水稻OsRPS6A基因或OsRPS6B基因在提高水稻抗旱性中的应用

摘要

本发明公开了水稻OsRPS6A基因及其同源的OsRPS6B基因在提高水稻抗旱性中的应用，属于生物技术领域。所述应用包括：利用CRISPR/CAS9技术降低水稻OsRPS6A基因或OsRPS6B基因编码蛋白的表达或活性，进而获得抗干旱性能增强的水稻突变体。本发明通过利用CRISPR/Cas9系统构建水稻OsRPS6A基因及其同源的OsRPS6B基因靶位点特异性敲除的植物重组表达载体，利用转基因获得OsRPS6A基因或OsRPS6B基因功能缺陷型突变的纯合突变体植株，本发明提供了水稻OsRPS6A基因或OsRPS6B基因突变体植株在水稻抗旱性研究的新方向，在农业开发方面具有潜在的应用价值。

权利要求

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsRPS6A基因在提高水稻抗旱性中的应用，其特征在于，所述应用包括：利用CRISPR/CAS9技术沉默水稻OsRPS6A基因编码蛋白的表达，进而获得抗干旱性能增强的水稻突变体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻突变体的OsRPS6A基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的水稻OsRPS6B基因在提高水稻抗旱性中的应用，其特征在于，所述应用包括：利用CRISPR/CAS9技术沉默水稻OsRPS6B基因编码蛋白的表达，进而获得抗干旱性能增强的水稻突变体。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水稻突变体的OsRPS6B基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

5.一种提高水稻抗旱性的育种方法，其特征在于，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsRPS6A基因的靶位点Ⅰ或核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的水稻OsRPS6B基因的靶位点Ⅱ，靶位点Ⅰ的序列为：AACATCGCCAACCCGACCAC；靶位点Ⅱ为：AACATCGCGAACCCGACCAC。

6.如权利要求5所述的提高水稻抗旱性的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)针对所述的靶位点Ⅰ或靶位点Ⅱ构建CRISPR/Cas9编辑载体Ⅰ或CRISPR/Cas9编辑载体Ⅱ；

(2)将CRISPR/Cas9编辑载体Ⅰ或CRISPR/Cas9编辑载体Ⅱ转入待基因编辑的受体水稻中，培育，筛选获得功能缺陷型突变的T0代阳性植株；

(3)T0代阳性植株自交一代，筛选获得T1代纯合突变体植株，即得到抗旱性提高的水稻植株。

7.如权利要求6所述的提高水稻抗旱性的育种方法，其特征在于，所述受体水稻为粳稻品种Kitaake。

说明书

水稻OsRPS6A基因或OsRPS6B基因在提高水稻抗旱性中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及水稻OsRPS6A基因或OsRPS6B基因在提高水稻抗旱性中的应用。

背景技术

[0002] 水稻生产高度依赖于水资源，伴随着全球气候的剧烈变化，水资源短缺日益成为影响水稻稳产的重要因素，干旱胁迫影响水稻的生长发育和产量。因此，通过挖掘水稻中抗
干旱的基因资源，通过基因编辑手段改良水稻的抗干旱能力是解决水稻抗旱的重要手段。

[0003] 核糖体是催化蛋白质合成的细胞器，由一个小的40S亚单位和一个大的60S亚单位组成。RPS6(ribosomal protein S6)属于核糖体蛋白家族，它在水稻、拟南芥、人类、酵母中
非常保守。植物基因组中具有两个RPS6基因，即RPS6A和RPS6B。RPS6A和RPS6B在蛋白序列上
高度同源(Creff et al.,2010)。

[0004] 在植物中，对于拟南芥RPS6的研究较为深入。拟南芥基因组含有两个RPS6成员，分别为AtRPS6A和AtRPS6B，其编码的氨基酸序列与哺乳动物高度同源。研究表明，拟南芥RPS6
单基因缺失突变体植株表现出组织器官较小的表型，表明植物RPS6对于细胞增值有重要作
用(Creff et al.,2010)。最近研究发现拟南芥RPS6参与植株光形态建成过程中，感光后蛋
白的翻译调控，证明拟南芥RPS6参与植物细胞中蛋白的翻译(Chen et al.,2018)。

[0005] 在动物中对RPS6的诸多研究表明，RPS6在生长和发育过程中具有重要的调控作用。RPS6已被证明通过其磷酸化直接参与控制细胞大小(Ruvinsky et al.,2005)。而且
RPS6磷酸化位点突变后，细胞大小不会进一步受到雷帕霉素的影响，说明RPS6的磷酸化是
mTOR调节细胞生长的关键效应物，其缺失相当于mTOR被抑制。小鼠RPS6磷酸化位点突变的
MEFs(mouse embryonic fibroblasts)细胞蛋白质合成和分裂速度较野生型加快，该结果
解释了RPS6磷酸化位点突变后MEFs细胞尺寸较小而小鼠出生体重正常的矛盾结果
(Ruvinsky et al.,2005)。

