目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用转让专利
申请号 : CN201911150397.1
文献号 : CN112824878A
文献日 : 2021-05-21
发明人 : 陈兴 , 孙德恩
申请人 : 北京大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种目标生物分子的锚定方法,其特征在于,所述锚定方法包括:通过对目标生物分子进行标记,使所述目标生物分子带上氨基基团和信号标记;
利用所述氨基基团将所述目标生物分子锚定到凝胶中。
2.根据权利要求1所述的锚定方法,其特征在于,通过生物正交反应对所述目标生物分子进行标记使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记;
优选地,采用带有生物正交基团的代谢类似物或经过生物正交基团修饰的有机化学分子与带有互补生物正交基团的第一标记分子,通过所述生物正交基团之间进行所述生物正交反应,使所述目标生物分子带上所述第一标记分子;
利用带有氨基基团和信号标记的第二标记分子特异性结合所述第一标记分子,从而使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记;
更优选地,所述生物正交基团为叠氮或端炔基;所述第一标记分子为生物素、地高辛、FLAG或二硝基苯;相应地,所述带有氨基基团和信号标记的第二标记分子为带有信号标记的链霉亲和素、地高辛抗体、FLAG抗体或二硝基苯抗体。
3.根据权利要求1所述的锚定方法,其特征在于,通过带有氨基基团的第三标记分子标记所述目标生物分子,使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记,优选地,所述目标生物分子为脂质或核酸或糖类,相应地,所述第三标记分子为脂溶性染料、核酸染料或荧光标记的适配体、或者带荧光标记的凝集素。
4.根据权利要求1所述的锚定方法,其特征在于,通过带有氨基基团的第四标记分子标记所述目标生物分子,使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述第四标记分子;
将带有信号标记的第五标记分子与所述第四标记分子进行特异性结合,从而使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记;
优选地,所述第四标记分子为一抗,相应地,所述第五标记分子为荧光标记的二抗。
5.根据权利要求1所述的锚定方法,其特征在于,采用邻近标记的方法使所述目标生物分子修饰上生物素,并利用带有氨基基团和荧光标记的生物素结合物与所述生物素结合,使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记,其中,所述生物素结合物为生物素亲和素或生物素抗体;
优选地,所述邻近标记的方法为APEX,BirA或TurboID;
优选地,所述生物素亲和素为链霉亲和素。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的锚定方法,其特征在于,利用所述氨基基团将所述目标生物分子锚定到凝胶中包括:
通过丙烯酰胺活性酯或者戊二醛与所述氨基基团进行反应的方式,将所述目标生物分子锚定到凝胶中。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的锚定方法,其特征在于,在使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记之后,以及利用所述氨基基团将所述目标生物分子锚定到凝胶中之前,所述锚定方法还包括对所述信号标记进行放大的步骤。
