一种肝癌新型分子标记物tRF-Leu-AAG-007的检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种肝癌新型分子标记物tRF‑Leu‑AAG‑007的检测试剂盒，所述的标记物tRF‑Leu‑AAG‑007如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列为TCCCACCGCTGCCACCA；所述的检测试剂盒中包含PCR特异引物F和PCR特异引物R，所述的PCR特异引物F如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列为5'ACAGTCCGACGATCTCCCACC 3'，所述的PCR特异引物R如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列为5'GCTCTTCCGATCTTGGTGGC 3'。本发明的优点在于：使用方便，检测准确性好。

权利要求

1.一种肝癌新型分子标记物tRF‑Leu‑AAG‑007的检测试剂盒，其特征是：所述的标记物tRF‑Leu‑AAG‑007如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列为TCCCACCGCTGCCACCA；所述的检测试剂盒中包含PCR特异引物F和PCR特异引物R，所述的PCR特异引物F如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列为5' ACAGTCCGACGATCTCCCACC 3'，所述的PCR特异引物R如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列为5' GCTCTTCCGATCTTGGTGGC 3'。

说明书

一种肝癌新型分子标记物tRF‑Leu‑AAG‑007的检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及检测试剂盒技术领域，具体地说是一种肝癌新型分子标记物tRF‑Leu‑AAG‑007的检测试剂盒。

背景技术

[0002] 原发性肝癌是危害人类健康的重大疾病之，在全球范围内，原发性肝癌发病率排名第六，死亡率位列第四。在我国，由于较高的乙肝病毒感染率以及过度饮酒、吸烟等不良
生活习惯的影响，肝癌的发病率上升至10.9%，而死亡率更是高达15.0%。原发性肝癌可分为
肝细胞癌、肝内胆管癌和肝细胞及胆管混合癌三种类型，其中肝细胞癌占比最高，约为85‑
90％。目前肝癌的主要治疗方法包括早期的手术切除、经皮穿刺瘤内注射无水乙醇、射频消
融术、经动脉血管栓塞术等，有最新研究报道显示，磁热疗法、索拉非尼药物化疗法也逐渐
用于肝癌的治疗。

[0003] 然而，由于缺乏明确的早期诊断标志物、特异性的临床症状等，肝癌患者确诊时通常已是晚期，总的5年生存期很短，因此早期诊断发现对肿瘤患者尤为重要。转运RNA
（transfer RNA，tRNA）是可携带并转运氨基酸的一类核糖核酸，在机体蛋白质合成过程中
发挥着重要的桥梁作用，对机体遗传信息的传递必不可少。tRFs为衍生自成熟tRNA和pre‑
tRNA的小RNA片段，按照来源不同可分为：tRF‑5、tRF‑3和tRF‑1。作为调节性RNA，tRFs在肿
瘤的发生、发展过程中扮演着重要的角色。研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞中许多
tRFs均有表达差异。tRFs重要的生物学功能预示着其在肿瘤诊断和治疗策略中具有巨大潜
力和应用前景，tRFs的异常表达可能成为肿瘤潜在的诊断、预后判断的生物标志物，有望成
为肿瘤治疗的新方向。迄今为止，tRFs作为肝癌诊断标记物的研究暂未见报道。

[0004] 目前，常见的应用于肝癌诊断的肿瘤标志物有血清 AFP（甲胎蛋白）、α‑L‑岩藻糖苷酶，去饱和‑γ‑羧基‑凝血酶原以及磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3等。虽然这些指标可以用于原
发性肝癌患者的诊断和预后评估，但仍存在一定的假阳性率和缺陷性。

发明内容

[0005] 本发明之目的是弥补上述之不足，向社会公开使用方便，检测准确性好的一种肝癌新型分子标记物tRF‑Leu‑AAG‑007的检测试剂盒。

[0006] 本发明的技术方案是这样实现的：

[0007] 一种肝癌新型分子标记物tRF‑Leu‑AAG‑007的检测试剂盒，所述的标记物tRF‑Leu‑AAG‑007如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列为TCCCACCGCTGCCACCA；所述的检测试剂盒
中包含PCR特异引物F和PCR特异引物R，所述的PCR特异引物F如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸
序列为5' ACAGTCCGACGATCTCCCACC 3'，所述的PCR特异引物R如SEQ ID NO.3所示，其核苷
酸序列为5' GCTCTTCCGATCTTGGTGGC 3'。

