植酸酶突变体及其编码基因和应用转让专利
申请号 : CN202110446308.9
文献号 : CN112852779B
文献日 : 2021-09-10
发明人 : 张大伟 , 盖园明 , 望松柏
申请人 : 中国科学院天津工业生物技术研究所
摘要 :
本发明属于基因工程领域，具体涉及优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用。其基于SEQ ID NO.2所示的植酸酶的第77位、第81位、第219位、第293位或者第294位氨基酸被替换。本发明的经过改良的植酸酶突变体的比酶活同野生型植酸酶进行比较，比酶活得到不同程度（10%‑63%）的提高。本发明的改良的植酸酶在动物饲料添加领域具有良好的应用前景。
权利要求 :
1.改良的植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.2的植酸酶仅存在如下突变任意之一种：第77位由Y突变为F；第81位由G突变为R；第219位由E突变为R；第293位由D突变为H或R；第294位由D突变为R。
2.如权利要求1所述的改良的植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.2的植酸酶仅存在第77位由Y突变为F或者第293位由D突变为R。
3.如权利要求1或2所述的改良的植酸酶突变体的编码基因。
4.包含如权利要求3所述的编码基因的表达载体。
5.包含如权利要求3所述的编码基因或如权利要求4所述的表达载体的非全能性的重组宿主细胞。
6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，是毕赤酵母。
7.如权利要求1或2所述的改良的植酸酶突变体在水解植酸中的应用。
8.如权利要求1或2所述的改良的植酸酶突变体作为饲料添加剂或食品添加剂的应用。
说明书 :
植酸酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及基因工程领域，更具体涉及植酸酶突变体及其基因、工程菌和制备方法。
背景技术
[0002] 植酸即肌醇六磷酸，为磷酸的储存库，广泛存在于植物种子中。由于矿物质结合在蛋白‑植酸‑矿物元素复合物中，因此就降低了某些植物性食物和一些植物蛋白分离物中矿
物质的营养效价。植酸酶(Phytase)，即肌醇六磷酸水解酶，是一种重要的饲料添加剂，能够
催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸，将植酸盐上螯合的多种矿物质离子
2+ 2+ 2+ 2+
(Zn , Ca , Mg , Fe 等)和氨基酸、蛋白质等营养物质释放出来，进而增加饲料的营养利
用率。植酸酶的添加，也在一定程度上缓解单胃动物（猪）、家禽等对无机磷的摄入需求压
力，减少无机磷的人工添加和无效排放，极大程度上减轻磷排放造成的环境污染。
物质的营养效价。植酸酶(Phytase)，即肌醇六磷酸水解酶，是一种重要的饲料添加剂，能够
催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸，将植酸盐上螯合的多种矿物质离子
2+ 2+ 2+ 2+
(Zn , Ca , Mg , Fe 等)和氨基酸、蛋白质等营养物质释放出来，进而增加饲料的营养利
用率。植酸酶的添加，也在一定程度上缓解单胃动物（猪）、家禽等对无机磷的摄入需求压
力，减少无机磷的人工添加和无效排放，极大程度上减轻磷排放造成的环境污染。
[0003] 植酸酶的来源非常广泛，许多动物、植物、微生物都能够产生植酸酶。因为植酸分子具有特殊的立体构象，植酸酶开始水解植酸具有立体专一性。植酸分子由肌醇环和 6个
磷酸基团通过磷酸单酯键连接构成。立体构象中，5个磷酸基团处于对称平面位置, 剩下的
1个磷酸基团处于垂直轴向位置。根据立体专一性的不同，植酸酶可分为3‑植酸酶(3‑
Phytase, EC 3.1.3.8)、6‑植酸酶(6‑Phytase, EC 3.1.3.26)和5‑植酸酶(5‑Phytase, EC
3.1.3.72)。需要注意的是，大多数植酸酶仅能水解植酸的部分磷酸基团，并且水解偏好共
面的5个磷酸基团，而一般不能释放C2位轴向的磷酸基团。已有报道的仅有少数植酸酶，如
来源于卡氏德巴利酵母（Debaryomyces castellii）和小麦的植酸酶能够水解植酸的所有
磷酸键。
磷酸基团通过磷酸单酯键连接构成。立体构象中，5个磷酸基团处于对称平面位置, 剩下的
1个磷酸基团处于垂直轴向位置。根据立体专一性的不同，植酸酶可分为3‑植酸酶(3‑
