青虾Cathepsin L基因、其dsRNA及应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及青虾Cathepsin L基因及其dsRNA的应用，包括青虾CathepsinL基因、基因片段及其dsRNA，以及dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用。首先获得青虾Cathepsin L基因，其核苷酸全长序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。而后利用RNA干扰等技术获得序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.8基因片段，由这两个基因片段合成dsRNA1、dsRNA2。将上述合成的dsRNA1、dsRNA2注入雌性青虾围心腔后，得到dsRNA1可以有效减缓雌性青虾卵巢发育速度。

权利要求

1.青虾Cathepsin L基因或青虾Cathepsin L基因编码的蛋白作为靶标在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用；

所述青虾Cathepsin L基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述青虾Cathepsin L基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.青虾Cathepsin L基因片段在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用；所述青虾Cathepsin L基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.扩增青虾Cathepsin L基因片段的引物组，其特征在于，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述青虾Cathepsin L基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.dsRNA，其特征在于，以青虾Cathepsin L基因片段为模板转录获得；

所述青虾Cathepsin L基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.如权利要求4所述的dsRNA抑制青虾Cathepsin L基因 mRNA表达的应用。

6.如权利要求4所述的dsRNA抑制青虾卵巢发育的应用。

说明书

青虾Cathepsin L基因、其dsRNA及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及青虾Cathepsin L基因、其dsRNA及应用。

背景技术

[0002] 青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属
(Macrobrachium)，又俗称为河虾，广泛分布于亚洲各淡水及半咸水水域，是中国重要的淡
水养殖虾类之一，据2020年《中国渔业年鉴》统计，2019年全国养殖青虾产量超过22万吨。雌
性青虾具有“性快熟”的特点，在进入繁殖季节后，虾苗放养45天左右可以达到性成熟，当年
生的雌虾可繁殖多代。特别是在夏季水温较高时期，雌虾一个卵巢成熟周期只需要15天时
间。这一特点是多年来一直困扰青虾产业的重要问题。卵巢快速成熟导致青虾繁殖过快，引
起多代同堂，继而引发养殖密度过高、缺氧风险显著提高、饲料消耗增大等问题，严重影响
了养殖的经济效益，更给家系选育等科研工作造成难题。因此，找到控制青虾卵巢快熟的方
法，对于青虾产业健康高效的发展意义重大。

[0003] 组织蛋白酶是主要存在于溶酶体中的一类蛋白水解酶，其广泛分布于各种生物体内。其中组织蛋白酶L(Cathepsin L)是溶酶体木瓜蛋白酶C1家族半胱氨酸蛋白酶的主要成
员，在生理和病理过程中发挥着重要作用，主要负责蛋白的水解，如抗原递呈、蛋白水解、肿
瘤转移等。在生理活动中，Cathepsin L通过降解外源性蛋白，产生多肽抗原决定簇与组织
相容性复合体Ⅱ类分子(MHCⅡ)结合而参与抗原递呈。在病理活动中，Cathepsin L通过蛋
白水解作用降解细胞外基质，这促进了肿瘤细胞穿透细胞外基质进行转移等。

[0004] RNAi(RNA interference,RNAi)技术是利用双链RNA在Dicer酶作用下形成众多小的RNA片段，最终引起靶向mRNA发生降解，导致细胞或个体不能合成相应的氨基酸，引起个
体功能表现缺失，达到干扰敲除的目的。已有研究证实，对青虾卵黄蛋白原基因
(Vitellogenin)进行RNAi，可有效抑制青虾卵巢发育(Bai et al,2015)。证明RNAi技术在
解决青虾“性快熟”问题中具有很好的应用前景。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供一种青虾Cathepsin L基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用。该基因可用于减缓雌性青虾卵巢发育成熟速度，为解决青虾
“性快熟”问题及遗传改良提供新的思路。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了青虾Cathepsin L基因，其具有如下所示的序列：

[0008] (Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

[0009] (Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

[0010] (Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

[0011] (Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

[0012] 在上述基础上，本发明提供了青虾Cathepsin L基因编码的蛋白，其具有如下所示的序列：

[0013] (Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

[0014] (Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

[0015] (III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有90％同一性的氨基酸序列。

[0016] 更重要的是，本发明还提供了所述的青虾Cathepsin L基因或所述的蛋白作为靶标在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。

