用于检测白蛋白的组合物和方法

摘要

本公开提供一种用于确定样品中白蛋白的量的方法。在一个实施例中，所述方法涉及用选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂处理所述样品；将所述样品与白蛋白的选择性底物组合，所述选择性底物具有羧酸酯键，使得所述羧酸酯键裂解以产生水解产物；检测在一时间段内产生的所述水解产物的量；以及基于所述时间段内所述水解产物的量，确定所述样品中所述白蛋白的量。

权利要求

1.一种用于确定样品中白蛋白的量的方法，所述方法包含：用选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂处理所述样品；

将所述样品与白蛋白的选择性底物组合，所述选择性底物具有羧酸酯键，使得所述羧酸酯键裂解以产生水解产物；

检测在一时间段内产生的所述水解产物的量；以及基于所述时间段内所述水解产物的量，确定所述样品中所述白蛋白的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述白蛋白是人血清白蛋白HSA。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清或尿液。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性底物是脂肪酸或脂质的硝基苯基酯。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性底物是1‑肉豆蔻酰基‑2‑(4‑硝基苯基丁二酰基)‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述水解产物具有使得能够通过光检测器有效检测所述水解产物的发色团。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述水解产物是硝基苯酚。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述水解产物通过光检测器在约405nm的波长下检测。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述酯酶抑制剂是含有磺酰氟基的化合物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述酯酶抑制剂是4‑(2‑氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐或苯甲基磺酰氟。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述酯酶抑制剂和所述选择性底物含于一种溶液中。

说明书

用于检测白蛋白的组合物和方法

技术领域

[0001] 本公开大体上涉及医学诊断。更具体地，本公开涉及用于特异性检测和量化白蛋白的组合物和方法。

背景技术

[0002] 白蛋白是通常发现于血浆中的非糖基化球状蛋白家族。血清白蛋白是人血浆中的主要蛋白质并且执行多种生理功能，诸如维持胶体渗透压、转运各种生物分子和发挥抗氧
化作用。

[0003] 白蛋白测定通常在临床生物化学实验室中进行。举例来说，尿白蛋白已广泛用作具有肾损伤(如糖尿病、高血压和链球菌感染后的急性肾小球肾炎)的患者的重要生物标志
物。成人血清中的正常白蛋白范围是34‑54g/L，而低白蛋白可能与肝病、肾病综合征、烧伤、
蛋白丢失性肠病、吸收不良、营养不良、妊娠晚期、外来物质、基因变异以及恶性肿瘤相关。

[0004] 已开发许多方法来定量测量白蛋白水平，包括电泳、HPLC、免疫化学分析以及染料结合分析。电泳法缓慢、昂贵，需要相对大的样品体积并且容易过高估计血清白蛋白浓度。
HPLC法无法定量小于10KDa的白蛋白衍生片段；其它尿蛋白(如转铁蛋白)通常在尺寸排阻
HPLC中与白蛋白共洗脱。尽管免疫化学分析对白蛋白估计具有特异性并且有许多变化形式
可用，但这些方法一般成本高并且需要较长的培育时间和洗涤步骤。目前，一些染料结合分
析(如基于甲基橙和溴甲酚绿的染料结合分析)是可用的。但它们的特异性相对低，因为样
品中的其它蛋白质也能够结合这些染料。

[0005] 白蛋白结合并且转运许多疏水化合物，这些疏水化合物包括循环中的脂质。在结合脂质或酯时，白蛋白的某些酪氨酸残基(例如Tyr 150和Tyr 411)可显示酯酶活性(称作
伪酯酶)。许多化合物已显示是白蛋白的底物，如乙酸α‑萘酯和乙酸β‑萘酯、对硝基苯酚乙
酸酯(NPA)、脂肪酸酯、阿司匹林(aspirin)、酮洛芬葡萄糖苷酸(keoprofen glucuronide)、
环磷酰胺、烟酸酯、辛酰基饥饿素(octanoylghrelin)、硝基乙酰苯胺、硝基三氟乙酰苯胺以
及有机磷化合物(参见：Goncharov NV等人《，分子(Molecules)》(2017)22:1201)。已使用一
些作为白蛋白的底物的探针来评定白蛋白浓度(参见：例如，Yang等人的US9340821)。然而，
探针的特异性限制了其在生物样品中定量白蛋白的临床应用。因此，存在持续的需求来开
发新组合物和方法以精确且高效测量生物样品中的白蛋白水平。

