一种用于检测苦瓜果瘤性状的KASP标记及其应用转让专利
申请号 : CN202110265473.4
文献号 : CN112852994B
文献日 : 2021-09-17
发明人 : 刘小茜 , 龚浩 , 郑晓明 , 吴海滨 , 罗剑宁 , 李俊星 , 赵钢军
申请人 : 广东省农业科学院蔬菜研究所
摘要 :
本发明涉及一种苦瓜KASP标记，所述KASP标记为苦瓜基因组4号染色体上的21911842位置处发生C向T的突变，该位点突变导致基因MC04g1395形成一个终止密码子，从而表现为变异位点T或者杂合与粒瘤性状紧密连锁，C与条瘤性状紧密连锁。同时，发明人基于该KASP标记成功开发了一组KASP引物及其试剂盒，经实验验证该KASP标记检测在苦瓜遗传后代材料中检测准确率为98.15％，在苦瓜自然种质中检测准确率为98.39％。充分表明该KASP标记检测能够用来筛选苦瓜果瘤性状，在苗期可实现高通量快速鉴定苦瓜果瘤类型，为苦瓜分子育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
权利要求 :
1.检测苦瓜基因组4号染色体上的21911842位置处发生C向T的突变的试剂在苦瓜果瘤性状检测和/或辅助育种中的应用，其中，苦瓜基因组4号染色体上的21911842位置为SEQ ID NO.3所示的正向引物与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示反向引物的扩增片段中SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示反向引物的末位所对应的多态性位点。
2.一种苦瓜果瘤性状检测方法，其特征在于，所述检测方法包括检测苦瓜基因组4号染色体上的21911842位置处是否发生C向T的突变，其中，苦瓜基因组4号染色体上的21911842位置为SEQ ID NO.3所示的正向引物与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示反向引物的扩增片段中SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示反向引物的末位所对应的多态性位点。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法为聚合酶链式反应技术，所述聚合酶链式反应是RT‑PCR、免疫PCR、巢式PCR、荧光PCR、膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR中的任一种。
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述检测方法为荧光PCR，所述检测包括如下步骤：
（1）获取待测苦瓜基因组DNA；
（2）以核苷酸序列SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.5所示的引物对进行PCR扩增得到产物，其中核苷酸序列SEQ ID NO.4所示的反向引物1包括5’端连接为有HEX基团的荧光标签序列B，所述荧光标签序列B如SEQ ID NO.1所示；核苷酸序列SEQ ID NO.5所示的反向引物2包括5’端连接为有FAM基团的荧光标签序列A，所述荧光标签序列A如SEQ ID NO.3所示；
（3）将产物在包含3种通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息，进行基因分型，获得基因型结果；
（4）根据荧光信号值进行分析，其中聚合在X轴且荧光信号呈蓝色的样本为条瘤基因型，A基因型；聚合在Y轴且荧光信号呈绿色的样本为粒瘤基因型，B基因型；聚合在中间且荧光信号呈红色的样本为粒条相间基因型，H基因型。
6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述检测方法为以待测苦瓜基因组DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.6‑SEQ ID NO.7所示引物序列进行PCR扩增后测序检测。
7.一种苦瓜果瘤性状检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括引物组合，所述引物组合中的正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.权利要求7所述检测试剂盒在苦瓜辅助育种中的应用。
说明书 :
一种用于检测苦瓜果瘤性状的KASP标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测苦瓜果瘤性状的SNP位点、KASP标记及其应用。
背景技术
[0002] 苦瓜是一种兼具营养价值和药用价值的特色蔬菜，富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质及各种生物活性成分，可降血糖、抗氧化、分解脂肪，抑制诱变、肿瘤等。其除了作
为广东、广西、海南、福建、四川及港澳地区的日常消费，同时也是“三北”、长江流域及港澳
地区冬春蔬菜淡季市场的主要产品之一。
为广东、广西、海南、福建、四川及港澳地区的日常消费，同时也是“三北”、长江流域及港澳
地区冬春蔬菜淡季市场的主要产品之一。
[0003] 苦瓜按果瘤形状可大致分为无瘤、条瘤、粒条相间、粒瘤和刺瘤等种类，在生产上，果实表面瘤的形态是区分油瓜和珍珠苦瓜的重要指标，油瓜以光滑的条瘤为主，珍珠苦瓜
以晶莹剔透的粒瘤为主。因此，开发与苦瓜果瘤性状紧密连锁的KASP标记，在苗期可实现高
通量快速鉴定苦瓜果实表面瘤的类型，筛选珍珠苦瓜和油瓜不同的苦瓜类型，为苦瓜分子