Phytase, EC 3.1.3.8)、6‑植酸酶(6‑Phytase, EC 3.1.3.26)和5‑植酸酶(5‑Phytase, EC
3.1.3.72)。需要注意的是，大多数植酸酶仅能水解植酸的部分磷酸基团，并且水解偏好共
面的5个磷酸基团，而一般不能释放C2位轴向的磷酸基团。已有报道的仅有少数植酸酶，如
来源于卡氏德巴利酵母（Debaryomyces castellii）和小麦的植酸酶能够水解植酸的所有
磷酸键。
[0004] 卡氏德巴利酵母来源的植酸酶虽然能够水解植酸盐的所有磷酸基团，是比较有应用潜力的植酸酶，但是其野生菌产酶水平并不高，利用毕赤酵母等植酸酶常用表达宿主进
行分泌表达后，酶活也远不能达到饲料工业产业化需求。比酶活低极大限制了该植酸酶的
潜在市场应用。因此，迫切需要获得比酶活提高的卡氏德巴利酵母植酸酶突变体，进一步推
动该酶在市场上的应用。
行分泌表达后，酶活也远不能达到饲料工业产业化需求。比酶活低极大限制了该植酸酶的
潜在市场应用。因此，迫切需要获得比酶活提高的卡氏德巴利酵母植酸酶突变体，进一步推
动该酶在市场上的应用。
[0005] 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向编码目的蛋白的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添
加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是
基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物学领域研究中的一种
重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系
的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨
基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功
能的关系。近几年酶的定点突变技术应用主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、
提高热稳定性、对映立体选择等方面。酶的定点突变技术为改造酶的结构和功能开辟了崭
新的途径。
加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是
基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物学领域研究中的一种
重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系
的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨
基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功
能的关系。近几年酶的定点突变技术应用主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、
提高热稳定性、对映立体选择等方面。酶的定点突变技术为改造酶的结构和功能开辟了崭
新的途径。
发明内容
[0006] 本发明的目的是通过对卡氏德巴利酵母来源的植酸酶进行改造，使改造后的植酸酶突变体具有更高的比酶活。
[0007] 本发明是以卡氏德巴利酵母来源的野生型的植酸酶作为改造模板，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008] 本发明采用定点突变的方法对SEQ ID NO.2所示的植酸酶进行改造。在植酸酶DC phytase的第77位、第81位、第219位、第293位、或者第294位进行单点突变。第77位突变为
Y77F；第81位突变为G81R；第219位突变为E219R；第293位突变为D293H或D293R；第294位突
变为D294R。原位点为各位置编号之前的氨基酸，突变后氨基酸为在位置编号之后提及的氨
基酸。根据所取代的位置和氨基酸，与野生型的植酸酶相比较，单点突变的植酸酶突变体的
比酶活提高10%‑63%。
Y77F；第81位突变为G81R；第219位突变为E219R；第293位突变为D293H或D293R；第294位突
变为D294R。原位点为各位置编号之前的氨基酸，突变后氨基酸为在位置编号之后提及的氨
基酸。根据所取代的位置和氨基酸，与野生型的植酸酶相比较，单点突变的植酸酶突变体的
比酶活提高10%‑63%。
[0009] 本发明还提供所述植酸酶突变体的编码基因，其编码上述的在单个位置具有所述可能改变的本发明植酸酶之一，特别是基于SEQ ID NO.2在上述氨基酸位置上发生氨基酸