发明内容

[0006] 本公开在一个方面中提供一种用于确定样品中白蛋白的量的方法。在一个实施例中，所述方法涉及用选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂、或选择性使非白蛋白酯
酶活性失活的酯酶失活剂处理所述样品；将所述样品与白蛋白的选择性底物组合，所述选
择性底物具有羧酸酯键，使得所述羧酸酯键裂解以产生水解产物；检测在一时间段内产生
的所述水解产物的量；以及基于所述时间段内产生的所述水解产物的量，确定所述样品中
所述白蛋白的量。

[0007] 在某些实施例中，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。

[0008] 在某些实施例中，样品是血液、血浆、血清或尿液。

[0009] 在某些实施例中，白蛋白的选择性底物是脂肪酸的硝基苯基酯或脂质。在某些实施例中，白蛋白的选择性底物是脂肪酸或脂质的(对、间、邻或二)硝基苯基酯。在某些实施
例中，白蛋白的选择性底物是脂肪酸的对硝基苯基酯。在某些实施例中，HSA的选择性底物
是1‑肉豆蔻酰基‑2‑(4‑硝基苯基丁二酰基)‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(14:0NPS PC)。

[0010] 在某些实施例中，水解产物具有比色或荧光特性，其使得能够通过光度或荧光检测器有效检测水解产物。在某些实施例中，水解产物是硝基苯酚。在某些实施例中，水解产
物通过在约405nm的波长下的吸收检测。在某些实施例中，HSA伪酯酶活性通过在405nm下的
增加率评定。在某些实施例中，HSA伪酯酶活性通过在405nm下的最终吸收增加评定。

[0011] 在某些实施例中，酯酶抑制剂是含有氟磺酰基(磺酰氟)官能团的化合物。在某些实施例中，酯酶抑制剂是含有苯磺酰氟官能团的化合物。在某些实施例中，酯酶抑制剂是4‑
(2‑氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(Pefabloc SC)或苯甲基磺酰氟。在某些实施例中，酯酶抑制
剂是苯基甲基磺酰氟(PMSF)。

[0012] 在某些实施例中，在分析之前，生物样品可用酯酶抑制剂预处理。在某些实施例中，酯酶抑制剂和白蛋白的选择性底物含于一种溶液中。

[0013] 在另一方面中，本公开提供一种用于检测确定样品中白蛋白的量的试剂盒。在某些实施例中，试剂盒包含选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂。试剂盒进一步包含
白蛋白的选择性底物，所述底物具有羧酸酯键，使得当底物暴露于样品中的白蛋白时，羧酸
酯键裂解以产生水解产物。在某些实施例中，试剂盒进一步包含白蛋白的标准对照。

附图说明

[0014] 图1展示人血清中的白蛋白和非白蛋白酯酶活性。人血清通过Superose‑6柱分级。并且使用14:0NPS‑PC，在存在或不存在HSA伪酯酶活性的抑制剂或遏制剂的情况下鉴别每
个级分中的酯酶活性。在不存在HSA抑制剂的情况下，鉴别出酯酶活性的三个主要级分。当
HSA的酯酶活性受抑制时，第三峰消失，表明最后一个峰是HSA的酯酶活性。

[0015] 图2展示根据本公开的一实施例的分析的结果。

[0016] 图3展示使用14:0NPS‑PC作为探针的HSA伪酯酶的米氏(Michaelis‑Menten)动力学。14:0NPS‑PC在HSA的伪酯酶反应中具有相对低的Km，并且因此HSA浓度的测量可以灵敏
且快速。

