本发明涉及核酸极短PCR扩增方法、检测方法及应用。该扩增方法包括，使用引物对及用于扩增的模板分子，通过PCR扩增从样品中核酸分子制造含有特定碱基序列的扩增产物；引物对包括pg引物和ph引物，pg引物为长度小于14nt且5’端经磷酸基团修饰的单链DNA分子。本发明提供的核酸扩增方法对检测的靶目标放大，再结合PfAgo编程酶特异性酶切，实现了核酸的快速检测，灵敏度可以达到1aM，并且具有优异的特异性和单碱基专一性。
1.一种核酸检测的方法，所述核酸检测的方法为非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，包括以下步骤：S0、一种核酸极短PCR扩增的方法，使用引物对及用于扩增的模板分子，通过PCR扩增从样品中核酸分子制造含有特定碱基序列的扩增产物；
其中，所述引物对包括pg引物和ph引物，所述pg引物为长度小于等于14nt且5’端经磷酸基团修饰的单链DNA分子,所述引物对是根据目的基因的单核苷酸多态性位点而设计，所述pg引物和所述ph引物长度均在11nt 14nt之间，所述pg引物和所述ph引物的Tm值均小于~
40℃；所述模板分子为单链DNA分子和双链DNA分子中的至少一种；扩增条件为70 ℃ 1s、40 ℃ 1s，30 50个循环；
S1、利用上述核酸极短PCR扩增的方法扩增目标样品，得到长度大于15nt的核酸扩增产物；
S2、在含有PfAgo酶和分子信标的反应体系中，利用所述核酸扩增产物介导PfAgo酶切割分子信标，检测切割过程中产生的荧光信号，以获取所述目标样品中核酸分子的荧光值；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2步骤在如下反应体系下进行：PfAgo酶，2 µl，
其中，10×PfAgo反应缓冲液配方为：20 mM HEPES (pH7.5)、250 mM NaCl和0.5 mM MnCl2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，目标核酸分子能够为单链DNA分子ssDNA，来自SARS‑CoV‑2的单链DNA分子ssDNA‑OS2，来自MERS的单链DNA分子ssDNA‑OM，来自SARS‑CoV的单链DNA分子ssDNA‑OS，来自SARS‑CoV‑2的单核苷酸多态性位点的单链DNA分子nt8782C、nt8782T、nt28144T和nt28144C，来自VP72基因的VP72分子和来自HPV16的L1基因的DNA分子中的至少一种；
其中，ssDNA1、ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM、ssDNA‑OS、nt8782C、nt8782T，nt28144T、nt28144C、VP72和L1对应的序列依次为：ssDNA1：
5’‑AGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGCAATGGCGGTGATGCTGCTC‑3’，如SEQ ID NO.1所示；
5’‑ACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCG‑3’，如SEQ ID NO.2所示；
5’‑AGCAGCACTGCCCCAATCTAAAGATTCCAAT‑3’，如SEQ ID NO.3所示；
5’‑ACCCTTGATGCAGTCTGCGGATGCATCAACG‑3’，如SEQ ID NO.4所示；
5’‑ACTACCACCACGCTGGCTAAACCATGTGTCA‑3’，如SEQ ID NO.5所示；
5’‑ACTACCACCACGCTGACTAAACCATGTGTCA‑3’，如SEQ ID NO.6所示；
5’‑GCAATTAATTGTAAAAGGTAAACAGGAAACTGTAT‑3’，如SEQ ID NO.7所示；
5’‑GCAATTAATTGTAAAAGGTGAACAGGAAACTGTAT‑3’，如SEQ ID NO.8所示；
5’‑CTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACC‑3’，如SEQ ID NO.9所示；
