一种检测肠毒素的拉曼传感分析方法

摘要

本发明提供了一种检测肠毒素的拉曼传感分析方法，属于光分析技术领域。包括如下步骤：将溴化铯(CsBr)和溴化铅(PbBr2)粉末掺杂在介孔二氧化硅(MSNs)中，通过高温去溶剂法制备空间受阻的CsPbBr3@MSNs。Ag岛通过配体2‑巯基苯并咪唑‑5‑羧酸(MBIA)在Au核上生长，合成了Au‑Ag Janus NPs。此外，配体MBIA充当拉曼信标分子，表现出非常独特且稳定的拉曼信号。Au‑Ag Janus NPs与CsPbBr3@MSNs通过抗原抗体形成的复合材料可以大大放大SERS信号。以MBIA的拉曼信号作为检测信号，避免拉曼信标的额外修饰。本发明的检测方法灵敏度高、特异性强。

权利要求

1.一种检测肠毒素的拉曼传感分析方法，其特征在于，所述分析方法包括如下步骤：将介孔二氧化硅包覆的CsPbBr3纳米粒子CsPbBr3@MSNs进行表面肠毒素抗体SEC‑1的修饰得到CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液；将Au‑Ag Janus NPs进行表面肠毒素抗原SEC‑2的修饰得到Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液；将Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液与SEC的溶液混合反应，之后加入CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液，反应结束后测定反应溶液的拉曼光谱；

Au‑Ag Janus NPs的制备方法为：向Au NPs中加入2‑巯基苯并咪唑‑5‑羧酸（ MBIA） 反应，待反应结束后冷却至室温，接着加入对苯二酚和AgNO3溶液，得到的混合溶液在室温下静置3‑5h，之后固液分离取固相并将固相分散在水中得到Au‑Ag Janus NPs溶液。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法为定量检测，所述分析还包括标准曲线，根据标准曲线进行定量分析的步骤，其中标准曲线的制备如下：将Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液与SEC标准溶液混合，室温下孵育1.8‑2.4h，之后加入CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液，室温下孵育1.6‑2.0h；反应结束后通过拉曼光谱仪测试溶液的拉曼光谱，得到一条以SEC浓度对数为横坐标，以拉曼信标MBIA的信号强度I‑I0为纵坐标的标准曲线，其中I表示加入不同浓度SEC抗原之后溶液的拉曼强度，I0表示Au‑Ag Janus原本的拉曼强度。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液的制备方法如下：

①CsPbBr3@MSNs的制备：

将CsBr、PbBr2与介孔二氧化硅MSNs混合并加入DMSO，并置于145‑155℃的真空烘箱反应，待溶剂烘干后研磨即得CsPbBr3@MSNs粉末；

②表面肠毒素抗体SEC‑1的修饰：

将CsPbBr3@MSNs表面修饰氨基后加入戊二醛和NaBH4溶液，反应之后去除未完全吸附的戊二醛，用PBS缓冲溶液复溶，加入SEC‑1溶液，室温下孵育2‑3h，离心并用BSA溶液封闭反应位点，室温下保存2‑3h，封闭未结合抗体的结合位点，反应结束后固液分离取沉淀物并用水清洗至少三次，接着将沉淀物重新分散在PBS缓冲溶液中，即得CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液制备方法如下：

向肠毒素抗原SEC‑2溶液中加入Au‑Ag Janus NPs溶液，室温下搅拌5‑6h；离心用BSA溶液重悬产物，室温下保存2‑3h，封闭未结合抗体的结合位点，反应结束后固液分离取沉淀物，用水清洗至少三次，最后将沉淀物重新分散在PBS缓冲溶液中，即得Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液。

5.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，步骤①中所述CsBr、PbBr2、介孔二氧化硅MSNs的质量比为1.0‑1.2:1.7‑2.0:9‑12。

6.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，步骤②中戊二醛浓度为20％‑25％，NaBH4溶液浓度为24‑26mM，BSA溶液浓度为8‑10mg/mL，SEC‑1溶液的浓度为10‑14μM。

7.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，步骤②中氨基化的CsPbBr3@MSNs溶液、戊二醛、NaBH4溶液、SEC‑1溶液与BSA溶液体积比为1‑2:1‑2:2‑4:5‑6:8‑10。

8.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，步骤②中SEC‑2溶液浓度为10‑14μM。

9.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，步骤②中所述SEC‑2溶液与Au‑Ag Janus NPs溶液的摩尔比为1:100‑1:110。

10.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，步骤①中Au NPs与2‑巯基苯并咪唑‑

5‑羧酸MBIA反应条件为：60‑70℃的水浴中孵育2‑3h。

说明书

一种检测肠毒素的拉曼传感分析方法

技术领域

[0001] 本发明属于光分析技术领域，尤其是涉及一种检测肠毒素的拉曼传感分析方法。

背景技术

[0002] 金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs，包括SEA、SEB、SEC、SED和SEE)被认为是导致食物中毒的常见毒素，会导致细菌性食物中毒、菌血症、皮肤组织感染等疾病。不允许在食物中检
出。作为乳制品和环境中最常见的金黄色葡萄球菌肠毒素，SEs的灵敏、准确检测对食品安
全具有重要意义。目前检测肠毒素的方法主要有：酶联免疫分析法、质谱分析、PCR法、电化
学免疫分析法等，但是存在检出限高、操作繁琐、试剂设备昂贵、耗时、灵敏度低等缺点。食
品安全对复杂基质中SEs的准确、抗干扰检测提出了迫切的要求。

