一种用于恩诺沙星灵敏检测的光电化学适配体传感器的构建方法转让专利
申请号 : CN202110013438.3
文献号 : CN112816639B
文献日 : 2023-04-11
发明人 : 王坤 , 王媛 , 郝楠 , 戴震
申请人 : 江苏大学
摘要 :
本发明提供了一种用于灵敏检测恩诺沙星(ENR)的光电化学传感器的构建方法，步骤如下：步骤1、制备溴化氧铋(Bi4O5Br2)纳米片；步骤2、制备氮杂溴化氧铋(N‑Bi4O5Br2)纳米复合物；步骤3、构建灵敏检测恩诺沙星(ENR)的光电化学传感器。与传统检测方法相比，本发明中所提出的ENR的光电化学检测方法具有操作更简便灵活，仪器设备更简单，检测范围宽，检出限低，检测成本低廉等特点。
权利要求 :
1.一种用于恩诺沙星灵敏检测的光电化学适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤如下：步骤1、溶剂热法制备溴化氧铋Bi4O5Br2纳米片：
首先，溴化铋BiBr3溶解在乙二醇中，搅拌下逐滴加入NaOH溶液，接着转入聚四氟乙烯高压釜中进行溶剂热反应，通过过滤洗涤离心回收固体产物，然后干燥获得Bi4O5Br2纳米片；
步骤2、煅烧法制备氮杂溴化氧铋N‑Bi4O5Br2纳米复合物：
首先将步骤1制得的Bi4O5Br2纳米片分别和不同质量的尿素均匀混合，在马弗炉中加热，得到的产物分别用二甲亚砜和蒸馏水洗涤干燥，获得不同掺杂含量的N‑Bi4O5Br2复合材料；
步骤3、构建灵敏检测恩诺沙星ENR的光电化学适配体传感器：
将步骤2制得的N‑Bi4O5Br2复合材料分散于N,N‑二甲基甲酰胺DMF中，得到N‑Bi4O5Br2分散液，将分散液滴涂于ITO电极上，再滴涂壳聚糖CS溶液，烘干后将戊二醛GA溶液滴于电极表面，并置于室温下反应完毕后，用磷酸缓冲溶液PBS淋洗；将ENR适配体滴加在电极上，反应一段时间后，用PBS淋洗，然后滴加牛血清蛋白BSA溶液，最终得到适配体修饰的材料电极，即用于恩诺沙星检测的光电化学适配体传感器。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1中，所述BiBr3与NaOH溶液的用量比为1.33g：12.6mL，其中，NaOH溶液的浓度为2mol/L；所述溶剂热反应的温度为140～160℃，反应时间为10～12h；离心速率为8000～9000rmp/s，离心时间为6～8min；干燥温度为50～60℃，干燥时间为10～12h。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中，所述N‑Bi4O5Br2中氮的质量百分含量为10％～50％；马弗炉设置温度为200～220℃，反应时间为3～5h。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述N‑Bi4O5Br2分散液为
2mg/mL；所述CS浓度为0.1％；GA浓度为2.5％，CS溶液的用量为10μL，GA溶液的用量为20μL，CS与GA反应时间为0.5～1h。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3中，ENR适配体序列为：5′‑NH2‑CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA‑3′；ENR适配体浓度为3μM，滴加量为20μL，反应时间10h；BSA浓度为3％；所述PBS浓度为
0.1mol/L,pH＝7.4，用量为10～20mL。
6.将权利要求1～5任一项所述构建方法构建的光电化学适配体传感器用于检测恩诺沙星的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，将不同浓度的ENR溶液滴到用于恩诺沙星检测的光电化学适配体传感器上，并孵育一段时间，以ITO电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，经过电化学工作站三电极系统，在氙灯光源的照射下按浓度依次进行光电分析。
8
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，ENR浓度分别为0.1～10ng/mL，滴加量为10～20μL；孵育温度为37℃；氙灯光源的强度为25％～100％。
说明书 :
一种用于恩诺沙星灵敏检测的光电化学适配体传感器的构建
方法
技术领域
[0001] 本发明属于电化学检测领域，指一种用于湖水中恩诺沙星检测的光电化学适配体传感器的构建方法及用途。
背景技术