8.根据权利要求2或5所述的锚定方法,其特征在于,采用生物素三聚体连接两个链霉亲和素,并通过逐轮生物素-链霉亲和素相互作用的迭代染色锚定方法来实现对所述信号标记进行放大;或者通过isHCR的锚定方法实现对所述信号标记进行放大。
9.根据权利要求2所述的锚定方法,其特征在于,所述经过生物正交基团修饰的有机化学分子为小分子药物或化学探针,所述小分子药物或所述化学探针修饰有所述生物正交基团和靶向基团,所述靶向基团选自细胞器靶向基团、细胞骨架靶向基团或细胞膜靶向基团。
10.根据权利要求2所述的锚定方法,其特征在于,所述经过生物正交基团修饰的有机化学分子通过化学交联或光交联的方式实现与周围分子的共价交联;
优选地,所述化学交联包括采用氯代乙酰基进行交联。
11.根据权利要求1所述的锚定方法,其特征在于,所述目标生物分子选自脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种。
12.一种膨胀显微成像方法,其特征在于,所述成像方法包括:利用权利要求1至11中任一项所述的锚定方法将所述目标生物分子锚定到凝胶中;
使所述凝胶吸水膨胀并利用所述信号标记对膨胀后的所述目标生物分子进行成像。
13.根据权利要求12所述的成像方法,其特征在于,所述成像为共聚焦显微成像或超分辨率显微成像,优选地,所述超分辨率显微成像为SIM成像、STED成像、STORM成像或者DNA-PAINT成像。
14.权利要求1至11中任一项所述的锚定方法和/或权利要求12或13所述的成像方法在目标生物分子的生物学相关研究中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用,其特征在于,所述目标生物分子为脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种;
优选地,所述生物学相关研究包括结构和/或功能研究。
说明书 :
目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用
技术领域
背景技术
自由基聚合。经过适度的蛋白酶酶切或者高温变形,从而使得样品力学均一化,带有大量羧
酸根基团的聚电解质凝胶在吸水后因电性相斥发生膨胀,使得锚定在凝胶中的生物分子得
以各向同性地膨胀(如图1所示)。
丙烯酰胺活性酯与生物分子上的氨基残基反应,实现对生物分子上修饰上丙烯酰胺;(3)利
用戊二醛通过对生物分子上的氨基进行交联,与聚合物凝胶形成互穿聚合物网络,游离的
醛基也可以与在聚合过程中与凝胶中的游离氨基偶联,从而达到生物分子锚定到凝胶中的
目的。上述方法可以使得荧光信号在膨胀后得以保留。目前在传统的荧光显微镜如共聚焦
或宽场荧光显微镜下,膨胀四倍的ExM技术使得分辨率提升到70-80nm。而且膨胀对样品中
荧光分子的相对位置信息扰动较小,可以应用到细胞以及组织中的超分辨成像。
成像技术的结合同样方兴未艾,如与SIM、STED、STORM等超分辨成像技术等结合,使分辨率
得到进一步提升。应用导向型工作也呈现出爆发式增长,诸多课题组证明了ExM可以被应用
到各种体系中,如小鼠、涡虫、果蝇、斑马鱼、细菌,甚至被应用到DNA折纸术、蛋白晶体中。
此ExM技术中的另一大挑战是如何实现非蛋白分子的超分辨成像,如对脂质、糖类、核酸分
子、小分子药物、代谢物以及化学探针进行ExM标记以及成像。
锚定到凝胶中。除此之外,糖类以及脂质等非蛋白质生物分子无法利用遗传编码方式进行
标记,同时也缺乏广谱性免疫荧光手段,该类型生物分子在ExM技术中的标记难题也需要解
决,因此目前的ExM技术无法对该类型分子进行标记以及成像。
信号弱、信噪比低等缺点,因此ExM技术也亟需信号放大的方法。
目前也还没有有效的方案。
发明内容
质、糖类等)进行荧光标记以及超分辨成像的问题。
记;利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中。