[0017] 基于上述研究，本发明还提供了青虾Cathepsin L基因片段，其具有如下所示的序列：

[0018] (Ⅰ)、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或

[0019] (Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

[0020] (Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

[0021] (Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

[0022] 本发明还提供了所述的青虾Cathepsin L基因片段在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。

[0023] 此外，本发明还提供了扩增所述青虾Cathepsin L基因片段的引物组，其具有如下所示的序列：

[0024] (Ⅰ)、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

[0025] (Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

[0026] (Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

[0027] 基于上述提供的引物组，本发明提供的一种青虾Cathepsin L干扰基因片段获取方法如下：对青虾Cathepsin L氨基酸序列分析后，选择Cathepsin L特异性区域，设计干扰
引物，上游引物SEQ ID No.4和下游引物SEQ ID No.5。然后以青虾总cDNA为模板进行PCR扩
增得到DNA片段SEQ ID No.3。

[0028] 本发明还提供了dsRNA，以所述的青虾Cathepsin L基因片段为模板转录获得。

[0029] 本发明还提供了所述的dsRNA抑制青虾Cathepsin L基因mRNA表达的应用。

[0030] 本发明还提供了所述的dsRNA抑制青虾卵巢发育的应用。

[0031] 本发明还提供了青虾Cathepsin L基因及其dsRNA的应用，包括青虾Cathepsin L基因、基因片段及其dsRNA，以及dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用。首先获得青虾
Cathepsin L基因，其核苷酸全长序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。而后利
用RNA干扰等技术获得序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.8基因片段，由这两个基因片段合成
dsRNA1、dsRNA2。将上述合成的dsRNA1、dsRNA2注入雌性青虾围心腔后，得到dsRNA1可以有
效减缓雌性青虾卵巢发育速度。

附图说明

[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0033] 图1示卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，卵巢和肝胰腺中Cathepsin L基因在不同采样时间点的mRNA的表达，青虾β‑Actin基因作为内参基因；1、
4、7分别为注射后第1天、第4天、第7天(n＝9)；不同字母代表p<0.05，对照组用绿色荧光蛋
白(Green fluorescent protein，GFP)基因作为报告基因，对照组注射相同剂量的dsGFP；

[0034] 图2是卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，青虾卵巢性腺指数变化图；1、30分别为注射后第1天与第30天(n＝9)；不同字母a、b代表p<0.05。

具体实施方式

[0035] 本发明公开了青虾Cathepsin L基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指
出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括
在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱
离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实
现和应用本发明技术。

[0036] 本发明提供了一种青虾Cathepsin L基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1；氨基酸序列SEQ ID No.2。

[0037] 本发明提供了一种高效的青虾Cathepsin L干扰基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.3。

[0038] 本发明提供的一种青虾Cathepsin L干扰基因片段获取方法如下：对青虾Cathepsin L氨基酸序列分析后，选择Cathepsin L特异性区域，设计了两对干扰引物，一是
上游引物SEQ ID No.4和下游引物SEQ ID No.5，二是上游引物SEQ ID No.6和下游引物SEQ 
ID No.7，然后以青虾总cDNA为模板进行PCR扩增得到DNA片段SEQ ID No.3、SEQ ID No.8。

[0039] 进一步以DNA片段SEQ ID No.3、SEQ ID No.8为模板，利用试剂盒合成dsRNA1、dsRNA2。

[0040] 以DNA片段SEQ ID No.3、SEQ ID No.8为模板合成的dsRNA1、dsRNA2在抑制雌性青虾卵巢发育中的应用：注射上述dsRNA1、dsRNA2到青虾围心腔，注射浓度为4μg/g。结果表明
注射SEQ ID No.3为模板合成的dsRNA1可以有效降低青虾Cathepsin L基因mRNA的表达，抑
制了青虾卵巢发育速度。而注射SEQ ID No.8为模板合成的dsRNA2并没有有效降低
Cathepsin L基因mRNA的表达，青虾卵巢发育速度并未受到抑制。