[0017] 图4展示相比于白蛋白的伪酯酶活性，与LDL或HDL相关的酯酶活性对Pefabloc SC敏感得多。在1.5mM 14:0NPS‑PC、pH 7.4中，15‑20mM(最终浓度)的Pefabloc SC可消除所有
非白蛋白酯酶活性，但维持>90％的白蛋白伪酯酶活性。

[0018] 图5展示在HSA与纯化的LDL和HDL相关酯酶活性对与2mM Pefabloc SC一起培育的不同敏感度。当与2mM Pefabloc SC一起培育约6‑10小时时，与LDL和HDL相关的酯酶活性完
全失活。在相同条件下未观察到HSA伪酯酶活性的失活。

[0019] 图6展示在24℃下培育1小时时，约1mM的Pefabloc SC使人血清非HSA酯酶活性完全失活。

[0020] 图7展示可通过在24℃下与1mM Pefabloc SC一起培育约15分钟，使人血清非HSA酯酶活性完全失活。

[0021] 图8展示在固定底物浓度的情况下提高HSA浓度引起R2的线性度的降低。

[0022] 图9展示用于获得最好的HSA量化曲线线性度的最优底物/HSA比率。基于该图，可针对HSA量化分析的不同格式确定最优底物浓度。

[0023] 图10展示在所述条件下HSA的量化中，通过反应速率或终点阅读分析未观察到差异。

[0024] 图11展示白蛋白伪酯酶活性可受Ca2+和Cu2+影响。

[0025] 图12展示达雷帕地(Darapladib)对人血清中的Lp‑PLA2的抑制作用。

[0026] 图13展示DMSO、EDTA以及Tween‑20对白蛋白伪酯酶活性的作用。

[0027] 图14展示白蛋白信号和人血清反应体积的相关性。

[0028] 图15展示标准曲线和参数。

[0029] 图16展示检测到的白蛋白(mg/mL)与预期白蛋白(mg/mL)的二元拟合。

具体实施方式

[0030] 在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的具体实施例，并且因此当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，并且不旨在
为限制性的，因为本公开的范围将仅受到所附权利要求书限制。在提供数值范围的情况下，
应理解，介于所述范围的上限与下限之间的每个中间值(除非上下文另外明确规定，否则到
下限的单位的十分之一)以及所陈述范围中的任何其它所陈述的值或中间值均涵盖在本公
开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内并且也涵盖于本公开
内，但受在所陈述的范围内的任何特定地排除的界限值的限制。当所陈述的范围包括该界
限值中的一个或两个时，排除所包括的那些界限值中的任一个或两个的范围也包括在本公
开中。

[0031] 除非另外规定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中也可以使用与本文所
描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选方法和材料。

[0032] 在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利被具体且单独地指示为通过引用并入一样，并且通过引用并入本文以结合所
引用的出版物来公开和描述方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对申请日之前的其
公开内容，且不应解释为承认本公开由于先前的公开而无权先于这类出版物。此外，所提供
的出版日期可能不同于可能需要独立确认的实际出版日期。

[0033] 如所属领域的技术人员在阅读本公开之后将显而易见，本文所描述和说明的独立实施例中的每一个具有离散组件和特征，其可以在不脱离本公开的范围或精神的情况下，
容易地与其它若干实施例中的任一个的特征分离或组合。任何所述方法均可以按所述事件
的顺序或按逻辑上可能的任何其它顺序来进行。

[0034] 定义

[0035] 提供以下定义以帮助读者。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其它科学或医学术语或专有名词旨在具有化学和医学领域技术人员通常理解的含义。在一
些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文
中包括这样的定义不应该被解释为表示与本领域通常理解的术语的定义之间的实质性差
异。

[0036] 如本文所使用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个指代物。

[0037] 如本文所使用，术语“约”意味着加上或减去所使用数字的数值的10％。因此，约5mg/kg体重意味着在4.9到5.1mg/kg体重范围内。

[0038] 注意，在本公开中，诸如“包括(comprises/comprised/comprising)”、“含有(contains/containing)”等的术语具有美国专利法中赋予的含义；它们是包容性的或开放
式的，并且不排除其它未引用的要素或方法步骤。诸如“基本上由……组成(consisting 
essentially of/consists essentially of)”的术语具有美国专利法赋予的含义；它们允
许包括不会实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的其它成分或步骤。术语
“由……组成(consists of/consisting of)”具有美国专利法赋予它们的含义；即这些术
语是封闭式的。