取代的植酸酶。更优选是基于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的突变以编码所述植酸酶突变
体。
取代的植酸酶。更优选是基于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的突变以编码所述植酸酶突变
体。
[0010] 本发明还提供包含本发明的植酸酶突变体的编码基因的重组表达载体。
[0011] 本发明还提供包含本发明的植酸酶突变体的编码基因或其重组表达载体的重组宿主细胞。优选重组宿主细胞是毕赤酵母。
[0012] 本发明具有以下优点和益处：本发明的植酸酶突变体，以卡氏德巴利酵母来源的植酸酶为基础，选择第77位、第81位、第219位、293位或者第294位的氨基酸发生如下突变：
第77位：Y77F；第81位： G81R；第219位：E219R；第293位：D293H或D293R；第294位：D294R。与
卡氏德巴利酵母来源的野生型植酸酶相比较，突变体的比酶活提高幅度可达到10% ‑63%。
改造后的植酸酶突变体可以用于基于原核表达系统和真核表达系统进行发酵生产。
第77位：Y77F；第81位： G81R；第219位：E219R；第293位：D293H或D293R；第294位：D294R。与
卡氏德巴利酵母来源的野生型植酸酶相比较，突变体的比酶活提高幅度可达到10% ‑63%。
改造后的植酸酶突变体可以用于基于原核表达系统和真核表达系统进行发酵生产。
附图说明
[0013] 附图1 为重组质粒pPIC9K‑DC phytase图谱。
[0014] 附图2 为卡氏德巴利酵母植酸酶突变体与原始野生型植酸酶的比酶活比较图。
[0015] 附图3 为产肌醇反应体系底物植酸钠及产物磷酸、肌醇标准品的高效液相色谱检测峰图。
[0016] 附图4 为野生型卡氏德巴利酵母植酸酶及比酶活提高的植酸酶突变体水解植酸钠产肌醇反应体系的高效液相色谱检测峰图。
具体实施方式
[0017] 下面通过实施例对本发明进行详细说明。但不构成对本发明的限制。
[0018] 其中，所用到的实验材料及试剂如下:
[0019] 1.实验材料
[0020] （1）菌株和载体：大肠杆菌DH5α，毕赤酵母GS115和毕赤酵母表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司。
[0021] （2）酶与试剂盒：Kpn 2I内切酶购自Thermo 公司。PrimeSTAR Max DNA Polymerase购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自Omega公司。
[0022] （3）试剂：G418（Geneticin,遗传霉素）购自BIOFROXX公司；酵母粉、蛋白胨购自OXOID公司；植酸钠、YNB购自上海源叶生物科技有限公司，乙酸钠购自上海麦克林生化科技
有限公司；钼酸铵、偏矾酸铵、甲醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaCl、葡萄糖购
自生工生物工程(上海)股份有限公司；甘油购自天津基准化学试剂有限公司；生物素购自
北京索莱宝科技有限公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
有限公司；钼酸铵、偏矾酸铵、甲醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaCl、葡萄糖购
自生工生物工程(上海)股份有限公司；甘油购自天津基准化学试剂有限公司；生物素购自
北京索莱宝科技有限公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0023] 2.培养基
[0024] 大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH 7.0)；
[0025] 酵母培养基MD(1.34％YNB，2％葡萄糖，4×10‑5％Biotin，1.5%琼脂);
[0026] 酵母培养基YPD（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖）；
[0027] 酵母培养基BMGY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、4×10‑5％Biotin、1％甘油（V/V）、1%磷酸钾盐缓冲液（pH6.0））；酵母甲醇诱导培养基BMMY（1％酵母提取物、2％蛋白
‑5
胨、1.34％YNB、4×10 ％Biotin、1％甲醇（V/V）、1%磷酸钾盐缓冲液（pH6.0））。