5’‑AAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATAC‑3’，如SEQ ID NO.10所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，ssDNA1、ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM、ssDNA‑OS、nt8782C/T、nt28144C/T、VP72和L1靶向序列对应的引物依次为：pg1：5’P‑CCATTGCCAGC‑3’，如SEQ ID NO.11所示；
ph1：5’CTTCTCCTGCTAGA‑3’，如SEQ ID NO.12所示；
OS2‑pg：5’P‑GCTTCAGTCAG‑3’，如SEQ ID NO.13所示；
OS2‑ph：5’ATTGTGCATCAG‑3’，如SEQ ID NO.14所示；
OM‑pg：5’P‑ACTGCCCCAAT‑3’，如SEQ ID NO.15所示；
OM‑ph：5’TGGAATCTTTAG‑3’，如SEQ ID NO.16所示；
OS‑pg：5’P‑GATGCAGTCTG‑3’，如SEQ ID NO.17所示；
OS‑ph：5’TTGATGCATCCG‑3’，如SEQ ID NO.18所示；
8782pg：5’P‑CACATGGTTTAG‑3’，如SEQ ID NO.19所示；
8782ph：5’TACCACCACGCT‑3’，如SEQ ID NO.20所示；
28144pg：5’P‑CAGTTTCCTGT‑3’，如SEQ ID NO.21所示；
28144ph：5’TTAATTGTAAAAGG‑3’，如SEQ ID NO.22所示；
VP72‑pg：5’‑TGCCTCCGTAG‑3’，如SEQ ID NO.23所示；
VP72‑ph：5’‑ACATACCCTTCCA‑3’，如SEQ ID NO.24所示；
L1‑pg: 5’‑ACCACAGTTATG‑3’，如SEQ ID NO.25所示；
L1‑ph: 5’‑ TTTGCAGCTCTG‑3’，如SEQ ID NO.26所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，ssDNA1、ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM、ssDNA‑OS、nt8782C、nt8782T、nt28144T、nt28144C、VP72和L1靶向序列对应的分子信标依次为：MB1：
5’‑6‑FAM‑cgcaccCTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.27所示；
5’‑6‑FAM‑cgcaccGTGCATCAGCTGACTGAAGCggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.28所示；
5’‑6‑FAM‑cgcaccACTGCCCCAATCTAAAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.29所示；
5’‑6‑FAM‑cgcaccGATGCAGTCTGCGGATggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.30所示；
5’‑6‑FAM‑cgcaccCGCTGGCTAAACCATGTGTCggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.31所示；
5’‑VIC‑cgcaccCGCTGACTAAACCATGTGTCggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.32所示；
5’‑6‑FAM‑cgcaccAAGGTAAACAGGAAACTGTAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.33所示；
5’‑VIC‑cgcaccAAGGTGAACAGGAAACTGTAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.34所示；
5’‑VIC‑cgcaccTTCCACTACGGAGGCAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.35所示；