[0039] “样品”或“生物样品”是指从受试者(例如人，或怀疑患有导致血清或尿液中白蛋白水平异常的病况或疾病的受试者)获取并且含有具有酯酶活性的白蛋白、白蛋白同系物
或直系同源物的任何样品。生物样品可以是体液，如血液、血浆、血清、尿液、阴道液、子宫或
阴道冲洗液、胸膜液、腹水、脑脊髓液、唾液、汗水、泪液、痰液、支气管肺泡灌洗液等。

[0040] 本文所使用的“受试者”是指温血动物，包括人和非人动物。非人动物包括能够天然产生白蛋白酯酶活性(例如白蛋白、白蛋白同系物或直系同源物)的所有脊椎动物，例如
哺乳动物和非哺乳动物，例如豚鼠、小鼠、大鼠、沙鼠、猫、兔、狗、牛、猪、绵羊、马以及非人灵
长类动物。优选地，本公开的受试者是人。受试者可以是男性或女性，可以是老年人，并且可
以是成人、青少年、儿童或婴儿。人受试者可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人或其它
种族背景，或这类种族背景的混合。

[0041] 用于检测白蛋白的方法

[0042] 本公开在一个方面中提供一种用于基于白蛋白的伪酯酶活性确定生物样品中白蛋白的量的方法。本文所使用的“白蛋白酯酶活性”或“白蛋白伪酯酶活性”包括但不限于白
蛋白的任何酯酶活性。这种活性可包括但不限于酶结合底物、释放产物和/或水解羧酸酯、
磷脂或其它分子。或者，白蛋白酯酶活性可相对于标准的重组表达半纯化或纯化蛋白质测
量。

[0043] 本文所描述的方法使用两种方式来提高白蛋白的特异性：(1)通过使用特异性结合到白蛋白的底物或探针；和(2)通过使生物样品中的非白蛋白酯酶/水解酶活性失活。所
述方法容易施加并且适于各种临床仪器。所述方法花费约3‑5分钟的短时间段并且显著降
低成本。

[0044] 在某些实施例中，所述方法涉及用选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂(即，酯酶抑制剂优先遏制样品中非白蛋白酯酶的酯酶/水解酶活性)处理样品，例如，酯酶
抑制剂遏制样品中至少80％、85％、90％、95％、99％的非白蛋白酯酶，但遏制少于10％、
9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的白蛋白的伪酯酶活性。在某些实施例中，选择性
抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂降低或消除非白蛋白酯酶活性中的任一个，包括但不
限于酶结合底物、释放产物和/或水解羧酸酯、磷脂或其它分子。

[0045] 在某些实施例中，酯酶抑制剂是含有磺酰氟基的化合物，如PMSF或Pefabloc SC。可用于本文所描述的方法的酯酶抑制剂的实施例展示于表1中。

[0046] 在某些实施例中，本文所描述方法涉及将样品与白蛋白的选择性底物组合，该选择性底物具有羧酸酯键，使得羧酸酯键裂解以产生水解产物。如本文所使用，“白蛋白的选
择性底物”意味着底物优先由样品中的白蛋白水解，例如样品中少于10％、9％、8％、7％、
6％、5％、4％、3％、2％、1％的水解底物由样品中的非白蛋白酯酶催化。

[0047] 在某些实施例中，选择性底物含有比色或荧光可检测部分。本文所使用的“比色或荧光可检测部分”是能够产生可检测或可测量信号的化合物的一部分。这种信号可通过但
不限于可见光发射或吸收、荧光、磷光或其它可检测量子测量。举例来说，白蛋白酯酶的底
物可包含在白蛋白酯酶裂解位点处键结到羧酸酯或磷脂酰胆碱的比色部分。当白蛋白使比
色部分从羧酸酯或磷脂酰胆碱裂解时，比色部分发射呈可见光或荧光形式的可检测信号。
键结到比色部分的磷脂酰胆碱的一个非限制性实施例是1‑肉豆蔻酰基‑2‑(4‑硝基苯基丁
二酰基)磷脂酰胆碱。