‑5
胨、1.34％YNB、4×10 ％Biotin、1％甲醇（V/V）、1%磷酸钾盐缓冲液（pH6.0））。
[0028] 实施例1 构建野生型植酸酶表达质粒
[0029] 按照毕赤酵母密码子进行优化，通过全基因合成技术（北京擎科生物科技有限公司）获得SEQ ID NO.1所示的野生型的卡氏德巴利酵母植酸酶基因（编码的氨基酸序列为
SEQ ID NO.2），并在蛋白的C端加上6个组氨酸标签，由基因合成公司构建到pPIC9K载体上，
构建好的质粒命名为pPIC9K‑DC phytase，质粒图谱如图1所示。
SEQ ID NO.2），并在蛋白的C端加上6个组氨酸标签，由基因合成公司构建到pPIC9K载体上，
构建好的质粒命名为pPIC9K‑DC phytase，质粒图谱如图1所示。
[0030] 实施例2 基因定点突变
[0031] 本发明通过多种策略筛选比酶活更高的突变位点。对野生型卡氏德巴利酵母植酸酶（PDB:2GFI）和底物（植酸）进行了分子对接，对酶和底物结合6Å范围内的氨基酸进行理性
设计，通过分子动力学模拟确定突变后酶和底物结合的亲和力更高的突变点。该部分我们
设计选取了卡氏德巴利酵母植酸酶第77位、第82位、第86位、第122位、第223位、第368位和
第461位共计7个位点的氨基酸发生如下突变：Y77F，S82Q，Y86L，E122N，T223K，H368V，
S461R。最终筛选确定Y77F突变体的比酶活与野生型植酸酶相比较可得到63%的明显提升。
设计，通过分子动力学模拟确定突变后酶和底物结合的亲和力更高的突变点。该部分我们
设计选取了卡氏德巴利酵母植酸酶第77位、第82位、第86位、第122位、第223位、第368位和
第461位共计7个位点的氨基酸发生如下突变：Y77F，S82Q，Y86L，E122N，T223K，H368V，
S461R。最终筛选确定Y77F突变体的比酶活与野生型植酸酶相比较可得到63%的明显提升。
[0032] 另一改造策略是通过理性设计使得底物植酸能够更多的聚集到反应中心。由于底物植酸是电负性，而2GFI同底物的结合口袋也是一个电负性的区域，因此，通过计算机模拟
突变，设计改造2GFI与底物的结合口袋的氨基酸的电性，使其能够往正电性的属性转变，达
到更好地结合植酸的目的。该部分我们设计选取了卡氏德巴利酵母植酸酶第80位、第81位、
第212位、第219位、第293位和第294位共计6个位点的氨基酸发生如下突变：T80R、G81R、
D212R、E219R、D293R、D293H、D294R、D294H。最终筛选确定G81R、E219R、D293R、D293H、D294R
这5个突变体有效，这些突变体的比酶活与野生型植酸酶相比较有不同程度（10%‑50%）的提
升。
突变，设计改造2GFI与底物的结合口袋的氨基酸的电性，使其能够往正电性的属性转变，达
到更好地结合植酸的目的。该部分我们设计选取了卡氏德巴利酵母植酸酶第80位、第81位、
第212位、第219位、第293位和第294位共计6个位点的氨基酸发生如下突变：T80R、G81R、
D212R、E219R、D293R、D293H、D294R、D294H。最终筛选确定G81R、E219R、D293R、D293H、D294R
这5个突变体有效，这些突变体的比酶活与野生型植酸酶相比较有不同程度（10%‑50%）的提
升。
[0033] 基于上述筛选到的突变位点，以重组质粒pPIC9K‑DC phytase为PCR扩增模板，每个植酸酶突变体通过PCR反应引入一个点突变（引物参考表2）获得。以构建pPIC9K‑DC
phytase‑D293R质粒为例，PCR体系如下：
phytase‑D293R质粒为例，PCR体系如下：
[0034]
[0035] PCR扩增条件：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min/2 kb，30 cycles；72℃ 4 min。PCR模板为pPIC9K‑DC phytase，引物为D293R‑F和D293R‑R，PCR产物经回收后，
用Dpn I 37℃ 酶切4 h，去除模板DNA，随后回收溶解至30 μL无菌dd H2O中，转化DH5α。挑
取单菌落送测序，提取测序正确的质粒备用。以相同方法构建其余突变质粒，获得的质粒分
别命名为pPIC9K‑DC phytase(Y77F), pPIC9K‑DC phytase(T80R)，pPIC9K‑DC phytase
(G81R), pPIC9K‑DC phytase(S82Q), pPIC9K‑DC phytase(Y86L), pPIC9K‑DC phytase