5’‑6‑FAM‑cgcaccATGCACAGAGCTGCAAACAAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.36所示。
核酸极短PCR扩增的方法、检测方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及一种核酸极短PCR扩增的方法、检测方法及应用。
背景技术
[0002] 核酸作为遗传信息的载体，提供了大量的生物学信息，核酸检测（NAD）已应用到许多疾病诊检测中，尤其是对于传染病的突然爆发，核酸检测可以迅速确定感染。因此，人们一直追求快速，高度灵敏和高度特异性的核酸检测方法。目前，最常见的核酸检测方法仍然是PCR及其一些衍生方法，因为它具有很高的灵敏度，例如qPCR，ddPCR等。但是在应用过程中也发现一些不足，比如qPCR和ddPCR一般要2‑4小时左右耗时较长，对荧光定量PCR仪和数字PCR仪等昂贵仪器的的依赖性较高等。虽然已经有多种优良的核酸检测的方法，但人们仍然致力于从时间，灵敏度，特异性，成本，多样性和其他方面开发新的检测方法。
发明内容
[0003] 有鉴于此，本发明利用Taq DNA聚合酶进行极短PCR的扩增的方法，能够快速获得能够介导PfAgo编程酶特异性酶切分子信标的介导产物，为其荧光定量检测提供了高效扩增和酶切的基础。
[0004] 本发明提供一种核酸极短PCR扩增的方法，使用引物对及用于扩增的模板分子，通过PCR扩增从样品中核酸分子制造含有特定碱基序列的扩增产物；
[0005] 其中，所述引物对包括pg引物和ph引物，所述pg引物为长度小于等于14nt且5’端经磷酸基团修饰的单链DNA分子。
[0006] 具体的，所述引物对是根据目的基因的单核苷酸多态性位点而设计，所述pg引物和所述ph引物长度均在11nt 14nt之间，所述pg引物和所述ph引物的Tm值均小于40℃。~
[0007] 其中，所述模板分子为单链DNA分子和双链DNA分子中的至少一种。
[0008] 具体的，扩增条件为70 ℃ 1s、40 ℃ 1s，40 50个循环。~
[0009] 本发明还提供一种核酸检测的方法，包括以下步骤：
[0010] S1、利用上述核酸极短PCR扩增方法扩增目标样品，得到长度大于15nt的扩增产物；
[0011] S2、在含有PfAgo酶和分子信标的反应体系中，利用所述核酸扩增产物介导PfAgo酶切割分子信标，检测切割过程中产生的荧光信号，以获取所述目标样品中核酸分子的荧光值；
[0012] S2步骤中，所述pg引物与所述分子信标互补。
[0013] 具体的，S2步骤在如下反应体系下进行：
[0014] PfAgo酶，2 µl，
[0015] 分子信标，1 µl，
[0016] 10×PfAgo反应缓冲液，1 µl，
[0017] 所述S1步骤扩增产物，5 µl，
[0018] 加ddH2O至10µl；
[0019] 反应条件为：95 ℃、30min；
[0020] 其中，10×PfAgo反应缓冲液配方为：20 mM HEPES (pH7.5)、250 mM NaCl和0.5 mM MnCl2。
[0021] 所述目标核酸分子可为单链DNA分子ssDNA，来自SARS‑CoV‑2的单链DNA分子ssDNA‑OS2、来自MERS的单链DNA分子ssDNA‑OM，来自SARS‑CoV的单链DNA分子ssDNA‑OS，来自SARS‑CoV‑2的单核苷酸多态性位点的单链DNA分子nt8782C、nt8782T、nt28144T和nt28144C，来自VP72基因的VP72分子和来自HPV16的L1基因的DNA分子中的至少一种；
[0022] 其中，ssDNA1、ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM、ssDNA‑OS、nt8782C、nt8782T、nt28144T、nt28144C、VP72和L1对应的序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
[0023] 具体的，ssDNA1、ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM、ssDNA‑OS、nt8782C/T、nt28144C/T、VP72和L1靶向序列对应的引物依次如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。