育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
以晶莹剔透的粒瘤为主。因此，开发与苦瓜果瘤性状紧密连锁的KASP标记，在苗期可实现高
通量快速鉴定苦瓜果实表面瘤的类型，筛选珍珠苦瓜和油瓜不同的苦瓜类型，为苦瓜分子
育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
发明内容
[0004] 基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于检测苦瓜果瘤性状的KASP标记，用于有效检测苦瓜果瘤性状。
[0005] 实现上述目的的技术方案如下：
[0006] 一种苦瓜KASP标记，所述苦瓜KASP标记为基因组4号染色体上的21911842位置处发生C向T的突变。
[0007] 本发明的目的之一还在于提供一种上述苦瓜KASP标记在苦瓜果瘤性状检测和/或辅助育种中的应用。
[0008] 本发明的目的之一还在于提供一种苦瓜果瘤性状检测方法。
[0009] 实现上述目的的技术方案如下：
[0010] 一种苦瓜果瘤性状检测方法，所述检测方法包括检测苦瓜基因组4号染色体上的21911842位置处是否发生C向T的突变。
[0011] 在其中一些实施例中，所述检测方法包括，但不限于，聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测
序技术。
序技术。
[0012] 在其中一些实施例中，所述检测方法为聚合酶链式反应技术，所述聚合酶链式反应是RT‑PCR、免疫PCR、巢式PCR、荧光PCR、原位PCR、膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、
不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR中的任一种。
不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR中的任一种。
[0013] 在其中一些实施例中，所述检测方法为荧光PCR，所述检测包括如下步骤：
[0014] (1)获取待测苦瓜基因组DNA。
[0015] (2)以核苷酸序列SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.5所示的引物对进行PCR扩增得到产物。
[0016] (3)将产物在包含3种通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息，进行基因分型，获得基因型结果。
[0017] (4)根据荧光信号值进行分析，其中聚合在X轴且荧光信号呈蓝色的样本为条瘤基因型，A基因型；聚合在Y轴且荧光信号呈绿色的样本为粒瘤基因型，B基因型；聚合在中间且
荧光信号呈红色的样本为粒条相间基因型，H基因型。
荧光信号呈红色的样本为粒条相间基因型，H基因型。
[0018] 在其中一些实施例中，所述检测方法为以待测苦瓜基因组DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.6‑SEQ ID NO.7所示引物序列进行PCR扩增检测。
[0019] 本发明的目的之一还在于提供一种苦瓜果瘤性状检测试剂盒。
[0020] 实现上述目的的技术方案如下：
[0021] 一种苦瓜果瘤性状检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测苦瓜基因组4号染色体上的21911842位置处是否发生C向T突变的试剂。
[0022] 一种苦瓜果瘤性状检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于检测上述苦瓜KASP标记的引物组合，所述引物组合中的正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物R1
的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0023] 本发明的目的之一还在于提供一种苦瓜果瘤性状检测试剂盒在苦瓜辅助育种中的应用。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0025] 本发明的发明人发现苦瓜的果瘤性状呈不完全显性，并在苦瓜4号染色体上21911842位置查找到一个SNP位点变异T/C，该位点突变导致基因MC04g1395形成一个终止
密码子，从而表现为变异位点T与粒瘤性状紧密连锁，C与条瘤性状紧密连锁。同时，发明人
基于该KASP标记成功开发了一组KASP引物及其试剂盒，经实验验证该KASP标记检测在苦瓜
遗传后代材料中检测准确率为98.15％，在苦瓜自然种质中检测准确率为98.39％。充分表
明该KASP标记检测能够用来筛选苦瓜果瘤性状，在苗期可实现高通量快速鉴定苦瓜果瘤类
型，为苦瓜分子育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
密码子，从而表现为变异位点T与粒瘤性状紧密连锁，C与条瘤性状紧密连锁。同时，发明人
基于该KASP标记成功开发了一组KASP引物及其试剂盒，经实验验证该KASP标记检测在苦瓜
遗传后代材料中检测准确率为98.15％，在苦瓜自然种质中检测准确率为98.39％。充分表
明该KASP标记检测能够用来筛选苦瓜果瘤性状，在苗期可实现高通量快速鉴定苦瓜果瘤类
型，为苦瓜分子育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
附图说明
[0026] 图1为实施例1中亲本材料的果实图。
