方法并没有特殊限定，既可以通过表达载体进行表达，也可人工合成，优选委托上海生工合成。

[0023] 在本发明中，所述蛋白A/G的融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.2所示：VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLL AEAKKLNDAQAPK；所述柔性肽的氨基酸
序列优选如SEQ ID No.3所示：GGGGSGGGGSGGGGS；所述鸭环状病毒复制酶的氨基酸序列优
选如SEQ ID No.4所示：MAKSGNYSYKRWVFTINNPTFEDYVHVLEFCTLDNCKFAIVGEEKGANGTPHLQGF
LNLRSNARAAALEESLGGRAWLSRARGSDEDNEEYCAKESTYLRVGEPVSKGRSSDLAEATSAV。

[0024] 本发明提供了一种表达上述ProA/G‑dRep融合蛋白的重组表达载体，所述载体的基础质粒是pET‑28a。在本发明中，所述重组表达载体优选在所述pET‑28a的NdeI和XhoI酶
切位点处插入编码所述ProA/G‑dRep融合蛋白的核苷酸序列。本发明对所述载体质粒的种
类并没有特殊要求，能通过双酶切的方式插入编码所述ProA/G‑dRep融合蛋白的核苷酸序
列并完成表达即可，在本发明实施例中，所述载体质粒优选为pET‑28a。

[0025] 本发明提供了一种包含上述ProA/G‑dRep融合蛋白或上述重组表达载体的工程菌，即BL21(DE3)/pET‑28a‑ProA/G‑dRep。在本发明中，所述工程菌的基础菌为BL21(DE3)。

[0026] 本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白可用于检测肌红蛋白，本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白构建得到的抗体‑核酸共缀物能够结合肌红蛋白，从而达到检测肌红蛋白的效果。

[0027] 本发明提供了上述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用上述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白在检测肌红蛋白中的应用。本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白可构建抗体‑核酸共
缀物，并基于抗原免疫‑聚合酶链式反应，检测0.1～5000ng/mL范围内的肌红蛋白，标准曲
线为y＝640.77x‑101.2，相关系数为r＝0.9979，其中y代表的是荧光强度，x代表的是浓度
对数值。

[0028] 本发明提供了一种检测肌红蛋白的试剂，所述试剂的有效成分包括上述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用上述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白。

[0029] 本发明提供了一种检测肌红蛋白的试剂盒，所述试剂盒中包括上述ProA/G‑dRep融合蛋白或利用上述工程菌产生的ProA/G‑dRep融合蛋白。

[0030] 本发明还提供了一种基于上述ProA/G‑dRep融合蛋白的检测肌红蛋白的方法，所述方法采用肌红蛋白抗原免疫‑聚合酶链式反应，具体包括以下步骤：

[0031] (1)将ProA/G‑dRep融合蛋白与ssDNA‑1反应后，利用与ssDNA‑1互补的ssDNA‑2洗去未发生连接反应的ProA/G‑dRep融合蛋白，利用Tte UvrD解旋酶进行解旋处理，洗脱
ProA/G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物和未发生连接的ssDNA1，利用Ni‑NTA层析亲和连接ProA/G‑
dRep‑ssDNA‑1共缀物，纯化后得纯化后的ProA/G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物，将纯化后的ProA/
G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物与肌红蛋白单克隆抗体1连接，得肌红蛋白单克隆抗体1‑单链脱氧
核糖核酸共缀物；

[0032] (2)将羧基磁珠离心去除上清液后，与肌红蛋白单克隆抗体2(Myo mAb2)抗体和MES混合进行偶联处理，得肌红蛋白单克隆抗体2(Myo mAb2)与磁珠偶联物；

[0033] (3)Circular DNA与对应的环状连接序列linker等体积混合后连接，降解未发生连接反应的linker后，采用乙醇沉淀法纯化得到环状脱氧核糖核酸Circular DNA，添加
Tris‑Ac、MgAC2、KAc、Tween、DTT、dNTP、 DNA polymerase和SYBGreen I，得到环状脱氧
核糖核酸反应液；