[0002] 恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)是一种氟喹诺酮类抗生素，为畜禽和水产专用喹诺酮类抗菌药物，广泛用于人类活动。然而，水生环境中发现的ENR水平的增加会对人和牲畜的健康造成严重后果。欧盟委员会和中国农业部规定ENR及其活性代谢物环丙沙星在动物肌肉组织最大残留限量(MRLs)是100μg/kg，而美国的食品和药物管理局完全禁止在家禽中使用。目前已经开发了一些抗生素检测方法，包括高效液相色谱(HPLC)、液相色谱‑电喷雾电离‑串联质谱、比色、荧光等研究方法。虽然这些方法能够满足灵敏度与特异性检测的要求，但是在实际应用方面存在一定的局限性。例如，色谱法能够用于定性、定量检测，且检测结果相对准确、可靠，灵敏度高，重现性好，但是所用仪器设备昂贵，操作复杂，需要专业的技术人员，因而不适合大批量样品的处理和分析以及现场的快速检测。
[0003] 光电化学(PEC)技术，作为一种新兴的电分析技术，已经在众多领域受到了广泛的关注，例如生物领域、环境科学以及医药领域等。PEC传感技术作为一种新型的分析技术，具有很多在传统电化学平台上不能或者难以实现的优点。由于PEC是采用了两种不同形式的激发和检测信号，而且该技术背景信号低，因此具有更高的灵敏度。
[0004] 基于氮杂溴化氧铋(N‑Bi4O5Br2)纳米复合物作为光电活性材料，建立光电化学传感平台，用于湖水中恩诺沙星的光电化学检测还未见相关报道。
发明内容
[0005] 本发明旨在提供一种高灵敏度、高选择性、宽测量范围等优点为一体的光电化学适配体传感器。该传感器制备工艺简单，成本低，实现了快速定量检测ENR的目的。
[0006] 所采用的方案概括为：以制备的N‑Bi4O5Br2纳米复合物作为光电活性材料，创建超灵敏的光电化学传感平台。利用N‑Bi4O5Br2纳米复合物对可见光的较大吸收和快速响应等性质，对检测系统起到一个信号放大的作用。当加入目标物ENR，N‑Bi4O5Br2纳米复合物受到可见光的激发，产生的空穴对将ENR氧化，ENR的氧化产物能有效的阻止所产生的电子‑空穴对再复合，从而使得其光电流响应强度增强，建立光电流响应值与ENR浓度之间的关系，以达到对湖水中ENR含量快速、灵敏、有选择性的检测的目的。
[0007] 本发明是通过如下具体技术方案实现的：
[0008] 一种用于恩诺沙星(ENR)灵敏检测的光电化学适配体传感器构建的方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤1、溶剂热法制备溴化氧铋(Bi4O5Br2)纳米片：
[0010] 首先，溴化铋(BiBr3)溶解在乙二醇中，搅拌下逐滴加入NaOH溶液，接着转入聚四氟乙烯高压釜中进行溶剂热反应。通过过滤洗涤离心回收固体产物，然后干燥获得Bi4O5Br2纳米片。
[0011] 步骤2、制备氮杂溴化氧铋N‑Bi4O5Br2纳米复合物：
[0012] 将Bi4O5Br2纳米片分别和不同质量的尿素均匀混合，在马弗炉中加热，得到的产物分别用二甲亚砜和蒸馏水洗涤干燥，获得不同掺杂含量的N‑Bi4O5Br2复合材料。
[0013] 步骤3、构建恩诺沙星(ENR)灵敏检测的光电化学适配体传感器：
[0014] 将N‑Bi4O5Br2复合材料分散于N,N‑二甲基甲酰胺DMF中，得到N‑Bi4O5Br2分散液，将分散液滴涂于ITO电极上，再滴涂壳聚糖CS溶液，烘干后将戊二醛GA溶液滴于电极表面，并置于室温下反应完毕后，用磷酸缓冲溶液PBS淋洗；将ENR适配体滴加在电极上，反应一段时间后，用PBS淋洗，然后滴加牛血清蛋白BSA溶液，最终得到适配体修饰的材料电极，即用于恩诺沙星检测的光电化学适配体传感器。
[0015] 步骤1中，所述BiBr3与NaOH溶液的用量比为1.33g：12.6mL，其中，NaOH溶液的浓度为2mol/L；所述水热反应温度为140～160℃，反应时间为10～12h；离心速率为8000～9000rmp/s，离心时间为6～8min；干燥温度为50～60℃，干燥时间为10～12h。
[0016] 步骤2中，所述N‑Bi4O5Br2中氮的质量百分含量为10％～50％；马弗炉设置温度为200～220℃，反应时间为3～5h。
[0017] 步骤3中，所述N‑Bi4O5Br2分散液为2mg/mL；所述CS浓度为0.1％；GA浓度为2.5％，CS溶液的用量为10μL，GA溶液的用量为20μL，CS与GA反应时间为0.5～1h；
[0018] ENR适配体序列为：5′‑NH2‑CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA‑3′；ENR适配体浓度为3μM，滴加量为20μL，反应时间10h；BSA浓度为3％；所述PBS浓度为0.1mol/L,pH＝7.4，用量为10～20mL。