[0024] 具体的，ssDNA1、ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM、ssDNA‑OS、nt8782C，nt8782T，nt28144T、nt28144C、VP72和L1靶向序列对应的分子信标序列依次如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示。
[0025] 有益效果：
[0026] 通过本发明提供的核酸扩增方法对检测的靶目标放大，再结合PfAgo编程酶特异性酶切，实现了核酸的快速检测，能够实现临床样本中SARS‑CoV‑2和HPV16的检测。其检测灵敏度可以达到1aM，并且具有好的特异性和单碱基专一性，整个时长不超过1h。
附图说明
[0027] 图1为本发明实施例提供的核酸极短扩增方法流程示意图。
[0028] 图2为本发明实施例提供的核酸极短扩增过程中变性温度和退火/延伸温度的探究图。
[0029] 图3为本发明实施例提供的核酸极短扩增过程中变性时间和退火/延伸时间的探究图。
[0030] 图4为本发明实施例提供的核酸极短扩增过程中引物用量比的TBE凝胶电泳结果图。
[0031] 图5为本发明实施例提供的核酸极短扩增过程中是PfAgo切割分子信标的荧光检测结果图；
[0032] 图6为本发明实施例提供的核酸极短扩增过程中的引物浓度和循环数的TBE凝胶电泳结果图（pg引物和ph引物在0.7uM/0.35uM、1.4uM/0.7uM、3.5uM/1.75uM和7uM/3.5uM的浓度比例，及分别在20、30、40、50、60、70个循环数下的扩增结果，M表示产物Marker泳道）。
[0033] 图7为本发明实施例提供的核酸极短扩增过程中的引物浓度和循环数的荧光检测结果图（pg引物和ph引物在0.7uM/0.35uM、1.4uM/0.7uM、3.5uM/1.75uM和7uM/3.5uM的浓度比例，及分别在20、30、40、50、60、70个循环数下的扩增结果）。
[0034] 图8为本发明实施例提供的usPCR结合PfAgo的核酸检测方法特异性验证图；图中左方为usPCR特异性扩增的结果图，右方为相应的图A的PfAgo酶切产生的荧光值的结果图。
[0035] 图9为本发明实施例提供的usPCR结合PfAgo的核酸检测方法灵敏度验证的荧光值结果图。
[0036] 图10为本发明实施例提供的usPCR结合PfAgo的核酸检测方法单碱基专一性验证的荧光值结果图。
[0037] 图11为本发明实施例提供的usPCR结合PfAgo检测HPV16L1阳性标准品结果图；其中图A为对阳性标准品的扩增结果图，图B为对阳性标准品的PfAgo检测结果图。
[0038] 图12为本发明实施例提供的usPCR结合PfAgo检测对3个HPV实际临床样品检测结果图。
[0039] 图13为本发明实施例提供的usPCR结合PfAgo检测SASR‑CoV‑2阳性标准品的结果图；其中图A为对阳性标准品的扩增结果图，图B为对阳性标准品的PfAgo检测结果图。
[0040] 图14为本发明实施例提供的usPCR结合PfAgo检测4个实际临床样品SARS‑CoV‑2的结果图。
具体实施方式
[0041] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0042] 本发明旨在利用TaqDNA聚合酶扩增极短DNA片段（µltrashort DNA，µsDNA，Tm<70℃），通过优化扩增条件，发明了名为极短PCR（ultrashort PCR，usPCR）的扩增方法，该方法需要更短的引物（11nt‑14nt），因此整个扩增循环反应采用两步法，在70℃（变性）和40℃（退火/延伸）之间完成，以实现快速获得目标产物的目的。
[0043] 为了更方便的检测扩增产物，本发明在扩增过程中引入了一个长度小于等于14nt的5’磷酸基团修饰的引物(命名为pg)和一个5’羟基化的引物（命名为ph)，使得最终usPCR产物由一条5’P链和一条5’OH链组成，长度大于15个碱基，而5’P链可以作为PfAgo核酸编辑酶的核酸向导介导PfAgo切割分子信标产生荧光信号，实现核酸检测目的。其中，PfAgo核酸编辑酶是一种仅结合15nt以上的DNA向导后才能被激活切割活性的原核Argonaute蛋白。