(E122N), pPIC9K‑DC phytase(D212R), pPIC9K‑DC phytase(E219R), pPIC9K‑DC
phytase(T223K), pPIC9K‑DC phytase(D293H), pPIC9K‑DC phytase(D293R) , pPIC9K‑
DC phytase(D294H), pPIC9K‑DC phytase(D294R), pPIC9K‑DC phytase(H368V)和
pPIC9K‑DC phytase(S461R)。
用Dpn I 37℃ 酶切4 h，去除模板DNA，随后回收溶解至30 μL无菌dd H2O中，转化DH5α。挑
取单菌落送测序，提取测序正确的质粒备用。以相同方法构建其余突变质粒，获得的质粒分
别命名为pPIC9K‑DC phytase(Y77F), pPIC9K‑DC phytase(T80R)，pPIC9K‑DC phytase
(G81R), pPIC9K‑DC phytase(S82Q), pPIC9K‑DC phytase(Y86L), pPIC9K‑DC phytase
(E122N), pPIC9K‑DC phytase(D212R), pPIC9K‑DC phytase(E219R), pPIC9K‑DC
phytase(T223K), pPIC9K‑DC phytase(D293H), pPIC9K‑DC phytase(D293R) , pPIC9K‑
DC phytase(D294H), pPIC9K‑DC phytase(D294R), pPIC9K‑DC phytase(H368V)和
pPIC9K‑DC phytase(S461R)。
[0036]
[0037] 实施例3 构建植酸酶野生型和突变体毕赤酵母重组菌株
[0038] （1）制备毕赤酵母GS115感受态
[0039] 将毕赤酵母GS115划线于YPD平板，30 ℃培养48 h后选取单克隆菌落接种到装有5mL液体YPD培养基中，30 ℃ 220 rpm 摇床过夜培养，按照接种后摇瓶菌液初始OD600=0.2
将试管菌液接种至装有30 mL 液体YPD的250 mL摇瓶中，30 ℃培养至OD600=0.8‑1.2。取1
mL菌液4 ℃ 8500 g离心30 s。去除上清液，剩余菌体重悬于1 mL电转液（0.1 M醋酸锂，0.6
M山梨醇，10 mM Tris‑HCl (pH 7.5)，10 mM DTT）, 室温放置30 min，4 ℃ 8500 g离心30
s收集菌体，以下转为冰上操作：用1 mL预冷的 1 M 山梨醇洗涤3次，4 ℃ 8500 g 离心30
s收集菌体；洗涤完成后，剩余菌体重悬于55 μL 1 M山梨醇，感受态细胞制备完成，至于冰
上待用。
将试管菌液接种至装有30 mL 液体YPD的250 mL摇瓶中，30 ℃培养至OD600=0.8‑1.2。取1
mL菌液4 ℃ 8500 g离心30 s。去除上清液，剩余菌体重悬于1 mL电转液（0.1 M醋酸锂，0.6
M山梨醇，10 mM Tris‑HCl (pH 7.5)，10 mM DTT）, 室温放置30 min，4 ℃ 8500 g离心30
s收集菌体，以下转为冰上操作：用1 mL预冷的 1 M 山梨醇洗涤3次，4 ℃ 8500 g 离心30
s收集菌体；洗涤完成后，剩余菌体重悬于55 μL 1 M山梨醇，感受态细胞制备完成，至于冰
上待用。
[0040] （2）制备转化片段
[0041] 转化前用Kpn 2I内切酶分别对质粒pPIC9K‑DC phytase，pPIC9K‑DC phytase(Y77F)，pPIC9K‑DC phytase(T80R)，pPIC9K‑DC phytase(G81R)，pPIC9K‑DC phytase
(S82Q)，pPIC9K‑DC phytase(Y86L)，pPIC9K‑DC phytase(E122N)，pPIC9K‑DC phytase
(D212R)，pPIC9K‑DC phytase(E219R)，pPIC9K‑DC phytase(T223K)，pPIC9K‑DC phytase
(D293H)，pPIC9K‑DC phytase(D293R)，pPIC9K‑DC phytase(D294H)，pPIC9K‑DC phytase
(D294R)，pPIC9K‑DC phytase(H368V)和pPIC9K‑DC phytase(S461R)进行单酶切。酶切体系
如下：质粒5 μg，Kpn 2I 5 μL，10× Fast Digest buffer 5μL ，dd H2O补齐至50 μL。37
℃酶切2 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测，对条带进行胶回收，溶解在20 μL无菌ddH2O中，‑20℃
