一种或多种目标蛋白或肽纯化方法

摘要

本发明提供了一种或多种目标蛋白或肽的纯化方法，涉及生物技术领域。本发明的纯化方法利用可与DNA共价结合的HUH酶作为标签来纯化蛋白，纯化效率高，获得的纯化蛋白纯度高；而且通过不同的HUH酶标签，可以实现同时纯化多种蛋白，实现多目标蛋白纯化，纯化方法简单，条件温和。

权利要求

1.一种或多种目标蛋白或肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（a）一种目标蛋白或肽与一种HUH酶融合，和/或多种目标蛋白或肽分别与不同的HUH酶融合，形成融合蛋白；

（b）融合蛋白中加入DNA固定相，使DNA与融合蛋白结合；所述DNA为不同HUH酶特异性识别核酸序列；

（c）融合蛋白从DNA固定相上分离，再将目标蛋白或肽与HUH酶分离，获得纯化的目标蛋白；

所述HUH酶选自A*、Trwc、TYLCV‑C1核酸内切酶中的至少一种；

所述A*核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其特异性识别核酸序列为5’‑n‑CAACTTGA‑n‑3’；

所述Trwc核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其特异性识别核酸序列为5’‑n‑TGCGTATTGTCT‑n‑3’；

所述TYLCV‑C1核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，其特异性识别核酸序列为5’‑n‑TATTAC‑n‑3’；其中，所述n代表一个或多个核苷酸碱基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述n为0‑30个核苷酸碱基。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白选自GFP、ECFP、Venus、SPG、POX中的至少一种。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白或肽与HUH酶通过柔性连接肽连接。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述DNA固定相为固定有DNA序列的介质；所述介质选自磁珠、葡聚糖、玻片、硅片、聚苯乙烯薄片中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述介质为磁珠。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白从DNA固定相上分离的方法包括能打断DNA链或肽键的方法。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述能打断DNA链或肽键的方法选自DNA链置换、DNA酶酶切、蛋白酶酶切、内含肽处理中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述能打断DNA链或肽键的方法为DNA链置换。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白或肽与HUH酶分离的方法包括能打断肽键的方法。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述能打断肽键的方法选自蛋白酶酶切或内含肽处理。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述能打断肽键的方法为TEV酶酶切。

13.一种HUH酶，其特征在于，所述HUH酶选自A*、Trwc、TYLCV‑C1核酸内切酶中的至少一种；

所述A*核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述Trwc核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述TYLCV‑C1核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

14.权利要求13所述的HUH酶在目标蛋白或肽纯化中的用途。

15.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括目标蛋白或肽与HUH酶；所述HUH酶选自A*、Trwc、TYLCV‑C1核酸内切酶中的至少一种；

所述A*核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述Trwc核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述TYLCV‑C1核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其特征在于，所述目标蛋白或肽与所述HUH酶通过柔性多肽连接。

17.一种复合物，其特征在于，包括目标蛋白或肽、HUH酶和核酸序列；所述目标蛋白或肽与所述核酸序列通过HUH酶连接；所述HUH酶选自A*、Trwc、TYLCV‑C1核酸内切酶中的至少一种；

所述A*核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其特异性识别核酸序列为5’‑n‑CAACTTGA‑n‑3’；

所述Trwc核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其特异性识别核酸序列为5’‑n‑TGCGTATTGTCT‑n‑3’；

所述TYLCV‑C1核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，其特异性识别核酸序列为5’‑n‑TATTAC‑n‑3’；其中，所述n代表一个或多个核苷酸碱基。

18.根据权利要求17所述的复合物，其特征在于，所述目标蛋白或肽与HUH酶形成融合蛋白。

19.根据权利要求18所述的复合物，其特征在于，所述目标蛋白或肽与所述HUH酶通过柔性多肽连接。

说明书

一种或多种目标蛋白或肽纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种或多种目标蛋白或肽的纯化方法。