[0044] 本发明将usPCR与PfAgo的切割特性相结合，发明了一种既省时又经济的核酸检测方法，称为USPCRP。结果表明，USPCRP能检测单链DNA和双链DNA，具有序列特异性，可以实现aM灵敏度和单碱基突变的检测。最后，分别对对3份人乳头瘤病毒感染的临床样本中的HPV16L1基因和疑似四份新冠病毒感染的临床样本进行了检测，证明USPCR在临床应用上的可行性。
[0045] 实施例1 usPCR扩增和PfAgo酶切的结合
[0046] 本发明是这样实现的：利用Taq DNA聚合酶进行极短PCR的扩增的方法，命名为usPCR，通过对扩增温度、循环数、引物浓度和核酸种类的优化来确定扩增条件，并要求其扩增产物可以介导PfAgo切割分子信标用于核酸检测，其方法流程如图1所示，具体包括以下步骤：
[0047] 1、靶DNA合成
[0048] 随机合成单链DNA(ssDNA1)作为可行性验证的靶DNA，合成相应的SARS‑CoV‑2的单链DNA（ssDNA‑OS2）。
[0049] 同源的来自MERS的单链DNA（ssDNA‑OM）和SARS‑CoV的单链DNA（ssDNA‑OS）作为特异性验证的靶DNA。
[0050] 合成来自SARS‑CoV‑2的单核苷酸多态性位点nt8782（C/T）和nt28144（T/C）的单链DNA（nt8782C，nt8782T，nt28144T，nt28144C）作为验证单碱基专一性的靶DNA。
[0051] 构建包含待检测靶VP72基因和HPV16L1基因的质粒DNA（分别为pUC19‑VP72和pUC19‑HPV16L1）作为灵敏度探究的靶DNA。
[0052] 具体的，ssDNA1、ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM、ssDNA‑OS、nt8782C、nt8782T、nt28144T、nt28144C、VP72和L1对应的序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
[0053] 2、引物对
[0054] 靶DNA合成相应的引物对，其中一引物5’端被磷酸基团修饰，命名为pg，另一不修饰命名为ph。为保证磷酸化的引物不能够介导PfAgo的切割，要求合成的引物长度小于等于14nt，Tm<40℃，为保证不产生非特异性扩增，要求引物之间没有重叠，因此pg和ph长度在
11nt 14nt，预期目标产物长度在22nt 30nt，Tm<65℃，能够使扩增时间显著降低。
~ ~
[0055] 具体的，ssDNA1、ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM、ssDNA‑OS、nt8782C/T、nt28144C/T、VP72和L1靶向序列对应的引物依次为pg1/ph1、OS2‑pg/OS2‑ph、OM‑pg/OM‑ph、OS‑pg/OS‑ph、8782pg/8782ph、28144pg/28144ph、VP72‑pg/VP72‑ph和L1‑pg/L1‑ph，相应引物对序列依次如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。
[0056] 3、usPCR的可行性验证
[0057] 以上述合成的靶DNA为模板，根据上述设计对应设计的引物，利用Taq DNA聚合酶进行常规PCR扩增，扩增产物分别进行TBE核酸凝胶电泳检测、Sanger测序验证和介导PfAgo切割分子信标(MB1)。
[0058] 4、usPCR扩增条件探究
[0059] 1)探究usPCR扩增的变性温度和退火/延伸温度，以ssDNA‑OS2为模板，在Taq酶反应体系中加入相应的引物(和2×Taq PCR MIX，分别在90℃、80℃、70℃、60℃的变性温度和30℃、40℃、50℃的退火/延伸温度下进行循环扩增，循环数为50，得到的产物进行TBE核酸凝胶电泳检测。如图2结果表明usPCR的变性温度设置为70℃较合适，退火/延伸温度设置为
40℃较合适。