[0041] 其中：

[0042] SEQ ID No.1

[0043] ttgaaatctcccgttcaataaacattttctccacaactacgattctctaatccgagactttccgcagatgaaattcctgctcttcctctgtggtttggccatcgctgccgccagtcagtcatgggaaagctttaagctgaccca
tggcaaggcctactccaacgccaaggaggagctctacaggaagaccattttcgagagcaaccttaaattcgtagca
gaacacaatgaacgcttccgaaagggcctagtcaccttcaacgtcgccatgaacagatttggtgacttgaccacag
aggagtttgtagcccagatgactggtctgcagaaactggagagcaccgagggaatggaattcgctcacttccctga
ggcccccagagctgccgatgttgactggagaaacaagggagctgtcactcctgtcaaggaccagggacagtgtgga
tcctgctggtccttctctactactggagctctagaaggcgcacatttcatcaaaaccggaagtctgccaagcctct
ccgaacagcagctggttgattgctcaaaggaaaacagcggttgcaacggaggagttgtgcaatgggcctacgatta
cctcaagtcctgcggaggaagccagactgagtcttcctatccttacgaggctattgacaacatatgccgcttcgat
tcatctcaggtggctgccactgtgaggggatacacgaacatcccctatggcgatgaggtgactcaggcctctgctg
tccacgacgaaggtccagtcagtgtctgcgtcgatgctggacacttgtccttccagttgtacagctcaggtgtcta
ctacgaaccaaactgcaaccctcagggcatcaaccacgccgtgttggctgttggctacggaaccgaaggcggctcc
gactactggatcatcaagaactcgtggggcagcagctggggtgagtctggatacatgaagctcaccaggaacaaga
acaaccactgcggtgttgccacccagtcttgctacccaaccgtctaaggattccaagaaagtctggttgctttatt
ccatgaagagttatgagtatacatcgacaccttaactcataagaccatagcttgataatcatgtctggctttatat
cttgtttatgaaaaataaagtggaatcgattaaaaaaaaaa

[0044] SEQ ID No.2

[0045] MKFLLFLCGLAIAAASQSWESFKLTHGKAYSNAKEELYRKTIFESNLKFVAEHNERFRKGLVTFNVAMNRFGDLTTEEFVAQMTGLQKLESTEGMEFAHFPEAPRAADVDWRNKGAVTPVKDQGQCGSCWSFSTTGALEGAHFIKT
GSLPSLSEQQLVDCSKENSGCNGGVVQWAYDYLKSCGGSQTESSYPYEAIDNICRFDSSQVAATVRGYTNIPYGDEV
TQASAVHDEGPVSVCVDAGHLSFQLYSSGVYYEPNCNPQGINHAVLAVGYGTEGGSDYWIIKNSWGSSWGESGYMKL
TRNKNNHCGVATQSCYPTV

[0046] SEQ ID No.3

[0047] gctctacaggaagaccattttcgagagcaaccttaaattcgtagcagaacacaatgaacgcttccgaaagggcctagtcaccttcaacgtcgccatgaacagatttggtgacttgaccacagaggagtttgtagcccagatgac
tggtctgcagaaactggagagcaccgagggaatggaattcgctcacttc

[0048] SEQ ID No.4

[0049] gctctacaggaagaccattttc

[0050] SEQ ID No.5

[0051] gaagtgagcgaattccattcc

[0052] SEQ ID No.6

[0053] gcctacgattacctcaagtcc

[0054] SEQ ID No.7

[0055] gtggacagcagaggcctgagtc

[0056] SEQ ID No.8

[0057] gcctacgattacctcaagtcctgcggaggaagccagactgagtcttcctatccttacgaggctattgacaacatatgccgcttcgattcatctcaggtggctgccactgtgaggggatacacgaacatcccctatggcgatgag
gtgactcaggcctctgctgtccac

[0058] 本发明提供的青虾Cathepsin L基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

[0059] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0060] 实施例1青虾Cathepsin L基因全长序列的获得

[0061] 通过对雌性青虾巢各个发育时期进行转录组比较分析，获得全长的差异基因Cathepsin L，其核苷酸全长序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。

[0062] 实施例2青虾Cathepsin L基因片段及其dsRNA的获取

[0063] 以青虾Cathepsin L核苷酸序列SEQ ID No.1为依据，在其开放阅读框内采用NCBI在线dsRNA引物设计软件(https://www.flyrnai.org/cgi‑bin/RNAi_find_primers.pl)设
计RNA干扰的特异性引物(SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7)，并在
上述引物前添加T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAGGG。使用含有T7启动子的上游引物SEQ 
ID No.4和下游引物SEQ ID No.5与干扰上游引物SEQ ID No.6和下游引物SEQ ID No.7通
过PCR扩增得到PCR产物(序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.8所示)，经PCR产物纯化试剂盒纯
化之后，按照制造商的说明书，使用Transcript AidTM T7 High Yield Transcription 
kit(Fermentas,Inc.,USA)进行体外转录合成dsRNA1、dsRNA2，然后用1.2％琼脂糖凝胶电
泳检测dsRNA1、dsRNA2的纯度和完整性，并用紫外分光光度计(Eppendorf,Hamburg,
Germany)在260nm下测量dsRNA1、dsRNA2的浓度，然后将其保持在‑80℃下备用。