背景技术

[0002] 生物技术行业中，通常蛋白是通过细胞培养产生，采用通过插入含有蛋白编码基因的重组质粒而工程化为生产目的蛋白的哺乳动物或细菌细胞系。细胞在表达靶蛋白的同时也会表达很多其它的蛋白，将所需的蛋白与其它蛋白分离和纯化以达到足以用作人治疗剂的纯度水平是非常重要的环节，大规模且经济地纯化蛋白对于生物技术产业来说，已成为一个日益重要的问题。

[0003] 亲和层析分离技术(Affinity Chromatography)是一种基于生物分子间的特异性结合而开发的蛋白纯化方法，生物分子间的特异性包括抗原抗体的识别、生物素亲和素的结合、辅酶与酶的亲和、金属螯合吸附、多核苷酸和核酸配体等。亲和层析有着结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和等优点，使得该技术在高纯度蛋白纯化、蛋白质结构功能研究上应用广泛。现有常用的亲和纯化方法有：His标签纯化(His‑tag，Nature.1975Dec18；258(5536):598‑9)，Strep标签纯化(Strep‑tagⅡ，Nat Protoc.2007；2(6):1528‑35)，FLAG标签纯化(FLAG‑tag，Nature Biotechnology 6，1204–1210(1988))，GST标签纯化(GST‑tag，Cell.1997Aug 8；90(3):549‑58.)等。

[0004] 但上述应用广泛的蛋白纯化方法存在诸多问题，例如His标签纯化的蛋白纯度不高，杂质较多。GST标签纯化中，GST标签分子量大，影响蛋白活性以及后续实验。针对难以纯化的蛋白，采用多标签联用是有效的方法，但当多个蛋白带有上述标签时，无法分离纯化蛋白，不能实现多目标蛋白的纯化。现有的蛋白纯化方法少，已经无法满足实验和市场需求。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明致力于提供一种或多种目标蛋白或肽的纯化方法，能够。同时纯化多种蛋白，且纯化方法简单，条件温和，纯化效率高，获得的纯化蛋白纯度高。

[0006] 本发明第一方面提供了一种或多种目标蛋白或肽的纯化方法，包括以下步骤：

[0007] (a)一种目标蛋白或肽与一种HUH酶融合，和/或多种目标蛋白或肽分别与不同的HUH酶融合，形成融合蛋白；

[0008] (b)融合蛋白中加入DNA固定相，使DNA与融合蛋白结合；所述DNA为不同HUH酶特异性识别核酸序列；

[0009] (c)融合蛋白从DNA固定相上分离，再将目标蛋白或肽与HUH酶分离，获得纯化的目标蛋白。

[0010] HUH酶指的是HUH核酸内切酶，其主要功能是利用活性位点酪氨酸残基催化单链DNA的裂解和再连接，使其与DNA底物形成瞬时的5′‑磷酸酪氨酸键。对于HUH酶具体种类不作限定，可以根据不同酶特异性识别序列以及不同的目标蛋白或肽自由选择不同的HUH酶。

[0011] 本发明利用可与DNA共价结合的HUH酶作为标签，将目标蛋白或肽融合至已含HUH酶标签的表达载体上制备成融合蛋白，利用融合蛋白中HUH酶对DNA的共价结合先使融合蛋白连接于DNA固定相，DNA固定相从混合物中分离出融合蛋白(只包含单一的目标蛋白或肽)，再通过打断DNA链或肽键的方法使融合蛋白从DNA固定相上分离，最后使用能打断肽键的方法将目标蛋白或肽与HUH酶分离，最终获得单一的目标蛋白或肽，达到了纯化蛋白或肽的目的。

[0012] 本发明中由于使用的HUH酶标签与特定序列核酸共价结合，特异性强、结合力高，因此获得的纯化蛋白纯度高；此外，通过不同的HUH酶标签，可以实现同时纯化多种蛋白，实现多目标蛋白纯化，纯化方法简单，条件温和。

[0013] 进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述HUH酶选自A*、Trwc、TYLCV核酸内切酶中的至少一种。