[0006] 相对于模式动物中对RPS6蛋白的广泛研究，对水稻中RPS6基因在水稻中的表达模式和功能了解非常少，因此深入研究水稻RPS6基因在水稻生长发育的分子机制具有重要意
义。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种可调控水稻抗干旱性能的基因，通过基因改造达到提高水稻抗旱性的目的。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 本发明在NCBI基因组数据库中使用序列比对分析，以拟南芥RPS6A基因序列寻找该基因在水稻中的同源基因，找到水稻基因组中存在两个同源基因，分别命名为OsRPS6A和
OsRPS6B，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示。进而利用基因编辑技术，对水稻
OsRPS6A基因及其同源的OsRPS6B基因进行编辑，研究发现，对OsRPS6A基因和OsRPS6B基因
进行编辑获得的功能缺陷型突变的纯合株系，表现出可以提高水稻在干旱胁迫下的单株产
量，表明对OsRPS6A基因或OsRPS6B基因的重新编辑在改良水稻抗旱性方面具有一定应用价
值。

[0010] 本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsRPS6A基因在提高水稻抗旱性中的应用。

[0011] 具体地，利用CRISPR/CAS9技术沉默水稻OsRPS6A基因编码蛋白的表达，进而获得抗干旱性能增强的水稻突变体。该突变体表现出提高水稻干旱胁迫下的产量。

[0012] 作为优选，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述突变体的OsRPS6A基因的第一个外显子被插入了一个碱基A，导致氨基酸的移码，提前终止，其编码的氨基酸
序列如SEQ ID NO.6所示，使得OsRPS6A基因功能丧失。

[0013] 本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的水稻OsRPS6B基因在提高水稻抗旱性中的应用。

[0014] 具体地，利用CRISPR/CAS9技术沉默水稻OsRPS6B基因编码蛋白的表达，进而获得抗干旱性能增强的水稻突变体。

[0015] 作为优选，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。该突变体的OsRPS6B基因的第一个外显子被插入了一个碱基T，导致氨基酸的移码，提前终止，其编码的氨基酸序
列如SEQ ID NO.8所示，OsRPS6B基因功能丧失。

[0016] 本发明还提供了一种提高水稻抗旱性的育种方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsRPS6A基因的靶位点Ⅰ或核苷酸序列如SEQ 
ID NO.3所示的水稻OsRPS6B基因的靶位点Ⅱ，靶位点Ⅰ的序列为：AACATCGCCAACCCGACCAC；
靶位点Ⅱ为：AACATCGCGAACCCGACCAC。

[0017] 具体地，将所述靶位点Ⅰ或靶位点Ⅱ连入CRISPR/Cas9系统的表达载体中，构建重组表达载体；再将重组表达载体转化到受体水稻材料中，培育获得抗旱性提高的转基因植
株。

[0018] 所述育种方法，包括以下步骤：

[0019] (1)针对所述的靶位点Ⅰ或靶位点Ⅱ构建CRISPR/Cas9编辑载体Ⅰ或CRISPR/Cas9编辑载体Ⅱ；

[0020] (2)将CRISPR/Cas9编辑载体Ⅰ或CRISPR/Cas9编辑载体Ⅱ转入待基因编辑的受体水稻中，培育，筛选获得功能缺陷型突变的T0代阳性植株；

[0021] (3)T0代阳性植株自交一代，筛选获得T1代纯合突变体植株，即得到抗旱性提高的水稻植株。

[0022] 具体地，所述受体水稻为粳稻品种Kitaake。

[0023] 本发明具备的有益效果：

[0024] 本发明通过利用CRISPR/Cas9系统构建水稻OsRPS6A基因及其同源的OsRPS6B基因靶位点特异性敲除的植物重组表达载体，利用转基因获得OsRPS6A基因或OsRPS6B基因功能
缺陷型突变的纯合突变体植株，可用于分析OsRPS6A基因或OsRPS6B基因在水稻中的生物学
功能；本发明还提供了水稻OsRPS6A基因或OsRPS6B基因突变体植株在水稻抗旱性研究的新
方向，在农业开发方面具有潜在的应用价值。

附图说明

[0025] 图1为水稻、拟南芥、人类、酵母RPS6蛋白序列同源性比对图。

[0026] 图2为水稻OsRPS6A基因编辑载体示意图。

[0027] 图3为水稻OsRPS6B基因编辑载体示意图。

[0028] 图4为osrps6a突变体序列示意图。

[0029] 图5为osrps6b突变体序列示意图。

[0030] 图6为基因编辑水稻osrps6a和osrps6b突变体在干旱生长条件下苗期的照片和存活率，其中A为osrps6a突变体与野生型的比较，B为osrps6b突变体与野生型的比较。