的有机化学分子与带有互补生物正交基团的第一标记分子,通过生物正交基团之间进行生
物正交反应,使目标生物分子带上第一标记分子;利用带有氨基基团和信号标记的第二标
记分子特异性结合第一标记分子,从而使目标生物分子带上氨基基团和信号标记;更优选
地,生物正交基团为叠氮或端炔基;第一标记分子为生物素、地高辛、FLAG或二硝基苯;相应
地,带有氨基基团和信号标记的第二标记分子为带有信号标记的链霉亲和素、地高辛抗体、
FLAG抗体或二硝基苯抗体。
记分子为脂溶性染料、核酸染料或荧光标记的适配体、或者带荧光标记的凝集素。
异性结合,从而使目标生物分子带上氨基基团和信号标记;优选地,第四标记分子为一抗,
相应地,第五标记分子为荧光标记的二抗。
记,其中,生物素结合物为生物素亲和素或生物素抗体;优选地,邻近标记的方法为APEX,
BirA或TurboID;优选地,生物素亲和素为链霉亲和素。
实现对信号标记进行放大。
胞骨架靶向基团或细胞膜靶向基团。
水膨胀并利用信号标记对膨胀后的目标生物分子进行成像。
基团的目标生物分子,比如脂质或糖类,进行标记的同时带上氨基基团,进而使得该目标生
物分子通过氨基基团采用现有的锚定方法锚定到凝胶中,从而实现了任何类型的生物分子
的凝胶锚定,进而便于实现后续的膨胀显微成像。
附图说明
醇/10%甲酰胺、10%SDS进行处理,发现Alexa Fluor 555标记的链霉亲和素标记的脂质依
旧得以保留。
联的方式都能够实现对脂质的click-ExM成像。
四轮信号放大。
具体实施方式
标记核酸、蛋白质、糖类或脂质等生物大分子。首先需要将可参与特异反应的功能基团引入
目标分子,然后与带有互补反应基团的标记物进行生物正交反应,最后利用不同标记物特
征区检测目标分子的定位、结构或功能。能够发生生物正交反应的这两个反应基团之间具
有高度的反应活性,同时在生理环境下对周围其他的反应基团是惰性的。最广泛的生物正
交反应是一价铜离子催化的叠氮和末端炔基之间的环加成反应,也是“点击化学(click
chemistry)”。
物理距离,从而可以绕过光学衍射极限,在普通宽场或者共聚焦荧光显微镜下即可实现超
分辨成像,ExM的分辨率取决于膨胀系数及所使用的显微镜。
的各种细胞器进行定位。该方法适用于各种亚细胞区域,能够分析无法纯化的结构,比如核
纤层和线粒体外膜(具体参见Atlas of Subcellular RNA localization Revealed by
APEX-seq,Cell,2019-06-20)。近年来以APEX和BioID为代表的蛋白质邻近标记技术逐渐被
应用于蛋白质相互作用研究。
集生物素标记蛋白进行质谱鉴定。邻近标记技术不依赖于目标蛋白本身的性质及蛋白质相
互作用的强度,能够捕获传统的亲和纯化-质谱技术(AP-MS)无法鉴定的蛋白质相互作用。
接酶,其催化活性得到极大提升,标记时间从18hrs缩短至10min。
异性。BirA可以识别一段多肽序列(生物素受体标签BAT)。当融合BAT的蛋白和BirA共表达
时,BAT序列可以被isHCR有效生物素化。被生物素化的蛋白质可以通过与之有高亲和力的
抗生物素蛋白或链霉亲和素进行一步纯化或标记。BirA催化的生物素化过程一般包含两个
步骤:1)将生物素和ATP反应生成biotinoyl-5’-AMP,此过程将活化的生物素别固定在BirA
的活性位点上;2)将活化的生物素通过反应偶联到BAT序列的特定赖氨酸残基上。
式,这种闪烁型荧光信号,能以更高的分辨率区分纳米级的分子间距离。它可以与一般细胞
生物学实验都有、但分辨率较低的共聚焦显微镜配套使用,实现细胞内各种分子,如蛋白
质、RNAs和DNA的超分辨率观察。利用这种方法,研究人员可以清晰地观察到细胞核内独立
的生物分子,包括DNA序列、蛋白质-DNA复合物、核RNAs以及围绕细胞核的核膜。
团,因此难以被锚定到凝胶中。另外,多糖以及脂质分子无法利用遗传编码方式进行标记,