[0014] A*核酸内切酶(A*蛋白酶)来源于噬菌体phi X174，在病毒DNA复制中起重要作用，可以切割复制起始位点并共价连接核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明中的A*蛋白酶有5处碱基位点进行突变，突变位点为G6P、G84P、G88P、G130P、G148P，突变后的A*蛋白酶性质更加稳定。

[0015] Trwc核酸内切酶(Trwc蛋白酶)，E.Coli来源，编码于质粒R388，N端(1‑293)具有DNA转移活性，特异识别oriT上序列，参与质粒核酸的滚环复制，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明中的Trwc蛋白酶有4处碱基位点进行突变，突变位点为G13P、G22P、G31P、G141P，突变后的Trwc蛋白酶性质更加稳定。

[0016] TYLCV核酸内切酶优选TYLCV‑C1蛋白酶。TYLCV‑C1蛋白酶为番茄黄化曲叶病毒的复制相关蛋白(Replication‑associated protein)，为该病毒的C1基因编码，在病毒单链DNA的复制中起着重要作用。其在病毒基因间隔区域的识别序列上进行剪切引入缺口，从而启动滚环复制(rolling circle replication，RCR)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。本发明中的A*蛋白酶有5处碱基位点进行突变，突变位点为A11C、E55R、P56L、R74P、R83P，突变后的TYLCV‑C1蛋白酶性质更加稳定。

[0017] 进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述A*酶特异性识别核酸序列为5’‑n‑CAACTTGA‑n‑3’，和/或；

[0018] 所述Trwc酶特异性识别核酸序列为5’‑n‑TGCGTATTGTCT‑n‑3’(SEQ ID NO：7)，和/或；

[0019] 所述TYLCV‑C1酶特异性识别核酸序列为5’‑n‑TATTAC‑n‑3’，优选识别识别核酸序列为5’‑CGTATAATATTAC(SEQ ID NO：8)序列；

[0020] 其中，所述n代表一个或多个核苷酸碱基；优选地，所述n为0‑30个核苷酸碱基。

[0021] 在本发明一种优选地的实施方式中，所述A*酶特异性识别核酸序列为CAACTTGATACATACATCATCCCTCATTCA(SEQ ID NO：9)，画横线部分为识别位点，和/或；

[0022] 所述Trwc酶特异性识别核酸序列为GGTGCGTATTGTCTATACATCATCCCTCATTCA，画横线部分为识别位点，(SEQ ID NO：10)和/或；

[0023] 所述TYLCV‑C1酶特异性识别核酸序列为CGTATAATATTACCGGATGGCCGCGCCATACATCATCCCTCATTCA(SEQ ID NO：11)，画横线部分为识别位点。

[0024] 进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述目标蛋白选自GFP、ECFP、Venus、SPG、POX中的至少一种。

[0025] GFP即绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein)，ECFP为青色(蓝绿色)荧光蛋白，Venus为黄色荧光蛋白，SPG为链球菌G蛋白，POX为丙酮酸氧化酶。

[0026] 进一步，所述目标蛋白或肽与HUH酶直接连接或通过柔性连接肽连接；优选地，所述目标蛋白或肽与HUH酶通过柔性连接肽连接形成融合蛋白。

[0027] 所述柔性连接肽可依据目标蛋白的结构、性质等进行选择。柔性连接肽的序列，例如可为GGGSGGSG、(GGGGS)6、(GGGGS)5、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、GGGG、GSGGSG、GSGGSGGGSGGSGGG、GGGGSGGG、GSGGSGGG、GGGGSGGGSGG等。优选地，所述TYLCV‑C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过GGGGS连接。

[0028] 进一步，所述DNA固定相为固定有DNA序列的介质；所述介质选自磁珠、葡聚糖、玻片、硅片、聚苯乙烯薄片中的至少一种；更优选磁珠。

[0029] 进一步，所述融合蛋白从DNA固定相上分离的方法包括能打断DNA链或肽键的方法；

[0030] 优选地，所述能打断DNA链或肽键的方法选自DNA链置换、DNA酶酶切、蛋白酶酶切、内含肽处理中的至少一种；更优选DNA链置换。

[0031] 在本发明的一种实施方式中，一种目标蛋白或肽的纯化方法，包括以下步骤：

[0032] (1)一种目标蛋白或肽与一种HUH酶通过分子克隆融合和表达，形成融合蛋白；

[0033] (2)包含融合蛋白的混合物中加入DNA固定相(固定有HUH酶识别核酸序列的磁珠)，使磁珠上的DNA与融合蛋白中HUH酶结合，融合蛋白被固定在DNA固定相上；