[0064] 实施例3注射Cathepsin L基因片段合成的dsRNA1、dsRNA2抑制雌性青虾卵巢发育实验

[0065] (1)Cathepsin L基因片段合成dsRNA1、dsRNA2的注射

[0066] 根据青虾卵巢发育的外观特征，选择180只卵巢发育处于I期(卵原细胞增殖期，白色透明)的健康青虾0.61±0.14g，用来确保起始卵巢发育时期的一致，设置注射dsGFP的对
照组和dsRNA1、dsRNA2的实验组。采用微量注射器将体外合成的dsRNA注射至青虾围心腔
内，注射剂量为4μg/g，每组各60只青虾，设置3个平行重复(n＝20)。注射前在玻璃缸内暂养
三天，使其适应实验室的养殖环境(水温25±1℃)，每天早晚投喂新鲜的螺蛳一次。

[0067] (2)Cathepsin L基因沉默效率的检测

[0068] 注射后第1、4、7天从每组随机采集3只，解剖出青虾的卵巢与肝胰腺。使用RNAiso Plus(TaKaRa，Japan)试剂提取总RNA，使用Primer ScriptII1st Strand cDNA Synthesis
逆转录试剂盒(Bio‑Rad)和M‑MLV Kit(TaKaRa,，Japan)反转录获得模板cDNA，用此模板进
行Real Time PCR检测Cathepsin L的相对表达量，内参基因为(β‑Actin)，用来计算目的基
因的沉默效率。

[0069] 表1肝胰腺原始数据

[0070]

[0071] 表2平均值与标准差

[0072]

[0073] 表3卵巢原始数据

[0074]

[0075]

[0076] 表4平均值与标准差

[0077]

[0078] 如图1以及表1～4所示：卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，卵巢和肝胰腺中Cathepsin L基因在不同采样时间点的mRNA的表达。1、4、7分别为注射
后第1天、第4天、第7天(n＝9)。不同字母代表p<0.05，对照组用绿色荧光蛋白(Green 
fluorescent protein，GFP)基因作为报告基因，对照组注射相同剂量的dsGFP。

[0079] 结果表明，与dsGFP对照组相比，dsRNA1实验组在注射后第4天与第7天肝胰腺沉默效率分别为99.97％、99.55％，卵巢沉默效率分别为95.56％、99.79％，而dsRNA2实验组与
对照组相比差异不显著(p＞0.05)。

[0080] (3)注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后青虾性腺发育指数(Gonad Somatic Index，GSI)的变化

[0081] 表5性腺指数原始数据

[0082]

[0083]

[0084] 表6平均值与标准差

[0085]

[0086] 如图2、表5～6所示：卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，青虾卵巢性腺指数变化图。1、30分别为注射后第1天与第30天(n＝9)。不同字母a、b代表p<
0.05。

[0087] 根据公式性腺发育指数(GSI)＝性腺湿重/体重湿重X100％，计算dsGFP、dsRNA1、dsRNA2三组的青虾性腺发育指数。通过对照组的GSI性腺发育指数与注射dsRNA1实验组的
性腺发育指数对比发现，沉默Cathepsin L之后显著抑制了青虾卵巢发育速度，在养殖30天
后，对照组已经从卵巢发育I期(卵原细胞增殖期，白色透明)GSI为1.83％发展到III期(次
级卵黄发生期，浅绿色)GSI为3.89％，而dsRNA1实验组GSI为1.76％，依旧停留在I期(卵原
细胞增殖期，白色透明)；dsRNA2实验组在养殖30天后性腺发育指数为4.00％，发育到III期
(次级卵黄发生期，浅绿色)，与对照组相比差异不显著(p＞0.05)。性腺发育指数结果表明，
过外源性注射Cathepsin L的dsRNA1可以有效抑制青虾卵巢发育速度，dsRNA2没有抑制卵
巢发育速度。

[0088] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。