缺乏广谱性免疫荧光手段,该类型生物分子在ExM方法中的标记难题也需要解决,因此目前
的ExM方法无法对该类型分子进行标记以及成像。
与生物素-链霉亲和素相互作用(包括但不限于)相结合,实现了ExM方法对糖类、脂质、新生
成蛋白质、小分子药物、代谢物以及化学探针等分子进行标记以及成像。以炔基探针为例,
该方法的流程如图2所示。
放大,即可在此步进行生物素三聚体以及荧光分子标记的链霉亲和素的迭代染色,或者
isHCR信号放大,接下来即可进行前人的ExM流程,如利用丙烯酰胺活性酯或者戊二醛交联
方式锚定生物分子,自由基聚合合成凝胶,蛋白酶酶切进行力学均一化,凝胶吸水膨胀,荧
光成像。
给细胞带有叠氮、炔基等生物正交基团的代谢类似物,细胞通过自身代谢通路利用该种代
谢类似物,从而合成的生物分子上便被标记上了生物正交基团。对于小分子化学探针的标
记,我们可以对小分子化学探针修饰上生物正交基团,随后即可对细胞特定结构进行标记。
接下来通过click反应,我们可以对生物分子标记上带有荧光分子的基团,如带有氨基的蛋
白、多肽或者有机化学小分子,包括但不限于链霉亲和素、地高辛、FLAG、二硝基苯等。
亲和素、地高辛、FLAG、二硝基苯等。随后通过丙烯酰胺活性酯或者戊二醛交联的方式,实现
对生物分子锚定到凝胶中的目的。
相互作用的迭代染色实验,即可实现荧光信号在目标生物分子上的信号累积放大,提高ExM
方法的信噪比。另外,click-ExM还可以与已发表的isHCR信号放大技术相结合,实现高扩增
倍数的信号放大。
Click-ExM方法能够被用来实现脂质等生物分子的锚定。通过对微管蛋白免疫荧光的实验
证明可以实现基于链霉亲和素以及生物素三聚体迭代相互作用实现信号放大。随后,通过
荧光成像等方式证明了本申请改进的click-ExM确实能够实现对脂质、糖类、新生成蛋白
质、核酸分子包括DNA、RNA、小分子药物、代谢物以及化学探针的荧光标记以及超分辨成像。
脂质、糖类、核酸,随后氨基可以与丙烯酰胺活性酯进行反应,从而使其锚定在凝胶中,实现
后续的膨胀成像。另一种方式是有机合成三功能小分子,其带有生物正交基团,荧光报告基
团以及锚定基团,也可实现该目的,但是这种方法依赖于对现有探针分子的改造,不具有普
适性,工程量巨大。
物分子带上氨基基团和信号标记;利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中;使凝胶吸
水膨胀并利用信号标记对膨胀后的目标生物分子进行成像。
基团的目标生物分子,比如脂质或糖类,进行标记的同时带上氨基基团,进而使得该目标生
物分子通过氨基基团采用现有的锚定方法锚定到凝胶中,从而实现了任何类型的生物分子
的凝胶锚定,进而便于实现后续的膨胀显微成像。
正交基团修饰的有机化学分子(包括小分子药物及化学探针)与带有互补生物正交基团的
第一标记分子,通过生物正交反应,使目标生物分子带上第一标记分子;利用带有氨基基团
和信号标记的第二标记分子特异性结合第一标记分子,从而使目标生物分子带上氨基基团
和信号标记;更优选地,第一生物正交基团为叠氮或端炔基;第一标记分子为生物素、地高
辛、FLAG或二硝基苯;相应地,带有氨基基团和信号标记的第二标记分子为带有信号标记的
链霉亲和素、地高辛抗体、FLAG抗体或二硝基苯抗体。
应地,第三标记分子为脂溶性染料、核酸染料或荧光标记的适配体、荧光标记的凝集素。
记分子进行特异性结合,从而使目标生物分子带上氨基基团和信号标记;优选地,第四标记
分子为一抗,相应地,第五标记分子为凝集素抗体或二抗。
团和信号标记,其中,生物素结合物为生物素亲和素或生物素抗体;优选地,邻近标记的方
法为APEX,BirA或TurboID;优选地,生物素亲和素为链霉亲和素。
标记。比如,糖类或脂质类,可以通过在培养基中饲喂目标生物分子的代谢类似物,使得新
合成的糖类或脂质带上生物正交基团。如果是小分子探针,则可以通过带上生物正交基团