[0034] (3)通过DNA链置换的方法使融合蛋白从DNA固定相上分离，置换出融合蛋白；

[0035] (4)再在融合蛋白中加入TEV酶切，打断肽键使目标蛋白或肽与HUH酶分离，获得纯化的目标蛋白。

[0036] 在本发明一种实施方式中，多种目标蛋白或肽的纯化方法，包括以下步骤：

[0037] (1)多种目标蛋白或肽分别与不同的HUH酶通过分子克隆融合和表达，形成不同的融合蛋白；

[0038] (2)包含不同融合蛋白的混合物中先加入第一种DNA固定相(固定有HUH酶识别核酸序列的磁珠)，使磁珠上的DNA与融合蛋白中HUH酶的结合，融合蛋白被固定在第一种DNA固定相上；

[0039] (3)通过DNA链置换的方法使融合蛋白从DNA固定相上分离，置换出融合蛋白，收集备用；

[0040] (4)包含不同融合蛋白的混合物中加入再加入第二种DNA固定相，融合蛋白被固定在第二种DNA固定相上；再重复步骤(3)；

[0041] (5)重复步骤(4)至全部不同的融合蛋白被分别分离出；

[0042] (6)在不同的融合蛋白中分别加入TEV酶切，打断肽键使目标蛋白或肽与HUH酶分离，获得纯化后的不同目标蛋白。

[0043] 使用DNA链置换将融合蛋白从磁珠中分离出来，效率高，无需引入多余蛋白或者试剂，使获得的蛋白纯度更高。

[0044] 本发明第二方面提供了所述的HUH酶在目标蛋白或肽纯化中的用途。

[0045] 本发明第三方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括目标蛋白或肽与HUH酶。

[0046] 示例性地，所述目标蛋白或肽与所述HUH酶直接连接或通过柔性多肽连接。

[0047] 进一步，所述HUH酶选自A*、Trwc、TYLCV核酸内切酶中的至少一种。

[0048] 所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：通过基因重组将目标蛋白与HUH酶融合形成融合蛋白，以及任选地，将所述融合蛋白进行表达。

[0049] 本发明第四方面提供了一种复合物，包括目标蛋白、HUH酶和核酸序列；所述目标蛋白与所述核酸序列通过HUH酶连接。

[0050] 进一步，所述目标蛋白与HUH酶形成融合蛋白；优选所述目标蛋白或肽与所述HUH酶直接连接或通过柔性多肽连接。

[0051] 进一步，所述HUH酶选自A*、Trwc、TYLCV核酸内切酶中的至少一种。

[0052] 所述复合物的制备方法包括如下步骤：将连接有所述目标蛋白的HUH酶与所述目标核酸(HUH酶特异性识别核酸)相混合。

[0053] 在本发明的一个具体实施方式中，所述制备方法还包括在连接有所述目标蛋白的HUH酶与所述目标核酸相混合的混合物中加入金属离子，例如锰离子、镁离子、钙离子等。

[0054] 本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

[0055] 本发明提供了一种或多种目标蛋白或肽的纯化方法，利用可与DNA共价结合的HUH酶作为标签来纯化蛋白，纯化效率高，获得的纯化蛋白纯度高；而且通过不同的HUH酶标签，可以实现同时纯化多种蛋白，实现多目标蛋白纯化，纯化方法简单，条件温和。

附图说明

[0056] 图1所示为实施例1中多种目标蛋白或肽的纯化方法的步骤示意图。

[0057] 图2所示为DNA链置换分离蛋白原理图。

[0058] 图3所示为实施例1中多种目标蛋白‑HUH酶融合蛋白与核酸复合物的电泳结果图，泳道1为Venus‑TYLCV‑C1‑DNA，泳道2为ECFP‑Trwc‑DNA，泳道3为A*‑GFP‑DNA。