[0031] 图7为基因编辑水稻osrps6a和osrps6b突变体在正常生长和干旱胁迫下的单株产量(A)和生物量(B)比较。

具体实施方式

[0032] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

[0033] 实施例1水稻osrps6a和osrps6b功能缺陷型突变体的获得

[0034] 为了研究水稻OsRPS6A基因和同源基因OsRPS6B的功能，利用基因编辑技术对OsRPS6A基因和同源基因OsRPS6B基因进行编辑。

[0035] 1、构建CRISPR/Cas9重组载体

[0036] 1.1在NCBI基因组数据库中使用序列比对分析，以拟南芥RPS6A基因序列寻找该基因在水稻中的同源基因，找到水稻基因组中存在两个同源基因，我们把其中一个基因命名
为OsRPS6A，其CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
另一个基因命名为OsRPS6B，其CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如
SEQ ID NO.4所示。

[0037] 将水稻OsRPS6A基因和OsRPS6B基因编码的氨基酸序列与拟南芥、人类和酵母的RPS6蛋白序列进行同源性比较分析，结果如图1所示，RPS6蛋白在真核生物中非常保守。

[0038] 1.2分别在水稻基因组中OsRPS6A和OsRPS6B基因的第一个外显子设计靶点，分析出的OsRPS6A基因突变的靶位点：AACATCGCCAACCCGACCAC；OsRPS6B基因突变的靶位点：
AACATCGCGAACCCGACCAC。结合CRISPR/Cas9系统要求设计引物，构建CRISPR/Cas9编辑载体，
如图2、图3所示。

[0039] 2、转基因水稻

[0040] 以粳稻品种Kitaake为受体材料进行转化，转化方法用农杆菌介导的水稻愈伤组织遗传转化。获得T0代转基因植株后，PCR扩增出包含靶点的片段，切胶回收后测序检测目
标位置突变的植株。

[0041] 结果如图4和图5所示，T0代转基因植株中包含纯合的OsRPS6A，OsRPS6A基因的第一个外显子(SEQ ID NO.1所示序列的第27位)被插入了一个碱基A，其核苷酸序列如SEQ ID 
NO.5，导致氨基酸的移码，osrps6a纯合突变体内OsRPS6A基因功能丧失。OsRPS6B基因的第
一个外显子(SEQ ID NO.3所示序列的第27位)被插入了一个碱基T，OsRPS6B的核苷酸序列
如SEQ ID NO.7所示，导致氨基酸的移码，osrps6b纯合突变体内OsRPS6B基因功能丧失。

[0042] 收获osrps6a和osrps6b功能缺陷型纯合突变体的种子进行下一代繁殖，对T1代纯合突变体幼苗取混合DNA样品做测序鉴定，结果显示T1代植株全部为纯合突变体植株。收获
种子为T1代基因编辑水稻，我们对T1代水稻做苗期和孕穗期干旱胁迫实验，取样做生理检
测和表型考察，确定OsRPS6A基因和同源基因OsRPS6B在水稻抗旱中的应用价值。实施例2水
稻OsRPS6A和OsRPS6B功能缺陷型突变体田间表型鉴定

[0043] 1、为了探究水稻OsRPS6A基因和OsRPS6B基因对非生物逆境是否有响应，分别把osrps6a和osrps6b功能缺陷型纯合突变体的T1种子催芽，待种子萌发后选取长势一致的芽
播种到小桶土壤中，每桶中种植野生型对照20株，突变体水稻20株，每个家系做3个生物学
重复，同时设置非胁迫对照，待幼苗四叶期时停止浇水，当敏感植株叶片不可逆全卷时复
水，恢复后统计存活率，结果发现osrps6a和osrps6b功能缺陷型纯合突变体均表现出苗期
抗干旱的表型(图6)。

[0044] 2、为了研究osrps6a和osrps6b功能缺陷型纯合突变体是否可以在孕穗期抗干旱，我们把osrps6a和osrps6b功能缺陷型纯合突变体幼苗和野生型间隔种植于水田中，在孕穗
期停止浇水至叶片全部卷叶后复水，恢复正常生长直至收获种子后统计生物量和单株产
量，发现osrps6a和osrps6b功能缺陷型纯合突变体水稻在正常生长田里生物量比野生型水
稻有显著下降，但是，在干旱处理的条件下osrps6a和osrps6b功能缺陷型纯合突变体水稻
比野生型水稻有较高的单株产量(图7)。

[0045] 这些结果说明用基因编辑方法突变水稻OsRPS6A基因和OsRPS6B基因可以提高水稻干旱胁迫下的产量。