以及细胞结构靶向基团,通过细胞结构靶向基团与亚细胞结构上的靶标特异性结合,使得
亚细胞上的靶标分子带上生物正交基团,则可以通过生物正交反应实现标记,同时该小分
子探针上还设计有氨基基团,能够使目标分子锚定到凝胶中。
基团,又能进行成像检测。比如脂溶性染料、核酸染料或荧光标记的适配体,或者荧光标记
的凝集素,本身带有氨基基团,又能成像检测。而凝集素具有氨基基团,又能够特异性结合
目标糖类物质,因而通过其携带的荧光标记即可对其结合的目标生物分子进行成像检测。
体的特异性结合,同样能够实现在对目标分子进行标记,和使目标分子带上氨基基团。
式,将目标生物分子锚定到凝胶中。
大的步骤。
级联放大方法进行放大。
信号标记进行放大;或者通过isHCR的方法实现对信号标记进行放大。通过采用生物素作为
标记分子,便于利用生物素与亲和素的亲和作用来实现对信号的放大,从而在实现锚定的
同时,放大了标记信号,便于后续实现对目标生物分子的超分辨率成像。
细胞骨架靶向基团或细胞膜靶向基团。
够特异性结合靶向细胞膜、细胞骨架或线粒体、叶绿体等细胞器的基团。
子进行交联。具体实现交联的方式可以根据需要进行合理选择。
酰基进行交联。根据交联剂或交联方式的不同,有机化学分子所能够交联的对象也有差异。
当采用氯代乙酰基进行交联时,只与周围蛋白质交联。
生物大分子,而小分子药物、代谢物以及化学探针等属于生物小分子。无论这些生物小分子
标记的对象是何种生物大分子,这些生物小分子产生的荧光信号显示的是其本身的位置,
根据其发光位置或分布位置的不同,其标记的对象也不同。对于某些小分子药物,其产生的
荧光信号可能没有特定的区域分布,所以荧光成像显示的就是这些小分子药物自身的分
布。
号标记对膨胀后的目标生物分子进行成像。
PAINT成像。本申请的上述膨胀显微成像方法中,通过将目标分子标记上荧光信号,同时锚
定到凝胶中,通过凝胶膨胀将目标分子放大,对于成像,根据具体所使用的显微镜的不同,
可以进行不同的成像。上述SIM成像、STED成像、STORM成像或者DNA-PAINT成像都是新兴的
根据不同的原理而实现的超分辨率显微成像方法。
糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种。生物学
相关研究包括但不仅限于对目标分子的结构和/或功能研究。
胺,8.625%丙烯酸钠),其中依次加入新配置的10%四甲基乙二胺(TEMED)以及10%过硫酸
铵(APS),细胞先在4℃中孵育5分钟,随后置于37℃温箱中孵育凝胶一小时。凝胶随后利用
8U蛋白酶K在消化缓冲液(50mM Tris pH 8.0,1mM EDTA,0.1%Triton X-100,0.8M盐酸胍)
在37℃下酶切1-4h。凝胶随后置于去离子水中膨胀,每隔20分钟换水一次,换4次达到膨胀
平衡,随后可进行成像操作。
基-法尼醇以及DiI化学结构式。图3中的c示出了对原代神经细胞代谢标记炔基-胆碱,进行
ExM成像,发现膨胀之后脂质基本无保留。图3中的d示出了对HeLa细胞分别代谢标记炔基-
棕榈酸以及炔基-法尼醇,进行ExM成像,发现膨胀之后脂质基本无保留。图3中的e示出了对
CHO细胞利用DiI染料对细胞膜染色,进行ExM成像,发现膨胀之后脂质基本无保留。
醇/10%甲酰胺、10%SDS进行处理。
中的c示出的是链霉亲和素-生物素复合体可以抵御蛋白酶k的酶切。图4中的d示出的是对
HeLa细胞代谢标记炔基-胆碱(图中简称Alk-Cho),分别利用click反应标记上有机染料
TAMRA或者Alexa Fluor 555标记的链霉亲和素(分别对应第2行和第1行),固定之后,利用
甲醇、Triton-X100、乙醇/10%甲酰胺、10%SDS进行处理,发现Alexa Fluor 555标记的链
霉亲和素标记的脂质依旧得以保留。图4中的e示出的是对图4中的d中的荧光强度进行定量