[0048] 在某些实施例中，选择性底物是脂肪酸的硝基苯基酯或脂质。白蛋白是某些羧酸(脂肪酸)酯和磷脂的已知水解因子(hydrolyzer)。白蛋白可在sn‑2位置处裂解磷脂以产生
溶血PC和脂肪酸。具有比色或荧光部分的底物可用于测量白蛋白酯酶活性。举例来说，底物
1‑肉豆蔻酰基‑2‑(对硝基苯基丁二酰基)‑磷脂酰胆碱是4‑硝基苯基在sn‑2位置处缀合到
丁二酰基链上的羧酸甘油酯。白蛋白水解底物的sn‑2位置，产生丁二酸4‑硝基苯酯。这一释
出可以用分光光度法在405nm下监测，并且根据吸收的变化确定白蛋白酯酶活性。使用1‑肉
豆蔻酰基‑2‑(对硝基苯基丁二酰基)‑磷脂酰胆碱或其它脂质类似物作为白蛋白的底物可
降低对其它非白蛋白酶的结合特异性，并且因此提高对白蛋白的反应特异性。使用1‑肉豆
蔻酰基‑2‑(对硝基苯基丁二酰基)‑磷脂酰胆碱或其它脂质类似物作为白蛋白的底物还可
竞争性排除生物样品中通常存在的其它疏水化合物(如脂肪酸或脂质)的结合，并且降低白
蛋白的酯酶活性且因此提高分析的准确度。

[0049] 在某些实施例中，选择性底物选自由以下一者或多者组成的组：脂肪酸的对硝基苯基、邻硝基苯基或间硝基苯基酯或脂质。如本文所使用，形成硝基苯基酯的脂肪酸包括但
不限于辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木焦油酸、蜡酸、肉
豆蔻脑酸、棕榈油酸、油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、芥酸以
及二十二碳六烯酸。

[0050] 在某些实施例中，HSA的选择性底物是1‑肉豆蔻酰基‑2‑(4‑硝基苯基丁二酰基)‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(14:0NPS PC)。使用14:0NPS PC作为选择性底物至少有两个优点：(1)
归因于其磷酸胆碱(PC)结构的对白蛋白的高特异性高，PC结构将它的其它特异性限于仅针
对磷脂酶A2家族，对白蛋白的特异性高；(2)其高度疏水且可置换白蛋白上的结合脂肪酸酯
或脂质并且因此减少对蛋白质的低估。

[0051] 在某些实施例中，本文所描述的方法涉及检测在一时间段内产生的水解产物的量；以及基于所述时间段内水解产物的量，确定样品中白蛋白的量。

[0052] 在某些实施例中，该时间段是1秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟等。

[0053] 在某些实施例中，水解产物具有发色团特性，该发色团特性使得能够通过常见光检测器有效检测水解产物并且避免使用昂贵荧光检测器。在某些实施例中，水解产物是硝
基苯酚。在某些实施例中，水解产物通过检测器在约405nm的波长下检测。在某些实施例中，
白蛋白伪酯酶活性通过在405nm下的增加率评定。在某些实施例中，白蛋白伪酯酶活性通过
在405nm下的最终吸收增加评定。

[0054] 表1.选择性酯酶抑制剂的实施例

[0055]

[0056]

[0057] 用于检测白蛋白的试剂盒

[0058] 在另一方面中，本公开提供一种用于本文描述的方法的试剂盒。试剂盒可包括用于进行本文所描述的方法的任何和所有试剂。在这类应用中，试剂盒可包括以下各项中的
任何和所有：选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂；白蛋白的选择性底物，所述底物
具有羧酸酯键，使得当底物暴露于样品中的白蛋白时，羧酸酯键裂解以产生水解产物；白蛋
白的标准对照；以及缓冲剂。在某些实施例中，试剂盒还包括金属离子螯合剂，例如EDTA或
EGTA。在某些实施例中，试剂盒还包括一种或多种类型的元件或组件，如其它类型的生物化
学试剂、容器、包装(如旨在用于商业销售的包装)等。