[0008] 本发明与现有技术相比的优点是：

[0009] 本发明的一种肝癌新型分子标记物tRF‑Leu‑AAG‑007的检测试剂盒，以tRF‑Leu‑AAG‑007作为肝癌的新型分子标记物，由于tRF‑Leu‑AAG‑007在肝癌中具有较高表达水平，
将其作为肝癌标记物能够提高检测的准确性。本发明检测试剂盒针对新型分子标记物tRF‑
Leu‑AAG‑007设计引物，针对性强，检测准确性好，检测效率高，有助于肝癌的早期发现。

附图说明

[0010] 图1是肝癌组织和癌旁组织中tRF‑Leu‑AAG‑007和内参RNU6的扩增曲线图；

[0011] 图2是肝癌组织和癌旁组织中tRF‑Leu‑AAG‑007的差异表达情况表；

[0012] 图3是检测56例肝癌患者肝癌组织及其癌旁组织tRF‑Leu‑AAG‑007水平，而制作的ROC曲线图。

具体实施方式

[0013] 下面结合附图进一步详细描述本发明：

[0014] 一种肝癌新型分子标记物tRF‑Leu‑AAG‑007的检测试剂盒，所述的标记物tRF‑Leu‑AAG‑007如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列为TCCCACCGCTGCCACCA；所述的检测试剂盒
中包含PCR特异引物F和PCR特异引物R，所述的PCR特异引物F如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸
序列为5' ACAGTCCGACGATCTCCCACC 3'，所述的PCR特异引物R如SEQ ID NO.3所示，其核苷
酸序列为5' GCTCTTCCGATCTTGGTGGC 3'。

[0015] 下面通过实验证明tRF‑Leu‑AAG‑007在肝癌中具有较高表达水平以及检测试剂盒内引物对于tRF‑Leu‑AAG‑007检测的有效性。

[0016] 一、组织样板总RNA 的提取

[0017] 采用市售TRIzol、氯仿等试剂，按照产品说明书提取浓度、纯度较高的RNA，收集20mg肝癌组织即可进行检测。

[0018] 二、RNA前处理与cDNA合成

[0019] 1.3’末端去乙酰化处理

[0020] a)如下配置去乙酰化反应液:

[0021] Input RNA≤5 µg

[0022] Deacylation Reaction Buffer (5×) 3 µL

[0023] RNase Inhibitor 1 µL

[0024] Nuclease‑free Water x µL

[0025] 总体积/样本 15 µL；

[0026] b)涡旋混合，37°C孵育40分钟。

[0027] c)依次加入19 µL Deacylation Stop Buffer，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应。

[0028] 2.去除3’‑cP与添加5’‑P

[0029] d)将上一步骤的反应液置于冰上，依次加入如下试剂:

[0030] Terminal Enzyme Reaction Buffer (10×) 5 µL

[0031] 10 mM ATP 5 µL

[0032] Terminal Enzyme Mix 3 U (1 µL)

[0033] Nuclease‑free water 5 µL

[0034] 总体积/样本 50 µL；

[0035] e)涡旋混合，37°C孵育40分钟。

[0036] f)70°C孵育5分钟以终止反应。

[0037] g)重新抽提RNA。

[0038] 3.去甲基化处理

[0039] h)融解除Demethylase和Reverse Transcriptase外的所有试剂，涡旋混合，置于冰上。在使用前从冰箱将两种酶取出，简单离心，以待使用。

[0040] i)配制去甲基化反应液：

[0041] Nuclease‑free water x µL

[0042] Demethylation Reaction Buffer (5×) 10 µL

[0043] Demethylase 5 µL

[0044] RNase Inhibitor 1 µL

[0045] Input RNA ≤5 µg

[0046] 总体积/样本 50 µL ；

[0047] j)进行去甲基化反应

[0048] 在37°C水浴锅中孵育2小时，然后加入40 µL Nuclease‑free Water与10 µL Demethylation Stop Buffer (5×)，终止去甲基化反应。

[0049] k)重新抽提RNA。

[0050] 4.连接3’接头

[0051] l)在200 µL无RNA酶的PCR管中依次加入下列试剂：

[0052] Nuclease‑free Water variable

[0053] 样本RNA 0.5‑3 µL

[0054] 3’ Adaptor 0.5 µL

[0055] RNA Spike‑in 0.5 µL

[0056] 总体积 3.5 μL；

[0057] m)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后将PCR管移至冰上。

[0058] n)添加下列反应试剂:

[0059] 3’ Ligation Reaction Buffer (2X) 5 µL

[0060] 3’ Ligation Enzyme Mix 1.5 µL

[0061] 总体积10 µL；

[0062] o)在热循环仪中25℃孵育1小时。

[0063] 注意：延长孵育时间和降低孵育温度(18h；16℃)可以增大甲基化修饰RNA比如piRNA的连接效率，但同时也可能形成串联产物。

[0064] 5.反转录引物（Reverse Transcription Primer）杂交

[0065] 此步反应对抑制接头二聚体的形成十分关键。反转录引物可与多余的3’接头杂交，从而将单链DNA接头转化为双链DNA分子。而双链DNA分子不是T4 RNA Ligase 1的底物，
因此多余的3’接头不会与5’接头连接。

[0066] 注意：如果总RNA起始量为100 ng，将反转录引物用无酶水1:2稀释。

[0067] p)向步骤o的PCR管里加入下列试剂:

[0068] Nuclease‑Free Water 2.3 µL

[0069] Reverse Transcription Primer 0.5 µL

[0070] 总体积 12.8 µL；

[0071] q)在热循环仪中依次75℃孵育5 min，37℃孵育15 min，25℃孵育15 min。

[0072] 6.连接5’接头

[0073] r)在20 µL无酶水中重悬 5’接头。

[0074] 注意：如果总RNA起始量为100 ng，将5’接头用无酶水1:2稀释。

[0075] s)在单独的无核酸酶的200 µL PCR管中加入0.6N µL的5’接头。（N为实验所处理的样本数目）在热循环仪中70°C 孵育2分钟，然后立即在冰上冷却。

[0076] 注意：将剩余的5’重悬接头储存在‑80°C冰箱。为了避免RNA降解，请在接头变性后30分钟内使用接头。

[0077] t)向步骤q中的PCR管中依次加入下列反应物，充分混合。

[0078] 5’ Adaptor (denatured) 0.5 µL

[0079] 5’Ligation Reaction Buffer0.5 µL

[0080] 5’Ligation Enzyme Mix 1.2 µL

[0081] 总体积 15 µL；

[0082] u)热循环仪25°C 孵育1小时。

[0083] 7.反转录反应

[0084] v)在无核酸酶的200 µL PCR管加入下列反应物:

[0085] Adaptor Ligated RNA 15 µL

[0086] First‑Strand Synthesis Reaction Buffer 4 µL

[0087] RNase Inhibitor 0.5 µL

[0088] Reverse Transcriptase 0.5 µL

[0089] 总体积 20 µL；

[0090] w)热循环仪50°C 孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物可直接用于PCR扩增反应。

[0091] 注意：如果未打算立即进行PCR扩增，热循环仪70°C孵育15分钟以终止RT反应。然后将样本置于‑20°C冰箱保存。

[0092] 三、进行Realtime PCR反应

[0093] 1、将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：

[0094] 2 × Master Mix                                   5 µL

[0095] 10uM 的PCR特异引物F:5’ ACAGTCCGACGATCTCCCACC 3'   0.5 µL

[0096] 10uM 的PCR特异引物R:5’ GCTCTTCCGATCTTGGTGGC 3’    0.5 µL

[0097] 加水至总体积为 8 µL；

[0098] 轻弹管底将溶液混合，5000 rpm短暂离心。

[0099] 2、加样

[0100] a. 将8ul混合液加到384‑PCR板对应的每个孔中。

[0101] b. 再加入对应的2µl cDNA。

[0102] c. 小心粘上Sealing Film 封口膜，并短暂离心混合。

[0103] c. 在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。

[0104] 3、将上述384‑PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。

[0105] 所有的指标均按以下程序进行：

[0106] 95℃，10min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，60秒（收集荧光））。

[0107] 为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按（95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒）；并从60℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行‑Ramp Rate为0.05℃/秒）。

[0108] 四、结果与计算

[0109] 各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由软件生成。每个样品的目的基
因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。

[0110] 如图1所示，正常组织(癌旁组织)和肝癌组织中tRF‑Leu‑AAG‑007(图1中的上部图)和内参RNU6(图1的下部图)均得到有效扩增，与基因测序的结果一致。

[0111] 如图2所示，癌旁组织和肝癌组织中tRF‑Leu‑AAG‑007的表达存在显著差异，肝癌组织的表达水平为癌旁组织的4.113倍。当癌旁组织与癌组织的比值大于等于4时，认为具
有统计学意义。

[0112] 如图3所示，检测56例肝癌患者肝癌组织及其癌旁组织tRF‑Leu‑AAG‑007水平，制作ROC曲线，曲线下AUC 面积为0.714，P＜0.001，说明具有较高的诊断价值。

[0113] 本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。