[0034] (4)单链脱氧核糖核酸探针Signal DNA溶于TE缓冲液中，得单链脱氧核糖核酸探针；

[0035] (5)将肌红蛋白抗原蛋白溶液分别与肌红蛋白单克隆抗体1‑单链脱氧核糖核酸共缀物和肌红蛋白单克隆抗体2与磁珠偶联物混匀后进行混合，通过磁分离弃去上清，并用
PBS溶液反复漂洗，得混合组分1；

[0036] (6)将混合组分1中加入环状脱氧核糖核酸反应液和单链脱氧核糖核酸探针，混匀后进行扩增处理，检测荧光强度并获得标准曲线；

[0037] 步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)之间不存在时间上的先后顺序。

[0038] 本发明步骤(1)所述纯化包括依次进行咪唑洗脱和G‑25脱盐；所述连接的反应体系优选包括PBS、ProA/G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物和Myo mAb1；所述反应的温度优选为37℃，时
间优选为15min。

[0039] 本发明步骤(2)所述肌红蛋白单克隆抗体2为单克隆抗体1的配对抗体。

[0040] 本发明步骤(3)优选利用T4 DNA ligase进行所述连接，所述连接的体系和方法参考T4 DNA ligase的说明书即可；所述连接后优选还包括失活处理；所述失活处理的温度优
选为65℃，时间优选为5min。本发明经上述连接和失活处理后，降解未发生连接反应的
linker，在所述降解后优选还包括失活处理；所述失活处理的温度优选为85℃，时间优选为
20min。

[0041] 本发明步骤(5)所述肌红蛋白抗原蛋白溶液的用量优选为10μl；所述肌红蛋白单克隆抗体1‑单链脱氧核糖核酸共缀物的用量优选为50μl；所述肌红蛋白单克隆抗体2与磁
珠共缀物的用量优选为50μl。

[0042] 本发明中步骤(6)所述环状脱氧核糖核酸反应液的用量优选为50μl；所述单链脱氧核糖核酸探针的用量优选为10μl。在本发明中，所述扩增的温度优选为恒温37℃；所述扩
增的时间优选为15min。

[0043] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种作为核酸‑抗体共缀物通用载体的ProA/G‑dRep融合蛋白及其应用进行详细地描述，但不能将它们理
解为对本发明保护范围的限定。

[0044] 实施例1

[0045] 1、ProA/G‑dRep融合蛋白基因氨基酸序列选取：

[0046] 鸭环状病毒复制酶(Duck circovirus Rep)氨基酸序列(Uniprot Accession No.A7LI84，SEQ ID No.4)如下：

[0047] MAKSGNYSYKRWVFTINNPTFEDYVHVLEFCTLDNCKFAIVGEEKGANGTPHLQGFLNLRSNARAAALEESLGGRAWLSRARGSDEDNEEYCAKESTYLRVGEPVSKGRSSDLAEATSAV；

[0048] 蛋白A/G的融合蛋白(ProA/G)氨基酸序列(SEQ ID No.2)如下：

[0049] VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；

[0050] 柔性肽(flexible peptides)氨基酸序列(SEQ ID No.3)如下：

[0051] GGGGSGGGGSGGGGS；

[0052] 2、ProA/G‑dRep融合蛋白氨基酸序列设计

[0053] 将ProA/G置于ProA/G‑dRep融合蛋白N末端，柔性肽置于ProA/G和dRep之间，dRep置于ProA/G‑dRep融合蛋白C末端，形成结果如图1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的
ProA/G‑dRep融合蛋白。

[0054] 3、ProA/G‑dRep融合蛋白基因合成

[0055] 将该氨基酸序列发送至上海生工进行基因优化和基因合成。

[0056] 4、ProA/G‑dRep融合蛋白基因表达载体构建

[0057] 由上海生工将合成后的基因在基因序列的5’端设计加入限制性内切酶NdeI位点，在3’端设计加入终止子和限制性内切酶XhoI位点，通过限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后
亚克隆至pET‑28a表达质粒中，获得表达载体pET‑28a‑ProA/G‑dRep，同时使该融合基因在
表达ProA/G‑dRep融合蛋白时N末端包含6×histidine tag。