[0060] 2)探究usPCR的变性时间和退火/延伸时间，以ssDNA‑OS2为模板，在Taq酶反应体系中加入相应的引物和2×Taq PCR MIX，以步骤四探究确定的反应温度，分别进行70℃ 1s、40℃（1s、2s、5s、10s）和70℃（1s、2s、5s、10s）、40℃ 1s的循环，循环数为50，得到的产物进行TBE核酸凝胶电泳检测。如图3中，横线上方为变形时间、下方为退火/延伸时间，结果表明变性时间和退火/延伸时间均短至1s即可扩增出目的条带。
[0061] 3)探究usPCR的引物比例，为了获得更多的可用于介导PfAgo切割的DNA 向导，采用不对称PCR的策略，以ssDNA‑OS2为模板，根据步骤四探究确定的反应温度和步骤五探究的循环时间，固定ph的浓度为0.35uM，增加pg的浓度分别为0.35 uM、0.7 uM、1.75 uM、3.5 uM、7 uM，分别以不加ph作为对照，然后在70℃ 1s，40℃ 1s条件下进行50个循环数的扩增。扩增产物一部分用于TBE核酸凝胶电泳检测，一部分用于介导PfAgo切割分子信标。分子信标的荧光信号用荧光定量PCR仪检测。结果如图4、5所示，表明不同比例的pg和ph的反应体系扩增后均能产生目的条带，当pg和ph的浓度比为2:1时介导PfAgo切割分子信标产生的荧光值最大。
[0062] 4)探究usPCR的引物浓度和循环数，根据步骤四探究确定的反应温度、步骤五探究的循环时间和步骤六确定的引物比，以ssDNA‑OS2为模板，分别在Taq PCR反应体系中加入终浓度为0.7 uM、1.75 uM、3.5 uM或7 uM的pg及终浓度为0.35 uM、0.7 uM、1.75 uM或3.5 uM的ph，和，分别以不加模板为对照，然后在70℃ 1s，40℃ 1s条件下分别进行20、30、40、50、60、70个循环数的扩增，扩增产物一部分用于TBE核酸凝胶电泳检测，一部分用于介导PfAgo切割分子信标。分子信标的荧光信号用荧光定量PCR仪检测。结果如图6和图7，在pg/ph浓度为0.7 uM/0.35 uM、1.4uM/0.7 uM、3.5 uM/1.75 uM和7 uM/3.5 uM时，循环数不低于30时能产生明显的产物条带，因此选择不低于30个循环数作为实验条件。
[0063] 所述usPCR最终扩增条件：70 ℃ 1s、40 ℃ 1s，30‑50个循环。具体，可采用如下usPCR扩增体系进行，如下表：
[0064] 表1 usPCR扩增体系
[0065]
[0066] 5、usPCR结合PfAgo的核酸检测方法特异性验证
[0067] 分别以合成的同源性较高的分别来自SRAS‑CoV‑2，MERS‑CoV，SARS‑CoV ORF1ab基因的单链DNA ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM和ssDNA‑OS为模板，并分别用特异性的引物进行usPCR扩增，扩增产物用于TBE核酸凝胶电泳检测。同时对用特异性扩增SARS‑CoV‑2单链DNA模板的产物来介导PfAgo切割特异性的分子信标，分子信标的荧光信号用荧光定量PCR仪检测。具体如：
[0068] 1）、NCBI上分别查找SARS‑CoV‑2、MERS‑CoV和SARS‑CoV基因组的ORF1ab基因，分别合成与上述实施例中选取的ssDNA‑OS2、ssDNA‑OM和ssDNA‑OS作为靶DNA。
[0069] 2）、用SARS‑CoV‑2作为扩增引物，进行usPCR扩增；
[0070] 3）、扩增产物分别介导PfAgo切割检测SARS‑CoV‑2的分子信标后用荧光定量PCR仪测得，结果如图8所示，仅有来自SARS‑CoV‑2的ORF1ab基因的样品被扩增出，并介导PfAgo酶切产生大于空白对照的荧光值（p<0.01，差异显著），来自MERS‑CoV和SARS‑CoV基因的样品不能被特异性的SARS‑CoV‑2的扩增引物和分子信标检测到，表明本发明用于检测SARS‑CoV‑2的试剂盒具有良好的特异性。
[0071] 对应的，所述荧光基团标记的分子信标序列为：
[0072] MB1：
[0073] 5’‑6‑FAM‑cgcaccCTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.27所示；
[0074] MB‑OS2：
[0075] 5’‑6‑FAM‑cgcaccGTGCATCAGCTGACTGAAGCggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.28所示；