[0059] 另外，试剂盒可包括含有用于实践本文所提供的方法的指南(即，方案)的说明材料。尽管说明材料典型地包含书面或印刷材料，但其不限于这些类型。本发明涵盖能够存储
这类说明并且将其传达给最终用户的任何材料。这类媒体包括但不限于电子存储媒体(例
如磁盘、磁带、盒式磁盘、芯片)、光学媒体(例如CD ROM)等。这类媒体可包括提供这类说明
材料的互联网网站的网址。

[0060] 提供以下实施例是为了更好地说明所要求的发明，并且不应理解为限制本发明的范围。以下描述的所有特定组分、材料和方法完全或部分地在本发明的范围内。这些特定组
合物、材料和方法并不旨在限制本发明，而仅说明在本发明的范围内的特定实施例。在不脱
离本发明范围的情况下，所属领域的技术人员无需履行发明能力即可开发出等同组合物、
材料和方法。应理解，可对本文所描述的程序作出变化，但仍在本发明的界限内。发明人意
在将这类变化包括在本发明的范围内。

[0061] 实施例1

[0062] 本实施例展示人血清中的白蛋白和非白蛋白酯酶活性。

[0063] 人血清使用superose‑6柱分级，接着使用14:0NPS‑PC作为探针，在存在或不存在HSA抑制剂的情况下鉴别酯酶活性。如图1中所展示，在不存在HSA抑制剂的情况下，鉴别出
酯酶活性的三个主要级分。当HSA的酯酶活性受抑制时，第三峰消失，表明最后一个峰是HSA
的酯酶活性。第一和第二峰是非白蛋白酯酶或脂肪酶活性。

[0064] 使用14:0NPS‑PC作为探针有两个优点：第一，归因于将其特异性限于仅针对磷脂酶A2(PLA2)的独特磷酸胆碱(PC)结构，非白蛋白酯酶/脂肪酶/水解酶活性较低；第二，其高
度疏水且可置换白蛋白上的结合脂肪酸酯或脂质并且因此减少对蛋白质的低估。

[0065] 实施例2

[0066] 本实施例展示一种确定生物样品中白蛋白的量的方法。

[0067] 通过向96孔板的孔中的20μl HSA溶液中添加110μl含有0.5M 14:0NPS‑PC和5mM EDTA的TBS反应缓冲液(10mM Tris‑HCl，150mM NaCl，pH 7.4)来开始反应。在SPECTRAmax 
M5读板器中在波长405nm(吸光度)下追踪反应。

[0068] 如图2中所展示，在14:0NPS‑PC由HSA水解以释放对硝基苯酚的同时，在波长405nm下的吸收增加。所述方法不需要预培育。视白蛋白浓度而定，读取时间可以是0.5到30分钟。
典型读取时间是3‑5分钟。反应时间温度可以是环境温度。

[0069] 实施例3

[0070] 本实施例展示14:0NPS‑PC是用于测量白蛋白的伪酯酶活性的有效底物。

[0071] 图3展示使用14:0NPS‑PC作为探针的HSA伪酯酶的米氏动力学。如图3中所展示，14:0NPS‑PC在HSA的伪酯酶反应中具有相对低Km，并且因此HSA浓度的测量可以灵敏且快
速。

[0072] 实施例4

[0073] 本实施例展示Pefabloc SC选择性抑制人血清中的非白蛋白酯酶活性。

[0074] 如实施例1中所展示，使用14:0NPS‑PC作为探针还鉴别出人血清中的非白蛋白酯酶活性，即PLA2活性，其主要与HDL和LDL相关。如图4中所展示，与白蛋白的伪酯酶活性相
比，人血清中的PLA2活性对Pefabloc SC或PMSF或其它苯磺酰氟抑制剂或失活剂敏感得多。
当用1.5mM 14:0NPS‑PC在pH 7.4下分析时，在15‑20mM(最终浓度)下的Pefabloc可消除所
有非白蛋白酯酶活性，但维持>90％的白蛋白酯酶活性。因此，可通过用Pefabloc SC或PMSF
或类似物抑制剂或失活剂处理生物样品，或通过在分析缓冲液中包括所述化合物来消除非
白蛋白酯酶活性。