[0058] 实施例2

[0059] 1、ProA/G‑dRep融合蛋白基因工程菌制备

[0060] (1)取2μL溶解后的质粒加入至BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴10min；

[0061] (2)置于42℃水浴中热激90s后，立即置于冰浴5min；

[0062] (3)加入无抗LB培养基900μL，水平固定于摇床中，37℃振荡60min；

[0063] (4)离心弃去上清800μL，重悬剩余菌液均匀涂布于含有50μg/ml kanamycin的LB平板上；

[0064] (5)倒置于恒温培养箱中，37℃培养12h，获得ProA/G‑dRep融合蛋白基因工程菌BL21(DE3)/pET‑28a‑ProA/G‑dRep。

[0065] 2、发酵表达

[0066] (1)取平板挑取生长良好的单克隆菌体至含5mL  LB液体培养基(50μg/ml kanamycin)的试管中，37℃振荡培养12h；

[0067] (2)将正常生长的菌液全部转接至含300mL LB液体培养(50μg/ml kanamycin)的摇瓶中，37℃振荡培养8hrs；

[0068] (3)将正常生长的菌液全部转接至含3000mL LB液体培养(50μg/ml kanamycin)的摇瓶中，37℃振荡培养6hrs(OD600在0.6～0.8时)，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，30
℃振荡培养过夜；

[0069] (4)取诱导后菌液，4000rpm离心15min弃去上清收集菌体，称量湿菌重量后冻存于‑30℃冰箱中。

[0070] 3、分离纯化

[0071] (1)称量5g湿菌，按1g:20mL用破菌缓冲液(50mM Tris，350mM NaCl，5mM β‑ME，10mM咪唑(imidazole)，pH8.0)进行重悬，在冰浴条件下使用超声破碎仪(参数：探头直接
0.5cm，功率70％，超声3s停2s，)破碎10min。将破碎后悬浊液进行离心处理，转速为
9000rpm，时间为10min，将上清与沉淀分离，留样电泳备用，2～8℃保留上清液层析备用；

[0072] (2)Ni亲和层析柱处理：取5mL层析柱固定后连接上下管路(上管路连接恒流泵，下管路连接紫外信号采集器)，用纯化水按10mL/min流速冲洗10个柱体积(去除层析柱内的
20％乙醇)，再用平衡缓冲液(50mM Tris，1M NaCl，5mM β‑ME，10mM咪唑，pH8.0)按10mL/min
流速冲洗20个柱体积，使信号达到平衡，进行校准处理；

[0073] (3)层析柱上样：取上清液按3mL/min流速上样(注意不要产生气泡)，并同时收集流穿液，取样留做电泳样品(标记flow through)；

[0074] (4)层析柱漂洗：上样结束后，取平衡缓冲液(50mM Tris，1M NaCl，5mM β‑ME，10mM咪唑(imidazole)，pH8.0)进行漂洗，按3mL/min流速漂洗信号达到平衡，并同时收集漂洗
液，取样留做电泳样品(标记wash)；

[0075] (5)层析柱初次洗脱：漂洗结束后，取洗脱液1(50mM Tris，350mM NaCl，5mM β‑ME，50mM imidazole，pH8.0)按6mL/min流速洗脱，并同时收集样品洗脱液1至信号达到平衡，取
样留做电泳样品(标记E1)；

[0076] (6)层析柱二次洗脱：初洗结束后，取洗脱液2(50mM Tris，350mM NaCl，5mM β‑ME，100mM imidazole，pH8.0)按6mL/min流速洗脱，并同时收集样品洗脱液2至信号达到平衡，
取样留做电泳样品(标记E2)；