[0076] MB‑OM：
[0077] 5’‑6‑FAM‑cgcaccACTGCCCCAATCTAAAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.29所示；
[0078] MB‑OS：
[0079] 5’‑6‑FAM‑cgcaccGATGCAGTCTGCGGATggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.30所示；
[0080] MB‑8782C：
[0081] 5’‑6‑FAM‑cgcaccCGCTGGCTAAACCATGTGTCggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.31所示；
[0082] MB‑8782T：
[0083] 5’‑VIC‑cgcaccCGCTGACTAAACCATGTGTCggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.32所示；
[0084] MB‑28144T：
[0085] 5’‑6‑FAM‑cgcaccAAGGTAAACAGGAAACTGTAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.33所示；
[0086] MB‑28144C：
[0087] 5’‑VIC‑cgcaccAAGGTGAACAGGAAACTGTAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.34所示；
[0088] MB‑VP72：
[0089] 5’‑VIC‑cgcaccTTCCACTACGGAGGCAggtgcg‑BHQ1‑3’，如SEQ ID NO.35所示；
[0090] MB‑L1:
[0091] 5’‑6‑FAM‑cgcaccATGCACAGAGCTGCAAACAAggtgcg‑BHQ1‑3’’，如SEQ ID NO.36所示。
[0092] 其中，usPCR产物介导PfAgo切割分子信标的体系如下表：
[0093] 表2 usPCR产物介导PfAgo切割分子信标的体系试剂 体积 终浓度
PfAgo 2 µl 20 pmol
分子信标 1 µl 10 pmol
10×PfAgo反应缓冲液 1 µl 1×
usPCR产物 5 µl ‑‑
无菌水 补至10 ul ‑‑
[0094] 所述PfAgo酶切的反应条件为：95℃ 30min。表2中，所述10×PfAgo反应缓冲液配方为：20 mM HEPES (pH7.5), 250 mM NaCl, and 0.5 mM MnCl2。
[0095] 所述荧光值判断方法：
[0096] 在减去背景值（单独分子信标测量产生的数值）后，若检测样品荧光值大于空白对照荧光值，则证明样品中含有目标核酸，若检测样品荧光值小于或等于空白对照照荧光值，则证明样品中不含有目标核酸。
[0097] 6、usPCR结合PfAgo的核酸检测方法灵敏度验证
[0098] 将上述获得的pUC19‑VP72质粒分别稀释至10 fM，1 fM，100 aM，10 aM，1 aM，0 aM然后用相应的引物进行usPCR扩增，扩增条件为70℃ 1s、40℃ 1s，共50个循环，其中0 aM作为空白对照。产物通过介导PfAgo切割分子信标来判断是否存在模板，分子信标的荧光信号用荧光定量PCR仪检测。由图9可知，本发明的检测方法最低可以检测到1aM的靶DNA。
[0099] 7、usPCR结合PfAgo的核酸检测方法单碱基专一性验证
[0100] 检测nt8782C/T位点时，分别以nt8782C和nt8782T为模板进行usPCR扩增，扩增产物介导PfAgo同时切割不同荧光基团标记的分子信标MB‑8782C和MB‑8782T，分子信标的荧光信号用荧光定量PCR仪检测。检测nt28144T/C位点的方法同nt8782C/T位点一致。由图10可知，nt8782C的扩增产物只能介导PfAgo切割MB‑8782C, nt8782T的扩增产物只能介导PfAgo切割MB‑8782T，同样的对于nt28144也是一样，证明本发明的检测方法具有单碱基专一性，这是由于本发明提供的核酸极短PCR扩增方法中的引物是针对目的基因的单核苷酸多态性位点进行设计，从而使得其扩增产物具有介导PfAgo只能切割具有多态性位点的特定碱基的性能，而对于其他碱基无法进行切割，也就无法检出，因而可应用于基因单核苷酸多态性位点的检测。