[0075] 在分析缓冲液中包括5mM EDTA还遏制Ca2+依赖的PLA2针对14:0NPS‑PC的活性。

[0076] 实施例5

[0077] 本实施例也展现血清中在HSA与非HSA酯酶活性之间针对Pefabloc SC的敏感度差异。

[0078] 图5展示当用2mM Pefabloc SC处理时，与LDL(5mg/ml胆固醇)相关的非HSA酯酶活性在3小时培育内完全失活。在与2mM Pefabloc SC一起培育的6小时内，约80％的与HDL
(2.5mg/ml胆固醇)相关的非HSA酯酶活性耗尽，但针对在TBS、pH 7.4中44mg/ml的HSA，在相
同条件下未观察到活性损失。

[0079] 图6展示来自健康供体的20种人血清的混合物中的非HSA酯酶活性对Pefabloc SC的敏感度。当血清混合物在24℃下与≥1mM Pefabloc SC一起培育约1小时时，活性被完全
遏制。

[0080] 图7也展示来自健康供体的20种人血清的混合物中的非HSA酯酶活性对Pefabloc SC的敏感度。当人血清与1mM Pefabloc一起培育时，非HSA酯酶活性可在约10分钟内被消
除。图6和图7均表明与在分离的LDL和HDL中相比，人血清中的非HSA酯酶活性对Pefabloc 
SC更敏感。这可能归因于在分离的LDL和HDL中的TBS缓冲液，其可降低Pefabloc SC的有效
浓度。

[0081] 实施例6

[0082] 本实施例展示本公开的方法中底物/HSA比率的效应。

[0083] 在分析系统中用0.37mM 14:0NPS‑PC测量不同浓度的白蛋白的酯酶活性。如图8中所展示，当白蛋白浓度提高时，白蛋白浓度与酯酶活性之间的线形关系减少，表明分析的线
性度可能依赖于底物/白蛋白的比率。

[0084] 如图9中所展示，为了保持分析的线性度，14:0NPS‑PC/白蛋白比率应维持在待确定的白蛋白的最高浓度的至少约5倍。分析的14:0NPS‑PC浓度视生物样品数量和分析格式
体积而定。然而，底物/白蛋白比率应保持恒定或类似。

[0085] 如图10中所展示，人血清白蛋白可基于硝基苯酚的增加率(活性)或最终浓度(在405nm下的最终吸收)定量。两者均提供与白蛋白浓度的极好相关度。在所述条件下估计检
测限(LOD)为约0.1mg/ml(分析浓度)白蛋白，并且估计量化限(LOQ)为约0.4‑0.8mg/ml(分
析浓度)白蛋白。这意味着生物样品可在10‑100倍之间稀释以便测量白蛋白浓度。一些类型
的生物流体(如尿液)可在不稀释的情况下通过这一方法分析。生物流体意指血清、血浆、全
血或尿素等。样品可以是新鲜或干燥的。

[0086] 实施例7

[0087] 本实施例展示白蛋白伪酯酶活性可受金属离子影响。已知白蛋白结合某些金属离子，尤其过渡金属离子，如Ca2+和Cu2+，其通常存在于生物样品中并且影响白蛋白的伪酯酶
活性。如图11中所展示，HSA的伪酯酶活性可受Ca2+和Cu2+的存在影响。因此，在分析组分中
包括EDTA或EGTA或其它金属离子螯合剂以保持对所有生物样品的一致性。