[0077] (7)层析柱三次洗脱：二洗结束后，取洗脱液3(50mM Tris，350mM NaCl，5mM β‑ME，250mM imidazole，pH8.0)按6mL/min流速洗脱，并同时收集样品洗脱液3至信号达到平衡，
取样留做电泳样品(标记E3)；

[0078] (8)层析柱四次洗脱：三洗结束后，取洗脱液4(50mM Tris，350mM NaCl，5mM β‑ME，500mM imidazole，pH8.0)按6ml/min流速洗脱，并同时收集样品洗脱液4至信号达到平衡，
取样留做电泳样品(标记E4)；

[0079] (9)层析结束后，取上述洗脱样品进行SDS‑PAGE电泳，观察Ni‑NTA纯化后目的蛋白所在洗脱液及其纯度，纯度要求达到95％以上。

[0080] 4、脱盐

[0081] (1)G‑25脱盐柱处理：取150mL G‑25脱盐柱固定后连接上下管路(上管路连接恒流泵，下管路连接紫外信号采集器)，用纯化水按10mL/min流速冲洗10个柱体积(去除层析柱
内的20％乙醇)，再用交换缓冲液(50mM Hepes，350mM NaCl，pH7.5)按6mL/min流速冲洗20
个柱体积，使信号达到平衡，进行校准处理。

[0082] (2)层析柱上样：取Ni‑NTA纯化后目的蛋白所在洗脱液按3mL/min流速上样(注意不要产生气泡)；

[0083] (3)层析柱洗脱：上样结束后，取交换缓冲液(50mM Hepes，350mM NaCl，pH7.5)按6ml/min流速洗脱，并同时根据信号值收集样品洗脱液；

[0084] (4)层析结束后，取上述洗脱样品进行SDS‑PAGE电泳，观察G‑25脱盐后目的蛋白纯度。

[0085] 5、超滤浓缩

[0086] (1)取G‑25脱盐后目的蛋白溶液，并根据目的蛋白分子量(25kDa)选取截留规格10KDa的超滤管进行超滤浓缩；

[0087] (2)超滤参数为12000rpm，4℃离心20mins；

[0088] (3)超滤浓缩后需要用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自索莱宝，货号:PC0020)测定蛋白浓度，经测定蛋白浓度为3.0mg/ml。

[0089] 实施例3

[0090] 单链脱氧核糖核酸与ProA/G‑dRep融合蛋白连接测试

[0091] 1、单链脱氧核糖核酸制备

[0092] (1)根据文献(J.Am.Chem.Soc.2017，139，7030‑7035)所述，dRep所识别的特异性单链脱氧核糖核酸序列为：5’‑AAGTATTACCAGAAA‑3’(SEQ ID No.5，简称为dRep ssDNA，下
划线处代表dRep特异性识别切割及连接该单链脱氧核糖核酸位点，分子量约为4.655kD)；

[0093] (2)将上述脱氧核糖核酸序列发至上海生工合成，合成后加入100mM NaCl溶液溶解至100μM浓度，‑30℃冻存备用。

[0094] 2、单链脱氧核糖核酸连接测试

[0095] (1)取ProA/G‑dRep溶液、dRep ssDNA按下表进行连接反应，连接反应体系如表1所示：

[0096] 表1连接反应体系

[0097]

[0098] (2)反应结束后，加入SDS‑PAGE 5×loading buffer，混匀后进行SDS‑PAGE电泳，通过观察ProA/G‑dRep(分子量25kD)与ProA/G‑dRep‑ssDNA conjugate(分子量约30kD)的
分子量区别来判断连接测试。如图3所示，经过反应后能够生成ProA/G‑dRep‑ssDNA‑
conjugate，本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白能够连接单链脱氧核糖核酸。