[0019] 将本发明构建的光电化学适配体传感器用于检测恩诺沙星的用途，将不同浓度的ENR溶液滴到用于恩诺沙星检测的光电化学适配体传感器上，并孵育一段时间，以ITO电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，经过电化学工作站三电极系统，在氙灯光源的照射下按浓度依次进行光电分析。
[0020] 其中，ENR浓度为0.1～108ng/mL，分别为0.1ng/mL，1ng/mL，100ng/mL，103ng/mL，4 5 6 7 8
10ng/mL，10ng/mL，10ng/mL，10ng/mL和10ng/mL，滴加量为10～20μL；孵育温度为37℃；
氙灯光源的强度为25％～100％。
10ng/mL，10ng/mL，10ng/mL，10ng/mL和10ng/mL，滴加量为10～20μL；孵育温度为37℃；
氙灯光源的强度为25％～100％。
[0021] 本发明的有益效果为：
[0022] 本发明制备N‑Bi4O5Br2纳米复合物作为光电活性材料，成功建立光电化学传感平台，建立了一种湖水中恩诺沙星的的光电化学检测方法，其特色和优点表述如下：
[0023] (1)本发明制备N‑Bi4O5Br2纳米复合物作为光电活性材料来构建光电化学适配体传感器，放大了光电流响应信号。
[0024] (2)本发明采用尿素对Bi4O5Br2进行进一步的掺杂，一方面，对半导体材料的掺杂可以起到信号放大的作用，并且拓宽可见光吸收；另一方面，利用适配体的特异性识别，与ENR分子间的结合，进一步提高稳定性且更有利于电子的转移。
[0025] (3)本发明所提出的信号放大方法和检测模式实现了对ENR的超灵敏检测，在6
0.1ng/mL～10ng/mL的浓度区间内，ENR浓度的对数(lg CENR)与光电流响应值呈现良好的线性关系，检出限可达0.033ng/mL。
0.1ng/mL～10ng/mL的浓度区间内，ENR浓度的对数(lg CENR)与光电流响应值呈现良好的线性关系，检出限可达0.033ng/mL。
[0026] (4)与传统检测方法相比，本发明中所提出的ENR的光电化学检测方法具有操作更简便灵活，仪器设备更简单，检测范围宽，检出限低，检测成本低廉等特点。
附图说明
[0027] 图1为所制备材料Bi4O5Br2(a)和N‑Bi4O5Br2(b)的光电流响应(A)和不同成分比例的10％N‑Bi4O5Br2(a)，20％N‑Bi4O5Br2(b)，30％N‑Bi4O5Br2(c)，40％N‑Bi4O5Br2(d)和50％N‑Bi4O5Br2(e)的光电流响应图(B)；
[0028] 图2为ENR浓度与光电流响应值的对应关系图(A)和其线性关系图(B)。
具体实施方式
[0029] 以下结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
[0030] 实施例1：
[0031] (1)溶剂热法制备溴化氧铋(Bi4O5Br2)纳米片
[0032] 首先，将1.33g溴化铋(BiBr3)溶解在50mL乙二醇中，搅拌下逐滴加入2mol/L NaOH12.6mL，接着转入聚四氟乙烯高压釜中，并在140℃下反应12h。待反应釜冷却至室温后，我们将所得样品用乙醇和去离子水洗涤3次，并在实验室中于9000rmp的条件下离心8min，最后将其在60℃的烘箱中干燥12h。根据该方法，获得了Bi4O5Br2纳米片。
[0033] (2)制备N‑Bi4O5Br2纳米复合物
[0034] 称取0.2g Bi4O5Br2和0.02g尿素混合，在220℃的马弗炉中加热3h，得到的化合物用二甲亚砜和蒸馏水清洗。然后在60℃下干燥12h，获得10％N‑Bi4O5Br2。
[0035] 将不同尿素量(0.04g、0.06g、0.08g和0.1g)按同样的步骤制备可获得不同含量的N‑Bi4O5Br2复合材料并将其标记为20％N‑Bi4O5Br2、30％N‑Bi4O5Br2、40％N‑Bi4O5Br2和50％N‑Bi4O5Br2。
[0036] 图1(A)是本实施例获得的Bi4O5Br2(a)和N‑Bi4O5Br2(b)光电流响应图谱，由图可知，光电流响应值扩大了18倍，增强了电流响应信号；图1(B)是本实施例1获得的不同成分比例的10％N‑Bi4O5Br2(a)，20％N‑Bi4O5Br2(b)，30％N‑Bi4O5Br2(c)，40％N‑Bi4O5Br2(d)和50％N‑Bi4O5Br2(e)的光电流响应图，可以其中看出30％N‑Bi4O5Br2(c)的光电流响应最强为
0.37μA，所以我们选择此比例的N‑Bi4O5Br2作为材料构建后续传感平台。
0.37μA，所以我们选择此比例的N‑Bi4O5Br2作为材料构建后续传感平台。