[0088] 实施例8

[0089] 本实施例示出一种用于确定获自动物的生物样品中的白蛋白酯酶活性的方法。所述方法包含以下步骤：

[0090] (a)将分析溶液与生物样品或HAS标准品混合。分析溶液包含：1‑肉豆蔻酰基‑2‑(4‑硝基苯基丁二酰基)磷脂酰胆碱、200mM HEPES(或者，200mM Tris‑HCl)、150mM NaCl、
5mM EDTA，pH 7.4‑7.6。1‑肉豆蔻酰基‑2‑(4‑硝基苯基丁二酰基)磷脂酰胆碱的最终浓度视
生物样品中白蛋白的估计浓度而定，一般来说，为白蛋白的最终浓度的5‑10倍(mol/mol)。
监测在405nm下吸收的变化。

[0091] (b)基于以下两个曲线校准酯酶活性：

[0092] 制备曲线1使用在甲醇中包含200、100、75、50、25、10以及5nmol/μl对硝基苯酚的对硝基苯酚标准溶液中的每一种；和用于制造空白的相同体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或
ddH2O；

[0093] 制备曲线2使用在甲醇中包含4、3、2、1、0.5以及0.25nmol/μl对硝基苯酚的对硝基苯酚标准溶液中的每一种；和用于制造空白的相同体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或ddH2O。

[0094] 步骤1：通过绘制对硝基苯酚标准溶液对比对硝基苯酚浓度(纳摩尔/孔)的在405nm下的光密度(OD)值产生标准曲线；

[0095] 步骤2：计算标准曲线的斜率(OD/nmol)；

[0096] 步骤3：对于包含生物样品和空白的两种溶液计算3分钟与1分钟之间的吸光度变化(ΔOD3min‑1min，或更长，视斜率变化率而定)。

[0097] 步骤4：使用下式计算酯酶活性：

[0098] 酯酶活性(纳摩尔/分钟/毫升)＝(ΔOD样品‑ΔOD空白)/斜率(OD/nmol)/体积(ml)/2(分钟)

[0099] 实施例9

[0100] 该实施例说明了用于检测和定量血清、血浆、全血或尿液中人白蛋白的测定方法的开发。该测定方法旨在定量人体液中的正常人和疾病修饰的人白蛋白。该测定方法的特
异性是基于特定的底物结构以及通过其抑制剂或失活剂对脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp‑PLA2)
的抑制。分析试剂的成分已经过优化，可用于分析血清、血浆和全血样品中的白蛋白。

[0101] Lp‑PLA2活性是白蛋白测定的主要干扰。特异性抑制剂抑制Lp‑PLA2活性对于测定白蛋白至关重要。如图12所示，达雷帕地(Darapladib)以浓度依赖性方式抑制Lp‑PLA2。

[0102] 达雷帕地不溶于水，需要溶解在有机溶剂中。二甲基亚砜(DMSO)、EDTA和Tween‑20已用于确定有机溶剂的容许浓度。结果表明DMSO对白蛋白的测定没有影响(图13)。

[0103] 如图14所示，白蛋白量与信号增加成线性相关。还评估了该测定法的灵敏度以及检测和定量的极限，其结果示于图15和16以及下表中。

[0104]

[0105] 在一个示例性实施方式中，白蛋白检测和定量测定的制剂包括以下成份：

[0106] 试剂A：120mM Tris，pH 7.5±0.3，包含2.5mM EDTA和0.033％Tween‑20

[0107] 试剂B：在DMSO中的14.5mM 14：0NPS‑PC(1‑肉豆蔻基‑2‑(4‑硝基苯基琥珀酰基)‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱)和0.006‑0.012mM达雷帕地

[0108] 体积：人类血清或血浆的4‑17％，试剂A的79％和试剂A的4.2％。

[0109] 方案：将20μL人血清/血浆或人白蛋白标准品与95μL试剂A混合。添加5μL试剂B以开始反应。在405nm下读取反应动力学5‑30分钟，或在环境温度或稍微加热的温度(例如25‑
40℃)下孵育5‑30分钟后读取终点。

[0110] 虽然已经参照特定实施例(其中一些是优选实施例)具体地展示并描述了本公开，但所属领域的技术人员应理解，可以在不脱离如本文所公开的本公开的精神和范围的情况
下对本公开进行各种形式上和细节上的改变。