冰箱保存待用。
(S82Q)，pPIC9K‑DC phytase(Y86L)，pPIC9K‑DC phytase(E122N)，pPIC9K‑DC phytase
(D212R)，pPIC9K‑DC phytase(E219R)，pPIC9K‑DC phytase(T223K)，pPIC9K‑DC phytase
(D293H)，pPIC9K‑DC phytase(D293R)，pPIC9K‑DC phytase(D294H)，pPIC9K‑DC phytase
(D294R)，pPIC9K‑DC phytase(H368V)和pPIC9K‑DC phytase(S461R)进行单酶切。酶切体系
如下：质粒5 μg，Kpn 2I 5 μL，10× Fast Digest buffer 5μL ，dd H2O补齐至50 μL。37
℃酶切2 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测，对条带进行胶回收，溶解在20 μL无菌ddH2O中，‑20℃
冰箱保存待用。
[0042] （3）转化
[0043] 取1.5‑2.0 μg待转化的回收片段至感受态细胞，混匀后转移至预冷的0.1 cm电转杯中，加盖冰浴5 min后进行电转。电转电压1.5 kV。电击完毕后立即加入1 mL预冷的 1 M
山梨醇进行重悬，并转入1.5 mL 的EP管中室温静置2 h。7000 rpm离心3 min去除上清，留
约200 μL菌体悬液涂布MD平板，30℃培养72 h。挑取平板单菌落进行PCR验证，验证引物为
DC‑F:ATGGTCTCCGTTTCCAAGTTG, DC‑R:AGAGTTAATCAAAGAAGCTGTGT，验证条带大小约为1383
bp，以转化空质粒pPIC9K的毕赤酵母GS115（pPIC9K）为对照，确定阳性转化子。选取验证正
确的阳性克隆接种于含有5 mL 0.25 mg/mL G418的 YPD培养基中，30 ℃培养48 h，将培养
物保存在终浓度为20%的甘油中，冻存于‑80 ℃冰箱中，由此获得野生型植酸酶毕赤酵母表
达菌株GS115(DC phytase)和其他植酸酶突变体毕赤酵母表达菌株。
山梨醇进行重悬，并转入1.5 mL 的EP管中室温静置2 h。7000 rpm离心3 min去除上清，留
约200 μL菌体悬液涂布MD平板，30℃培养72 h。挑取平板单菌落进行PCR验证，验证引物为
DC‑F:ATGGTCTCCGTTTCCAAGTTG, DC‑R:AGAGTTAATCAAAGAAGCTGTGT，验证条带大小约为1383
bp，以转化空质粒pPIC9K的毕赤酵母GS115（pPIC9K）为对照，确定阳性转化子。选取验证正
确的阳性克隆接种于含有5 mL 0.25 mg/mL G418的 YPD培养基中，30 ℃培养48 h，将培养
物保存在终浓度为20%的甘油中，冻存于‑80 ℃冰箱中，由此获得野生型植酸酶毕赤酵母表
达菌株GS115(DC phytase)和其他植酸酶突变体毕赤酵母表达菌株。
[0044] 实施例4 植酸酶重组菌的诱导发酵
[0045] 将实施例3中的‑80℃冰箱冻存的植酸酶野生型和突变体的表达菌, 划线于含有0.25 mg/mL G418 的YPD平板，30℃培养48h。选取单克隆菌落接种到装有5mL含有0.25 mg/
mL G418 的YPD培养基的试管中，30℃ 200rpm 培养48h，按照OD600=0.12的接种量接种到装
有30 mL BMGY（100 μg/mL Ampicillin，50 μg/mL Kanamycin）培养基的250mL摇瓶中，30℃
200 rpm 培养24 h后，按照OD600=0.17接种量接种到装有30 mL含1%甲醇 的BMMY（100 μg/
mL Ampicillin，50 μg/mL Kanamycin）培养基的250 mL摇瓶中，30 ℃ 200 rpm 培养8天。
每隔24 h补加0.5%甲醇。
mL G418 的YPD培养基的试管中，30℃ 200rpm 培养48h，按照OD600=0.12的接种量接种到装
有30 mL BMGY（100 μg/mL Ampicillin，50 μg/mL Kanamycin）培养基的250mL摇瓶中，30℃
200 rpm 培养24 h后，按照OD600=0.17接种量接种到装有30 mL含1%甲醇 的BMMY（100 μg/
mL Ampicillin，50 μg/mL Kanamycin）培养基的250 mL摇瓶中，30 ℃ 200 rpm 培养8天。
每隔24 h补加0.5%甲醇。