[0037] (3)光电化学适配体传感器的构建
[0038] 用N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解2mg N‑Bi4O5Br2复合物制备N‑Bi4O5Br2分散液，取20μL的N‑Bi4O5Br2分散液修饰在ITO电极上，再滴涂10μL壳聚糖(CS)溶液，置于红外灯下烘干。接着，将20μL戊二醛(GA)溶液滴于电极表面，并置于室温下反应1h，反应完毕后，用0.1mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)淋洗，除去电极表面多余的GA。用PBS为溶剂配制2μM ENR适配体溶液，将ENR适配体滴加在电极上，反应12h后，用PBS淋洗以除去过量的未吸附的适配体，然后滴加10μL牛血清蛋白(BSA)溶液静置0.5h以封闭非特异性活性位点，最终得到适配体修饰的材料电极。
[0039] 此后，将不同浓度的ENR溶液滴到适配体修饰的材料电极上，并在37℃氛围下孵育一段时间。以ITO电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，经过电化学工作站三电极系统，在氙灯光源的照射下按浓度依次进行光电分析。
[0040] 图2(A)是本实施例获得的ENR浓度(a→j:0.1→108ng/mL)与光电流响应值的对应关系图，图2(B)为其线性关系图，从图中可以看出，随着ENR浓度的增加，N‑Bi4O5Br2的光电2
流响应逐渐增大，并且光电流大小与ENR浓度之间呈现良好的线性关系(R＝0.991)，线性–1 6
方程为I＝0.01391+0.00456lg[CENR(ng mL )]。如图2(B)，在0.1ng/mL～10ng/mL的浓度区间内，ENR浓度的对数值(lg CENR)与光电流响应值呈现良好的线性关系，检出限可达
0.033ng/mL。
流响应逐渐增大，并且光电流大小与ENR浓度之间呈现良好的线性关系(R＝0.991)，线性–1 6
方程为I＝0.01391+0.00456lg[CENR(ng mL )]。如图2(B)，在0.1ng/mL～10ng/mL的浓度区间内，ENR浓度的对数值(lg CENR)与光电流响应值呈现良好的线性关系，检出限可达
0.033ng/mL。
[0041] 实施例2：
[0042] (1)溶剂热法制备溴化氧铋(Bi4O5Br2)纳米片
[0043] 首先，将2.66g溴化铋(BiBr3)溶解在50mL乙二醇中，搅拌下逐滴加入2mol/L NaOH25.2mL，接着转入聚四氟乙烯高压釜中，并在140℃下反应12h。待反应釜冷却至室温后，我们将所得样品用乙醇和去离子水洗涤3次，并在实验室中于9000rmp的条件下离心8min，最后将其在60℃的烘箱中干燥12h。根据该方法，获得了Bi4O5Br2纳米片。
[0044] (2)制备N‑Bi4O5Br2纳米复合物
[0045] 称取0.4g Bi4O5Br2和0.04g尿素混合，在220℃的马弗炉中加热3h，得到的化合物用二甲亚砜和蒸馏水清洗。然后在60℃下干燥12h，获得10％N‑Bi4O5Br2。
[0046] 将不同尿素量(0.08g、0.12g、0.16g和0.2g)按同样的步骤制备可获得不同含量的N‑Bi4O5Br2复合材料并将其标记为20％N‑Bi4O5Br2、30％N‑Bi4O5Br2、40％N‑Bi4O5Br2和50％N‑Bi4O5Br2。
[0047] 步骤(3)同实施例1的步骤(3)。
[0048] 实施例3：
[0049] (1)溶剂热法制备溴化氧铋(Bi4O5Br2)纳米片
[0050] 首先，将1.33g溴化铋(BiBr3)溶解在50mL乙二醇中，搅拌下逐滴加入2mol/L NaOH12.6mL，接着转入聚四氟乙烯高压釜中，并在160℃下反应10h。待反应釜冷却至室温后，我们将所得样品用乙醇和去离子水洗涤3次，并在实验室中于9000rmp的条件下离心8min，最后将其在60℃的烘箱中干燥12h。根据该方法，获得了Bi4O5Br2纳米片。
[0051] (2)制备N‑Bi4O5Br2纳米复合物
[0052] 称取0.2g Bi4O5Br2和0.02g尿素混合，在200℃的马弗炉中加热5h，得到的化合物用二甲亚砜和蒸馏水清洗。然后在60℃下干燥12h，获得10％N‑Bi4O5Br2。将不同尿素量(0.04g、0.06g、0.08g和0.1g)按同样的步骤制备可获得不同含量的N‑Bi4O5Br2复合材料并将其标记为10％N‑Bi4O5Br2、20％N‑Bi4O5Br2、30％N‑Bi4O5Br2、40％N‑Bi4O5Br2和50％N‑Bi4O5Br2。
[0053] 步骤(3)同实施例1的步骤(3)。