[0027] 图2为实施例1中苦瓜果瘤的基因定位检测结果图，其中A为：两个子代△(SNP‑index)在全基因组上的分布；B为：两个子代△(SNP‑index)在4号染色体上的分布；C为：精
细定位苦瓜果瘤基因图。
细定位苦瓜果瘤基因图。
[0028] 图3为实施例2中F2及62份苦瓜材料KASP标记基因分型图。绿色为粒瘤样本，蓝色为条瘤样本，红色为条粒相间样本，灰色为空白对照，黑色为无法判断。
具体实施方式
[0029] 为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述
的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的
条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的
条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
[0030] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的
实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关
的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关
的所列项目的任意的和所有的组合。
[0031] 本发明涉及缩略语和术语定义如下：
[0032] BSA‑seq：极端性状混池重测序。
[0033] KASP：竞争性等位基因特异性PCR。
[0034] SNP：单核苷酸多态性。
[0035] 实施例1苦瓜果瘤性状基因定位
[0036] 1.实验材料
[0037] 珍珠苦瓜G53‑2‑1、油瓜K38及62份苦瓜核心种质均为广东省农业科学院蔬菜研究所收集、创制的核心育种材料。
[0038] 2.实验步骤：
[0039] 以广东省农业科学院蔬菜研究所选育保存的珍珠苦瓜G53‑2‑1(粒瘤，母本)和油瓜K38(条瘤，父本)为亲本，杂交获得F1，F1自交获得F2分离群体。亲本材料果瘤性状如图1所
示。
示。
[0040] 利用亲本材料构建F2群体，调查苦瓜果瘤情况。在92株的F2群体中，粒瘤苦瓜有232
株，条粒相间苦瓜有45株，条瘤苦瓜24株，符合1:2:1的分离比(χ＝0.065，p＝0.97)，表明
苦瓜粒瘤对条瘤为不完全显性，且由单基因控制。
株，条粒相间苦瓜有45株，条瘤苦瓜24株，符合1:2:1的分离比(χ＝0.065，p＝0.97)，表明
苦瓜粒瘤对条瘤为不完全显性，且由单基因控制。
[0041] 利用F2群体中极端表型各20株，提取DNA混池测序，计算2个子代池SNP‑index的差值ΔSNP‑index，选择1Mb为窗口，1kb为步长，计算每个窗口中ΔSNP‑index的平均值来反应
ΔSNP‑index分布，通过BSA‑seq将苦瓜果瘤基因定位于4号染色体上18.7Mb‑23.5Mb(99％
置信水平)区间内。在该区间内设计KASP标记，对F2群体615株苦瓜单株进行基因分型，结合
表型数据将苦瓜粒瘤基因定位到104.8kb内，该区间有9个基因，具体如图2所示，基因注释
信息如下表1所示。
ΔSNP‑index分布，通过BSA‑seq将苦瓜果瘤基因定位于4号染色体上18.7Mb‑23.5Mb(99％
置信水平)区间内。在该区间内设计KASP标记，对F2群体615株苦瓜单株进行基因分型，结合
表型数据将苦瓜粒瘤基因定位到104.8kb内，该区间有9个基因，具体如图2所示，基因注释
信息如下表1所示。
[0042] 表1定位区间内候选基因的注释表
[0043]
[0044] 根据F2亲本进行全基因组重测序，查找该定位区间内的SNP变异位点。在21911842位置查找到一个SNP位点变异T/C，该位点导致MC04g1395形成一个终止密码子。
[0045] 实施例2苦瓜果瘤性状KASP标记检测
[0046] 基于上述定位区间的标记序列，根据上述SNP位点上下游300bp的序列，利用primer premier5.0软件设计KASP标记引物。包括正向引物、反向引物1和反向引物2。两条
反向引物末端为等位变异碱基均为G/A。反向引物的5’端连接有荧光标签序列A和B，其中反
向引物1的5’端连接为有HEX基团的荧光标签序列B，序列5'‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCT‑3'
(SEQ ID NO.1)，反向引物2的5'端连接为有FAM基团的荧光标签序列A，序列5'‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT‑3’(SEQ ID NO.2)，引物序列具体如下：F：GCCTGAAGAGGTTGGGAATC
(SEQ ID NO.3)
反向引物末端为等位变异碱基均为G/A。反向引物的5’端连接有荧光标签序列A和B，其中反
向引物1的5’端连接为有HEX基团的荧光标签序列B，序列5'‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCT‑3'
(SEQ ID NO.1)，反向引物2的5'端连接为有FAM基团的荧光标签序列A，序列5'‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT‑3’(SEQ ID NO.2)，引物序列具体如下：F：GCCTGAAGAGGTTGGGAATC
(SEQ ID NO.3)
[0047] R1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGTTGTTTTCATACGACTGG(SEQ ID NO.4)