[0059] 图4为实施例1中GFP、ECFP、Venus三种蛋白纯化后的电泳图。泳道1为纯化后GFP，泳道为纯化后ECFP，泳道3为纯化后Venus。

[0060] 图5为实施例3中验证Trwc蛋白酶突变前后稳定性差异结果图。

[0061] 图6为实施例4中验证TYLCV‑C1蛋白酶突变前后稳定性差异结果图。

具体实施方式

[0062] 除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

[0063] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0064] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0065] 下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。

[0066] 实施例1多种目标蛋白或肽的纯化方法

[0067] 本实施例中以荧光蛋白GFP、ECFP、Venus为例作为目标蛋白，将其分别与A*、Trwc、TYLCV酶标签进行融合与表达。

[0068] 本实施例中提供的目标蛋白与HUH酶标签通过基因融合的方案进行连接，其也可采用其他方式连接，如：化学修饰或非共价结合等。

[0069] 1、目标蛋白与HUH酶标签的融合、表达

[0070] (1)融合蛋白的克隆：人工合成荧光蛋白GFP、ECFP、Venus与A*、Trwc、TYLCV酶标签的核苷酸序列。其中，荧光蛋白GFP、ECFP、Venus的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示；A*、Trwc、TYLCV酶标签的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5所示。

[0071] 通过分子克隆将多目标蛋白(以荧光蛋白GFP、ECFP、Venus为例)与HUH酶标签(以本发明筛选改造的A*、Trwc、TYLCV酶为例)融合，通过柔性多肽以及蛋白酶切位点连接融合连接形成融合蛋白。

[0072] (2)融合蛋白的表达：融合蛋白的基因被克隆入表达载体PET32a(可在多种表达载体和表达宿主中良好表达，本实施例描述在大肠杆菌中的表达)。将构建的融合蛋白表达载体转化到大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，挑取阳性克隆。将挑取的阳性克隆转接到LB培养基，37℃、振荡培养至对数生长期(OD值约为0.5)。向培养物中加入工作终浓度为1mM的IPTG，25℃、振荡培养诱导蛋白表达8小时，收集菌体。

[0073] 2、目标蛋白的分离

[0074] (1)固定有被识别核酸序列磁珠的制备：分别将3种HUH酶识别序列的1nmol的Seq A与生物素化的Seq C以1：1混合，退火形成双链，退火程序为80度，5分钟；55度5分钟；37度3分钟；

[0075] A*酶识别的Seq A‑A*核酸序列如SEQ ID NO：9所示；Trwc酶识别的Seq A‑Trwc核酸序列如SEQ ID NO：10所示；TYLCV‑C1酶识别的Seq A‑TYLCV‑C1核酸序列如SEQ ID NO：11所示；Seq C的核酸序列如SEQ ID NO：15所示。

[0076] (2)菌体破碎后离心取上清，在上清中加入固定有A*识别核酸序列的磁珠，加入终浓度4mM的镁离子，37度，反应30min，加磁场分离磁珠，得到固定有GFP‑A*的磁珠以及反应后上清；

[0077] (3)向步骤(1)中去除磁珠后的上清中加入固定有Trwc识别核酸序列的磁珠，补充2mM镁离子，37度，反应30min，加磁场分离磁珠，得到固定有Trwc‑ECFP的磁珠。

[0078] (4)向步骤(2)中去除磁珠后的上清中加入固定有TYLCV‑C1酶识别核酸序列的磁珠，加入终浓度4mM的锰离子，37度，反应30min，加磁场分离磁珠，得到固定有Venus‑TYLCV的磁珠以及反应后上清；

[0079] 目标蛋白分离的原理如图1所示，利用融合蛋白中HUH酶对DNA的共价结合先使融合蛋白连接于DNA固定相(磁珠)，DNA固定相从混合物中分离出融合蛋白(只包含单一的目标蛋白或肽)，再通过DNA链置换使融合蛋白从DNA固定相上分离。