比较。图4中的f示出的是在COS-7细胞中代谢标记炔基-胆碱,click标记上Alexa Fluor
555标记的链霉亲和素,利用三种ExM方法中的丙烯酰胺活性酯(AcX、MA-NHS)以及戊二醛
(GA)交联的方式都能够实现对脂质的click-ExM成像。
6-tetrafluorophenyl)ester)(浓度为0.474mg mL-1),室温搅拌过夜,旋蒸除去溶剂。产物
通过硅胶柱纯化(甲醇:乙酸乙酯从1:100升到3:7),得到白色固体产物(7mg,68%)。
3.15(m,3H),2.93-2.88(m,3H),2.69(d,J=10.5Hz,3H),2.21-2.16(m,6H),1.74-1.53(m,
12H),1.44-1.37(m,6H)。
29.50,26.85。
用3%多聚甲醛及0.1%戊二醛固定15分钟,随后利用0.1%硼氢化钠还原7分钟。接下来利
用100mM甘氨酸洗涤3次,利用0.1%Triton X-100穿孔15分钟,细胞在封闭液中(1×PBS/
3%BSA/0.1%Triton X-100)封闭30分钟,在带有微管蛋白抗体(Abcam,ab52866,1:250)的
抗体稀释液中(1×PBS/3%BSA/0.1%Triton X-100)4℃孵育过夜,洗涤3次,随后在带有
Alexa Fluor 555二抗室温孵育1小时,随后洗涤3次。
室温孵育半小时,PBS洗涤三次,随后的多轮信号放大可重复该步骤。
光、基于生物素偶联二抗的免疫荧光以及利用生物素三聚体的一轮、二轮、四轮信号放大。
图5中的c示出的是对图5中的b中的荧光强度进行定量比较。图5中的d示出的是四轮信号放
大之后的微管蛋白免疫荧光图。图5中的e示出的是对图5中的d中方框部分单根微管蛋白的
横截面荧光强度曲线分布。图5中的f示出的是基于传统荧光二抗免疫荧光以及四轮信号放
大之后的微管蛋白分辨率比较。图5中的g示出的是Click-ExM利用链霉亲和素与isHCR
(immunosignal hybridization chaim reaction,HCR杂交链式反应)信号放大示意图。
及0.1%戊二醛固定15分钟,随后利用0.1%硼氢化钠还原7分钟。接下来利用100mM甘氨酸
洗涤3次,利用0.1%皂苷穿孔15分钟,利用click反应标记上炔基生物素,随后孵育5μg/mL
的荧光标记的链霉亲和素,随后可以进行膨胀前成像。
丙烯酰胺,8.625%丙烯酸钠),其中加入新配置的10%过硫酸铵(APS)以及10%四甲基乙二
胺(TEMED),细胞先在4℃中孵育5分钟,随后置于37℃温箱中孵育凝胶一小时。凝胶随后利
用8U蛋白酶K在消化缓冲液(50mM Tris pH 8.0,1mM EDTA,0.1%Triton X-100,0.8M盐酸
胍)在37℃下酶切1-4h。凝胶随后置于去离子水中膨胀,每隔20分钟换水一次,换4次达到膨
胀平衡,随后可进行成像操作。
的标志物如mito-GFP以及TOM20免疫荧光共定位。图6中的c示出的是图6中的b中直线横截
面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。图6中的d示出的是对COS-7细胞代谢标记炔基-
胆碱之后的click-ExM成像图,脂质标记信号可以与内质网的标志物KDEL-GFP共定位。图6
中的e示出的是图6中的d中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。图6中的f
示出的是对COS-7细胞代谢标记alk-choline之后的click-ExM成像图,脂质标记信号可以
与高尔基体的标志物B4GALT1-GFP共定位。图6中的g示出的是图6中的f中直线横截面部分
各个荧光通道的荧光强度分布曲线。图6中的h示出的是对原代心肌细胞代谢标记炔基-胆