[0099] 实施例4

[0100] 抗体(IgG)亲和连接测试

[0101] Western blot测试

[0102] (1)取ProA/G蛋白进行SDS‑PAGE电泳，上样量为60μg；

[0103] (2)转膜：将电泳凝胶取下，除去积层胶和多余部分，在转膜缓冲液中浸泡；剪取和胶大小相等的4张滤纸和1张PVDF膜，用铅笔在膜的一角做一标记。将PVDF膜依次在100％甲
醇中泡约1min，ddH2O中泡2min，之后在转膜缓冲液中浸泡。将转移装置的阴极板放平，放一
层用转膜缓冲液浸泡过的海绵，在海绵上整齐地放两层转膜缓冲液浸泡过的滤纸，用玻璃
棒赶出气泡。将凝胶平放于滤纸上，精确对齐滤纸，赶尽气泡。将处理好的PVDF膜放在凝胶
上，做标记的一面朝下。将剩下的两张浸泡过的滤纸整齐地放在PVDF膜上，同样保证没有气
泡。最后放一层转膜缓冲液浸泡过的海绵，将阳极板覆盖在海绵上，夹紧夹子。将装置置于
电转槽中，加满预冷的转膜缓冲液，接通电源，200mA电转1.5h。

[0104] (3)封闭：将电转好的PVDF膜取出用TBST缓冲液洗一遍，用5％milk/TBST室温摇床封闭1h。

[0105] (4)洗涤：用TBST漂洗2min。

[0106] (5)一抗(分别为小鼠IgG1，购自于碧云天，货号A7028；兔IgG，购自于武汉普健，货号ATA8001；绵羊IgG，购自于ABCam，货号ab6795；人IgG，购自于ABCam，货号ab91102)和靶蛋
白结合：用1％BSA/PBST(sigma)按推荐稀释比(1:1000)稀释一抗，用杂交袋将膜封闭起来，
4℃冰箱过夜。

[0107] (6)洗涤：用PBST洗涤3次，每次10min。

[0108] (7)二抗(分别为HRP标记山羊抗小鼠二抗，HRP标记山羊抗兔二抗，HRP标记兔抗绵羊二抗，HRP标记山羊抗人二抗，均购自于武汉三鹰)和一抗温育：将PVDF膜放入用5％milk/
PBST(sigma)稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1:1000)中，室温摇床孵育1h。

[0109] (8)洗涤：用PBST洗涤3次，每次10min。

[0110] (9)显色：取等量的Enhanced  Luminol  Reagent和Oxidizing Reagent(thermofisher)，用5ml 30％ddH2O稀释，混匀后滴加在封口膜上。将PVDF膜的正面朝下接
触发光试剂，显色1.5～2.0min，将PVDF翻转过来，用凝胶成像系统观察结果。如图3所示，
ProA/G‑dRep能够与小鼠、兔、绵羊及人来源的IgG结合，且在同等条件下亲和力接近，本发
明所述ProA/G‑dRep融合蛋白能够连接抗体。

[0111] 实施例5

[0112] 免疫‑聚合酶链式反应应用于肌红蛋白检测

[0113] 组份1：肌红蛋白单克隆抗体1‑单链脱氧核糖核酸共缀物构建

[0114] (1)取ProA/G‑dRep融合蛋白与ssDNA‑1(AAGTATTACCAGAAACATCCATCCTTATCAACTA，SEQ ID No.6)反应生成ProA/G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物，反应体系如表1所示。

[0115] (2)反应结束后，利用包被了ssDNA‑1互补序列的ssDNA‑2(TAGTTGATAAGGATGGATGTM
TTTCTGGTAATACTT，SEQ ID No.7)的磁珠(ThermoFisher Dynabeads M‑270 Carboxylic 
Acid)去除未发生连接反应的ProA/G‑dRep融合蛋白，并使用Tte UvrD解旋酶(购自于NEB，
货号#M1202S)解开互补双链，洗脱ProA/G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物和未发生连接的ssDNA1；

[0116] (3)再利用Ni‑NTA层析亲和连接ProA/G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物，去除未发生连接反应的ssDNA‑1和Tte UvrD解旋酶，并使用500mM的高浓度咪唑洗脱及G‑25脱盐后获得纯化后
的ProA/G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物；