[0046] 实施例5 酶的纯化
[0047] 发酵结束后，发酵液4℃ 5000 rpm离心30 min，去除菌体后，收集发酵上清。取适量体积的发酵上清至透析袋中，放置于透析液（20 mM乙酸钠，pH 6.0）中4℃透析过夜。利用
Ni亲和层析纯化透析液，纯化所得的酶溶液进行比酶活的测定。
Ni亲和层析纯化透析液，纯化所得的酶溶液进行比酶活的测定。
[0048] 所用的Ni层析纯化填料为Ni‑琼脂糖凝胶6FF，纯化过程中所用试剂主要为：
[0049] （1）结合缓冲液/洗涤缓冲液：20 mM 乙酸钠，20 mM 咪唑，500 mM NaCl，pH6.0；
[0050] （2）洗脱缓冲液：20 mM 乙酸钠，500 mM 咪唑，500 mM NaCl，pH 6.0。
[0051] 所述纯化方法过程如下：吸取适量体积的Ni填料于层析柱中，分别用10倍柱体积的ddH2O、10倍柱体积的结合缓冲液进行清洗和柱平衡，平衡后的Ni填料与透析后的发酵上
清液在层析柱中4℃孵育结合2‑3 h。孵育后用10倍柱体积的洗涤缓冲液进行清洗，最后用1
倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集的洗脱液为酶的纯化液。
清液在层析柱中4℃孵育结合2‑3 h。孵育后用10倍柱体积的洗涤缓冲液进行清洗，最后用1
倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集的洗脱液为酶的纯化液。
[0052] 实施例6 蛋白浓度测定
[0053] 对实施例5中获得的纯化的植酸酶进行蛋白浓度的测定。所述蛋白浓度测定方法为BCA蛋白定量法，所用检测试剂盒为BCA蛋白定量试剂盒，购自康为世纪公司。试剂盒所含
试剂为BSA标准品、BCA工作液BCA‑A、BCA工作液BCA‑B。
试剂为BSA标准品、BCA工作液BCA‑A、BCA工作液BCA‑B。
[0054] 所述方法中，BSA标准品与样品的稀释液为PBS溶液。
[0055] （1）样品稀释：将BSA标准品用PBS溶液分别稀释至2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL，并用PBS溶液稀释待测样品溶液。
[0056] （2）配制BCA工作液：根据待测样品与标准品数量，计算BCA工作液所需总量，计算公式为：（标准品样本数量+待测样品数量）×平行样品数量×200 μL。根据计算结果，将
BCA‑A与BCA‑B按照50:1的体积比配制成工作液，充分混匀待用。
BCA‑A与BCA‑B按照50:1的体积比配制成工作液，充分混匀待用。
[0057] （3）定量检测：分别吸取稀释好的标准品溶液与待测样品溶液25 μL至96孔板微孔中，每孔加入200 μL BCA工作液，充分混匀后，37 ℃孵育30 min。用酶标仪在562 nm处测定
每个样品的吸光值。根据标准品测定数据绘制标准曲线，计算测定样品中的植酸酶蛋白浓
度。
每个样品的吸光值。根据标准品测定数据绘制标准曲线，计算测定样品中的植酸酶蛋白浓
度。
[0058] 实施例7 酶活检测
[0059] 所述酶活检测方法为《GB/T18634‑2009 饲用植酸酶活性的测定 分光光度法》。酶活定义：在温度37 ℃、pH 5.5条件下 ,每分钟从浓度为5.0 mmol/L植酸钠溶液中释放1 μ
mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
[0060] 检测所用试剂主要为：
[0061] （1）乙酸缓冲液I：0.25 mol/L乙酸钠, 用冰乙酸调节pH至5.50 ± 0.1。
[0062] （2）乙酸缓冲液Ⅱ：0.25 mol/L乙酸钠, 0.5 g/L Triton X‑100，0.5 g/L牛血清蛋白，用冰乙酸调节pH至5.50 ± 0.1。
[0063] （3）底物溶液：用乙酸缓冲液I配制7.5 mmol/L植酸钠，用冰乙酸调节pH至5.50 ± 0.1，现用现配。
[0064] （4）钼酸铵溶液：称取10 g钼酸铵于50 mL烧杯中加去离子水微加热溶解，转移至100 mL容量瓶中，加入1 mL氨水（25%）后用水定容至刻度。
[0065] （5）偏钒酸铵溶液：称取0.235 g偏钒酸铵于50 mL烧杯中，加入2 mL硝酸溶液，及少量去离子水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至100 mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度。避
光保存一周内有效。
光保存一周内有效。
[0066] （6）酶解反应终止及显色液：2份硝酸溶液（1+2水溶液），1份钼酸铵溶液，和1份偏钒酸铵溶液混合使用，现配现用。