[0048] R2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAGAAGTTGTTTTCATACGACTGA(SEQ ID NO.5)
[0049] 通过F2群体及62份苦瓜种质材料进行验证。取F2群体样本幼叶，通过CTAB提取法获得苦瓜的基因组DNA，利用上述引物组进行PCR扩增，PCR反应体系为10μL，其中包含2×KASP
master mix 5μL，正向引物0.4μL，反向引物R10.15μL，反向引物R20.15μL，DNA(10‑100ng)1
μL，ddH2O 3.3μL。PCR反应程序为94℃，15min；94℃，20s，65‑57℃(Touch down)，1min，10个
循环；94℃，20s，57℃，1min，30个循环。使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，
在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清
晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果检测。其中聚合在X轴且荧光信号呈蓝
色的样本为条瘤基因型，A基因型；聚合在Y轴且荧光信号呈绿色的样本为粒瘤基因型，B基
因型；聚合在中间且荧光信号呈红色的样本为粒条相间基因型，H基于型。
master mix 5μL，正向引物0.4μL，反向引物R10.15μL，反向引物R20.15μL，DNA(10‑100ng)1
μL，ddH2O 3.3μL。PCR反应程序为94℃，15min；94℃，20s，65‑57℃(Touch down)，1min，10个
循环；94℃，20s，57℃，1min，30个循环。使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，
在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清
晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果检测。其中聚合在X轴且荧光信号呈蓝
色的样本为条瘤基因型，A基因型；聚合在Y轴且荧光信号呈绿色的样本为粒瘤基因型，B基
因型；聚合在中间且荧光信号呈红色的样本为粒条相间基因型，H基于型。
[0050] 在108株F2单株和62份苦瓜种质资源中检测结果见图3。F2群体的随机单株中存在A、B和H 3种基因型，A:B:H＝23:31:54株。62份苦瓜材料中A:B:H＝34:25:3株。同时根据变
异位点前后300bp的序列开发普通引物，引物序列F3：TTGACTGGAGAAATCCCACC(SEQ ID
NO.6)，R3：TGTCTTGCACTCAGAAAAGG(SEQ ID NO.7)，进行PCR扩增，PCR体系50μL：DNA模板2μ
L，2×PCRMix 25μL，正向引物F32μL，反向引物R32μL，ddH2O 19μL。PCR扩增程序为：94℃，
5min；94℃，30s、52℃，30s、72℃，30s，30个循环；72℃延伸5min。然后测序(委托生工生物工
程(上海)股份有限公司)，测序结果与KASP标记的结果完全吻合。证明KASP标记检测结果准
确。
异位点前后300bp的序列开发普通引物，引物序列F3：TTGACTGGAGAAATCCCACC(SEQ ID
NO.6)，R3：TGTCTTGCACTCAGAAAAGG(SEQ ID NO.7)，进行PCR扩增，PCR体系50μL：DNA模板2μ
L，2×PCRMix 25μL，正向引物F32μL，反向引物R32μL，ddH2O 19μL。PCR扩增程序为：94℃，
5min；94℃，30s、52℃，30s、72℃，30s，30个循环；72℃延伸5min。然后测序(委托生工生物工
程(上海)股份有限公司)，测序结果与KASP标记的结果完全吻合。证明KASP标记检测结果准
确。
[0051] 结合被检测材料的表型与基因型分析发现，F2群体108个单株中只有2株基因型与表型不符合，其他单株与K38基因型相同时表型均为条瘤，而基因型与G53‑2‑1相同或杂合
是表现为粒瘤或条粒相间，检测准确率为98.15％。62份来源和类型不同的苦瓜资源中，只
有1株表型与基因型不符合，检测准确率为98.39％。因此，发明人发现的这个SNP变异位点，
碱基为T与粒瘤性状紧密连锁，C与条瘤性状紧密连锁，并且该KASP标记能够用来筛选苦瓜
果实表面条瘤性状，本发明中针对该位点设计的KASP标记或普通引物均可用来有效检测筛
选苦瓜果瘤性状。
是表现为粒瘤或条粒相间，检测准确率为98.15％。62份来源和类型不同的苦瓜资源中，只
有1株表型与基因型不符合，检测准确率为98.39％。因此，发明人发现的这个SNP变异位点，
碱基为T与粒瘤性状紧密连锁，C与条瘤性状紧密连锁，并且该KASP标记能够用来筛选苦瓜
果实表面条瘤性状，本发明中针对该位点设计的KASP标记或普通引物均可用来有效检测筛
选苦瓜果瘤性状。
[0052] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存
在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0053] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来
说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护
范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护
范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。