[0117] (4)取纯化后的ProA/G‑dRep‑ssDNA‑1共缀物与肌红蛋白单克隆抗体1(Myo mAb1，购自于菲鹏生物，货号MYO‑03)按下表进行亲和反应，制备获得肌红蛋白单克隆抗体1‑单链
脱氧核糖核酸共缀物，即Myo mAb1‑ssDNA‑1共缀物，亲和反应体系见表2：

[0118] 表2亲和反应体系

[0119]

[0120] 组份2：肌红蛋白单克隆抗体2(Myo mAb2)与磁珠的偶联方法

[0121] (1)取200μL的羧基磁珠(ThermoFisher DynabeadsTMM‑270 Carboxylic Acid)加入1个2mL的离心管中，磁分离3min，然后去上清；

[0122] (2)向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次；

[0123] (3)向离心管中同时加入100μL的50mg/mL EDC，和100μL的50mg/mL NHS震荡混匀；

[0124] (4)将两个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积的0.02M MES清洗两次，去上清；

[0125] (5)在离心管中加入80μg的Myo mAb2，其中Myo mAb2是组分1中Myo mAb1的配对抗体，300μL的0.02M MES，偶联2h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。

[0126] (6)再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。

[0127] (7)用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30mL的磁珠保存液中保存待用。

[0128] 组份3：环状脱氧核糖核酸反应液的制备方法

[0129] (1)由上海生工合成Circular DNA的单链DNA序列(TAGTTGATAAGGAATCAAAGCAGCCAGGAGCAAACTCTTGGTACAGC，SEQ  ID  No.8)与对应的环状连接序列linker
(TCCTTATCAACTAGCTGTACCA，SEQ ID No.9)分别溶解于TE缓冲液(10mM Tris‑HCl pH8.0，
100mM NaCl，1mM EDTA)中；

[0130] (2)分别取等体积的Circular DNA和linker混合，置于95℃加热5min，然后室温冷却；

[0131] (3)在上述混合液中加入T4 DNA ligase及ligase buffer(Takara)，置于37℃反应2h。反应结束后置于65℃加热5min，使T4 DNA ligase失活；

[0132] (4)在上述反应液中加入ExoI(Takara)和ExoIII(Takara)，置于37℃反应过夜，降解未发生连接反应的linker。反应结束后置于85℃加热20min，使ExoI和ExoIII失活；

[0133] (5)最后用乙醇沉淀法纯化得到环状脱氧核糖核酸Circular DNA，并按下表3制备反应液：

[0134] 表3反应液组分

[0135]

[0136] 组份4：用于信号输出的单链脱氧核糖核酸探针合成

[0137] 由上海生工合成用于信号输出的单链脱氧核糖核酸探针Signal  DNA(GGAGCAAACTCTTGGTCTTC，SEQ ID No.10)，溶解于TE缓冲液中。

[0138] 该Signal DNA能够与经滚环扩增后的长链DNA互补并结合形成双链DNA，SYBGreen I能够嵌入双链DNA结构中并呈现荧光。

[0139] 肌红蛋白抗原检测方法

[0140] (1)取10μl不同浓度的肌红蛋白抗原(0.1、1、5、10、50、100、500、1000、5000ng/ml)蛋白溶液，与50μl组份1和50μl组份2混匀后在37℃条件下反应5min，然后通过磁分离弃去
上清，并用PBS溶液反复漂洗3次；

[0141] (2)分别加入50μl组份3和10μl组份4，混匀后在37℃条件下恒温扩增15min后，检测荧光强度并获得标准曲线，结果见表4和图5。

[0142] 表4绘制标准曲线原始数据

[0143]

[0144] 由表4和图5记载的可知，利用本发明所述ProA/G‑dRep融合蛋白构建的抗体‑核酸共缀物(ssDNA‑Antibody conjugate，图2)，可用于检测0.1～5000ng/ml浓度范围内的肌红
蛋白，标准曲线为：y＝640.77x‑101.2，相关系数为r＝0.9979。

[0145] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护
范围应该以权利要求书所界定的为准。