[0080] 上述反应后3种磁珠即为固定有目标蛋白的载体，用于下一步纯化。

[0081] 3、目标蛋白的纯化

[0082] (1)通过DNA链置换原理置换出蛋白(原理如图2)，上述3种磁珠使用磷酸盐溶液洗3遍，除去非特异性结合蛋白，随后向其中分别加入引发链置换反应的核酸序列Seq B(核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示)，均加入镁离子至终浓度12.5mM室温反应10min，置换出目标蛋白，加磁场去除磁珠，取上清，得到的即为目标蛋白与HUH酶标签融合蛋白(电泳图如3所示)。

[0083] (2)向上述3种融合蛋白中分别加入含HIS标签的重组TEV酶切30min，使用NTA‑镍材料去除TEV酶，获得纯化的单一目标蛋白，三种蛋白纯化后的电泳图如图4所示。

[0084] 实施例2单一目标蛋白或肽的纯化方法

[0085] 本实施例中以荧光蛋白Venus为例作为目标蛋白，将其与TYLCV酶标签进行融合与表达。

[0086] 1、目标蛋白与HUH酶标签的融合、表达

[0087] (1)融合蛋白的克隆：人工合成荧光蛋白Venus与TYLCV酶标签的核苷酸序列。其中，荧光蛋白Venus的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；TYLCV酶标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

[0088] 通过分子克隆将多目标蛋白(以荧光蛋白Venus为例)与HUH酶标签(以本发明筛选改造的TYLCV酶为例)融合，通过柔性多肽以及蛋白酶切位点连接融合连接形成融合蛋白。

[0089] (2)融合蛋白的表达：与实施例1相同。

[0090] 2、目标蛋白的分离

[0091] (1)菌体破碎后离心取上清，在上清中加入固定有TYLCV酶识别核酸序列的磁珠，加入终浓度4mM的锰离子，37度，反应30min，加磁场分离磁珠，得到固定有Venus‑TYLCV的磁珠以及反应后上清。反应后磁珠即为固定有目标蛋白的载体，用于下一步纯化。

[0092] 3、目标蛋白的纯化

[0093] (1)通过DNA链置换原理置换出蛋白(原理如图2)，上述磁珠使用磷酸盐溶液洗3遍，除去非特异性结合蛋白，随后向其中分别加入引发链置换反应的核酸序列B(核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)，均加入镁离子至终浓度12.5mM室温反应10min，置换出目标蛋白，加磁场去除磁珠，取上清，得到的即为目标蛋白与HUH酶标签融合蛋白。

[0094] (2)向上述融合蛋白中加入含HIS标签的重组TEV酶切30min，使用NTA‑镍材料去除TEV酶，获得纯化的单一目标蛋白。

[0095] 实施例3

[0096] 验证突变前Trwc蛋白酶、与突变后Trwc蛋白酶(突变位点为G13P、G22P、G31P、G141P)的蛋白稳定性差异，将前述突变前后的两种Trwc蛋白酶配制成澄清溶液于4度放置一周后观察，观察结果如图5所示。

[0097] 从图5可以看出，左侧离心管管内突变后的蛋白溶液依然保持澄清的状态，而右侧离心管管内突变前的蛋白蛋白溶液有明显沉淀现象，证明了突变后的Trwc蛋白酶性质更加稳定。

[0098] 实施例4

[0099] 验证突变前TYLCV‑C1蛋白酶、与突变后TYLCV‑C1蛋白酶(突变位点为A11C、E55R、P56L、R74P、R83P)的蛋白稳定性差异，将前述突变前后的两种TYLCV‑C1蛋白酶配制成澄清溶液于4度放置一周后观察，观察结果如图6所示。

[0100] 从图6可以看出，左侧离心管管内突变后的蛋白溶液依然保持澄清的状态，而右侧离心管管内突变前的蛋白蛋白溶液底部出现了沉淀现象，证明了突变后的TYLCV‑C1蛋白酶性质更加稳定。

[0101] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。