碱之后的click-ExM三维成像图。图6中的i示出的是图6中的h中成像光学截面以及视野放
大成像图。图6中的j示出的是图6中的i中直线横截面部分的荧光强度分布曲线。
胞,原代海马区神经元以及原代大鼠心肌细胞孵育2mM ManNAz 48h。随后孵育100μM DBCO-
PEG4-生物素30分钟,随后培养基洗涤15分钟。细胞随后进行固定操作,步骤同脂质标记。细
胞利用click反应标记上生物素基团。孵育5μg/mL的荧光标记的链霉亲和素,随后可以进行
膨胀前成像。凝胶、酶切、膨胀、成像步骤同脂质标记部分。
镜SIM成像图。图7中的c示出的是GalNAz标记与RL2抗体免疫荧光共定位图。图7中的d示出
的是图7中的c中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。图7中的e示出的是
GalNAz标记在细胞核膜上分布的click-ExM成像图。图7中的f示出的是图7中的e中方框部
分直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。图7中的g示出的是图7中的e中GalNAz标记的
核孔复合物粒径分析统计直方图。图7中的h示出的是对HeLa细胞代谢标记SiaNAz之后的
click-ExM成像图。图7中的i示出的是对原代海马区神经元细胞代谢标记ManNAz的click-
ExM前后成像图。图7中的j示出的是图7中的i中膨胀前成像图直线横截面荧光通道的荧光
强度分布曲线。图7中的k示出的是图7中的i中膨胀后成像图直线横截面荧光通道的荧光强
度分布曲线。图7中的l示出的是对原代心肌细胞代谢标记ManNAz的click-ExM成像图。图7
中的m示出的是图7中的l中膨胀前成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。图7中
的n示出的是图7中的l中膨胀后成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。
标记响应时间。凝胶前,EdU标记的细胞利用30U mL-1DNase I在37℃下处理30分钟。
用click反应标记上生物素,然后与孵育5μg/mL的荧光标记的链霉亲和素,随后可以进行膨
胀前成像。凝胶、酶切、膨胀、成像步骤同脂质标记部分。
GlcNAc标记过程。
AHA 2h后与神经元标志物MAP2免疫荧光的click-ExM前后成像图。图8中的c示出的是EdU标
记的U2OS细胞click-ExM前后成像图。图8中的d示出的是EU标记的HeLa细胞click-ExM前后
成像图。图8中的e示出的是叠氮-阿法替尼处理2h以及12h后的HeLa细胞的click-ExM前后
成像图。图8中的f示出的是Op-puro标记的HeLa细胞的click-ExM前后成像图。图8中的g示
出的是TPP-AC标记的COS-7细胞的click-ExM前后成像图。图8中的h示出的是DSPE-azide标
记的HeLa细胞的click-ExM前后成像图。
经过生物正交基团修饰的有机化学探针。
地高辛、FLAG、二硝基苯等。
噪比。另外,click-ExM还可以与已发表的isHCR信号放大技术相结合,实现高扩增倍数的信
号放大。
物以及化学探针。只要按照本申请的发明思想对化学探针修饰上生物正交基团以及靶向基
团,如细胞器靶向基团、细胞骨架靶向基团(比如某些小分子药物)、细胞膜靶向基团等,都
可以应用click-ExM方法来实现成像。
分子共价偶联(使小分子与周围的分子进行交联,以避免洗脱时被洗掉)。此外,APEX,BirA
以及TurboID等方法都可以用来修饰靶标分子,使其连上生物素,从而通过生物素与链霉亲
和素或生物素抗体的相互作用来实现膨胀显微成像。
术结合,实现更高分辨率的成像。
改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。