[0101] 实施例2 利用（USPCR方法）检测HPV16
[0102] 1、NCBI上查找HPV16基因组L1基因的序列，并根据HPV16L1基因的序列设计相应的引物对，5’FAM标记和3’BHQ1标记的分子信标MB‑HPV16，其中一条与分子信标互补的引物5’端用磷酸基团修饰，命名为HPV16‑pg，另一条引物则命名为HPV16‑ph。
[0103] 2、准备确定含有HPV16L1基因的质粒（pUC19‑HPV16L1）的样品作为阳性标准品。
[0104] 3、准备三个从临床样品中提取的核酸样作为实测样品；实测样品来源于湖北文理学院医学院。
[0105] 4、利用第1步中设计的引物，参照上述实施例中的usPCR扩增条件对阳性标准品用HPV16L1基因引物进行usPCR扩增，以不加模板的样品作为空白对照。扩增产物一部分用于20%TBE核酸凝胶电泳分析，另一部分用于介导PfAgo靶向切割相应的分子信标，切割产物用荧光定量PCR仪测荧光，结果如图11。
[0106] 结果表明只有加入了阳性标准品，才能扩增出目的条带，并且加入阳性标准品的扩增产物介导PfAgo切割分子信标产生的荧光值显著高于空白对照（p<0.01, 说明差异显著）。
[0107] 5、利用第一步中设计的引物，参照实施例1 中的扩增条件对实测样品用HPV16L1基因引物进行usPCR扩增，以不加模板的样品作为空白对照。扩增产物用于介导PfAgo靶向切割相应的分子信标，切割产物用荧光定量PCR仪测荧光，结果如图12。
[0108] 三个实测样品中3号荧光值显著大于空白对照（p<0.01,说明差异显著），1，2号样品荧光值与空白对照相比有没有显著差异（p>0.05, 说明差异不显著），表明3号实测样品中含有HPV16基因，1，2号样品中不含有SARS‑CoV‑2基因组RNA，与普通PCR检测结果一致，如下表3所示。
[0109] 表3
[0110]
[0111] 实施例3 利用（USPCR方法）检测SARS‑CoV‑2
[0112] 1、NCBI上查找SARS‑CoV‑2基因组O基因的序列，并根据O基因的序列设计相应的引物对和5’FAM标记，3’BHQ1标记的分子信标MB‑OS2，其中一条与分子信标互补的引物5’端用磷酸基团修饰，命名为OS2‑pg，另一条引物则命名为OS2‑ph。
[0113] 2、准备确定含有SARS‑CoV‑2基因组RNA的样品作为阳性标准品，SARS‑Cov‑2基因组RNA来源于武汉疾控中心。
[0114] 3、准备四个从临床样品中提取的核酸样作为实测样品，实测样品来源于武汉疾控中心；
[0115] 4、利用第1步中设计的引物，参照上述实施例中的扩增条件对阳性标准品用orf1ab基因引物进行usPCR扩增，以不加模板的样品作为空白对照。扩增产物一部分用于20%TBE核酸凝胶电泳分析，另一部分用于介导PfAgo靶向切割相应的分子信标，切割产物用荧光定量PCR仪测荧光，结果如图13。结果表明只有加入了阳性标准品，才能扩增出目的条带，并且加入阳性标准品的扩增产物介导PfAgo切割分子信标产生的荧光值显著高于空白对照（p<0.01,说明差异显著）。
[0116] 5、利用第1步中设计的引物，参照上述实施例中的扩增条件对实测样品用orf1ab基因引物进行usPCR扩增，以不加模板的样品作为空白对照。扩增产物用于介导PfAgo靶向切割相应的分子信标，切割产物用荧光定量PCR仪测荧光，结果如图14。四个实测样品中1、2、3、号荧光值与空白对照相比有显著差异（p<0.01,说明差异显著）， 4号样品荧光值与空白对照相比有没有显著差异（p>0.05, 说明差异不显著），表明1，2，3号实测样品中含有SARS‑CoV‑2基因组RNA，4号样品中不含有SARS‑CoV‑2基因组RNA，与市场上RT‑qPCR试剂盒检测结果一致，如下表4；
[0117] 表4检测结果 样品编号 RT‑qPCR试剂盒 采用本发明方法的 试剂盒
1 阳性 阳性
2 阳性 阳性
3 阳性 阳性
4 阴性 阴性
[0118] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