[0067] 所述酶活检测方法步骤为：用乙酸缓冲液Ⅱ对待测液进行稀释，取0.2 mL 稀释液（标准空白对照加入0.2 mL 乙酸缓冲液Ⅱ），同1.8 mL乙酸缓冲液I混合，37 ℃预热5 min；
加入底物溶液 4 mL，混匀，37 ℃反应30 min；加入终止及显色液 4 mL，混匀，室温静置10
min，如出现浑浊，4000 rpm 离心10 min，在分光光度计415 nm波长处测定对照组A0和实验
组A的吸光值，A‑A0为实测吸光值。根据标准曲线（标准曲线按照植酸酶活性的国标测定法
GB/T18634‑2009标准制作）计算植酸酶的活性。
加入底物溶液 4 mL，混匀，37 ℃反应30 min；加入终止及显色液 4 mL，混匀，室温静置10
min，如出现浑浊，4000 rpm 离心10 min，在分光光度计415 nm波长处测定对照组A0和实验
组A的吸光值，A‑A0为实测吸光值。根据标准曲线（标准曲线按照植酸酶活性的国标测定法
GB/T18634‑2009标准制作）计算植酸酶的活性。
[0068] 实施例8 比酶活分析
[0069] 植酸酶比酶活计算公式：比酶活（U/mg）=酶活（U/mL) /蛋白浓度(mg/mL)。以野生型植酸酶比酶活作为对照，计算其他植酸酶突变体的相对比酶活，结果如表3和图2所示。由
表3可知，植酸酶突变体DC phytase (Y77F)、DC phytase (G81R)、DC phytase (E219R)、DC
phytase (D293H)、DC phytase (D293R)、DC phytase (D294R)的比酶活均高于野生型植酸
酶，比酶活的提高幅度可达到10‑63%。其中表中还显示了有些突变导致比酶活低于甚至远
低于野生型植酸酶，表明不同的突变产生了不同的影响。
表3可知，植酸酶突变体DC phytase (Y77F)、DC phytase (G81R)、DC phytase (E219R)、DC
phytase (D293H)、DC phytase (D293R)、DC phytase (D294R)的比酶活均高于野生型植酸
酶，比酶活的提高幅度可达到10‑63%。其中表中还显示了有些突变导致比酶活低于甚至远
低于野生型植酸酶，表明不同的突变产生了不同的影响。
[0070]
[0071] 实施例 9 高效液相检测
[0072] 野生型的卡氏德巴利酵母植酸酶能够水解植酸盐的全部磷酸基团。植酸盐经彻底水解后生成肌醇，产物肌醇可通过高效液相色谱进行检测。因此，验证实施例8中构建的卡
氏德巴利酵母植酸酶突变体在比酶活提高的同时，是否仍具有水解植酸盐分子全部磷酸基
团的能力。
氏德巴利酵母植酸酶突变体在比酶活提高的同时，是否仍具有水解植酸盐分子全部磷酸基
团的能力。
[0073] 用于研究植酸酶水解植酸盐的反应体系和反应条件如下：2体积的植酸钠（20 mM，pH 4.0），2体积的乙酸缓冲液（0.25 M 乙酸钠，pH 4.0），和1体积的纯化酶液（终浓度1 U/
mL）。实验空白对照为：2体积的植酸钠（20 mM，pH 4.0），2体积的乙酸缓冲液（0.25 M 乙酸
钠，pH 4.0），和1体积的经煮沸失活处理的纯化酶液（终浓度1 U/mL）。上述的反应混合物37
℃孵育22 h，通过100 ℃水浴加热煮沸10 min终止反应，随后进行高效液相色谱检测。
mL）。实验空白对照为：2体积的植酸钠（20 mM，pH 4.0），2体积的乙酸缓冲液（0.25 M 乙酸
钠，pH 4.0），和1体积的经煮沸失活处理的纯化酶液（终浓度1 U/mL）。上述的反应混合物37
℃孵育22 h，通过100 ℃水浴加热煮沸10 min终止反应，随后进行高效液相色谱检测。
[0074] 所述检测仪器为安捷伦1260高效液相检测仪，所用检测色谱柱为Bio‑rad Aminex HPX 87H。检测方法为：流动相：5 mM H2SO4；流速：0.5 mL/min；色谱柱柱温: 60 ℃；检测器:
示差折光检测器；检测器光学设备温度: 55 ℃。
示差折光检测器；检测器光学设备温度: 55 ℃。
[0075] 由图3可知高效液相检测肌醇标准品出峰时间为11.780 min。卡氏德巴利酵母植酸酶野生型及比酶活提升的突变体水解植酸盐后的HPLC检测结果（图4）显示均有肌醇峰的
生成，表明突变体在比酶活提高的同时，仍具有水解植酸盐全部磷酸基团生成肌醇的能力。
生成，表明突变体在比酶活提高的同时，仍具有水解植酸盐全部磷酸基团生成肌醇的能力。
[0076] 本发明通过定点突变获得的植酸酶突变体的比酶活较野生型提升幅度为10%‑63%，且仍具有水解植酸分子全部磷酸基团生成肌醇的能力，提高了应用价值。