[0003] SERS检测速度快、可重复性好，能够实现无损检测，在分析检测中占有非常重要的地位。近年来，半导体纳米材料发展迅猛。等离子体纳米材料与半导体纳米材料形成的复合
材料具有更强的SERS增强作用，这是由于贵金属和相邻半导体之间的电荷转移及电磁波衰
减的抑制。因此，开发基于等离子体‑半导体纳米复合材料的拉曼传感器可以实现奶制品中
SEC的灵敏检测。

发明内容

[0004] 本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种拉曼传感器的肠毒素检测方法。本发明具有较强灵敏度以及较强特异性。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一种检测肠毒素的拉曼传感分析方法，所述分析方法包括如下步骤：将介孔二氧化硅包覆的CsPbBr3纳米粒子CsPbBr3@MSNs进行表面肠毒素抗体SEC‑1的修饰得到CsPbBr3@
MSNs/SEC‑1溶液；将Au‑Ag Janus NPs进行表面肠毒素抗原SEC‑2的修饰得到Au‑Ag Janus 
NPs/SEC‑2溶液；将Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液与SEC的溶液混合反应，之后加入CsPbBr3@
MSNs/SEC‑1溶液，反应结束后测定反应溶液的拉曼光谱。

[0007] 进一步的，所述分析方法为定量检测，所述分析方法还包括标准曲线，根据标准曲线进行定量分析的步骤，其中标准曲线的制备如下：将Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液与SEC
标准溶液混合，室温下孵育1.8‑2.4h，之后加入CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液，室温下孵育1.6‑
2.0h；反应结束后通过拉曼光谱仪测试溶液的拉曼光谱，得到一条以SEC浓度对数为横坐
标，以拉曼信标MBIA的信号强度(I‑I0)为纵坐标的标准曲线，其中I表示加入不同浓度SEC
抗原之后溶液的拉曼强度，I0表示Au‑Ag Janus原本的拉曼强度。

[0008] 进一步的，所述CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液的制备方法如下：

[0009] ①CsPbBr3@MSNs的制备：

[0010] 将CsBr、PbBr2与介孔二氧化硅MSNs混合并加入DMSO，并置于145‑155℃的真空烘箱反应，待溶剂烘干后研磨即得CsPbBr3@MSNs粉末；

[0011] ②表面肠毒素抗体SEC‑1的修饰：

[0012] 将CsPbBr3@MSNs表面修饰氨基后加入戊二醛和NaBH4溶液，反应之后去除未完全吸附的戊二醛，用PBS缓冲溶液复溶，加入SEC‑1溶液，室温下孵育2‑3h，离心并用BSA溶液封闭
反应位点，室温下保存2‑3h，封闭未结合抗体的结合位点，反应结束后固液分离取沉淀物并
用水清洗至少三次，接着将沉淀物重新分散在PBS缓冲溶液中，即得CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶
液。

[0013] 进一步的，所述Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液制备方法如下：

[0014] ①Au‑Ag Janus NPs的制备：

[0015] 向Au NPs中加入2‑巯基苯并咪唑‑5‑羧酸(MBIA)反应，待反应结束后冷却至室温，接着加入对苯二酚和AgNO3溶液，得到的混合溶液在室温下静置3‑5h，之后固液分离取固相
并将固相分散在水中得到Au‑Ag Janus NPs溶液；

[0016] ②Au‑Ag Janus NPs表面肠毒素抗原SEC‑2的修饰：

[0017] 向肠毒素抗原SEC‑2溶液中加入Au‑Ag Janus NPs溶液，室温下搅拌5‑6h；离心用BSA溶液重悬产物，室温下保存2‑3h，封闭未结合抗体的结合位点，反应结束后固液分离取
沉淀物，用水清洗至少三次，最后将沉淀物重新分散在PBS缓冲溶液中，即得Au‑Ag Janus 
NPs/SEC‑2溶液。

[0018] 进一步的，步骤①中所述CsBr、PbBr2、介孔二氧化硅MSNs的质量比为1.0‑1.2:1.7‑2.0:9‑12。

[0019] 进一步的，步骤②中戊二醛浓度为20％‑25％，NaBH4溶液浓度为24‑26mM，BSA溶液浓度为8‑10mg/mL，SEC‑1溶液的浓度为10‑14μM。

[0020] 进一步的，步骤②中氨基化的CsPbBr3@MSNs溶液、戊二醛、NaBH4溶液、SEC‑1溶液、BSA溶液体积比为1‑2:1‑2:2‑4:5‑6:8‑10。

[0021] 进一步的，步骤②中SEC‑2溶液浓度为10‑14μM。

[0022] 进一步的，步骤②中所述SEC‑2溶液与Au‑Ag Janus NPs溶液的摩尔比为1:100‑1:110。

[0023] 进一步的，步骤①中Au NPs与2‑巯基苯并咪唑‑5‑羧酸(MBIA)反应条件为：60‑70℃的水浴中孵育2‑3h。

[0024] 本发明有益的技术效果在于：

[0025] 本发明提出的一种奶制品中监测SEC含量的拉曼传感器具有很高的灵敏度和特异性，本检测方法无需修饰额外的拉曼信标分子，MBIA嵌入在Au‑Ag Janus NPs中的交界处，
可以减弱环境对拉曼信标的影响，大大提高了检测的灵敏度；CsPbBr3@MSNs作为半导体纳
米材料可以大大增强SERS信号，SEC的检测结果可以通过拉曼光谱反映，实现灵敏检测。

附图说明

[0026] 图1是本发明实施例2中制备得到的Au‑Ag Janus NPs的TEM图；

[0027] 图2是本发明实施例2中制备得到的CsPbBr3@MSNs的TEM图；

[0028] 图3是本发明实施例2中中存在不同浓度的SEC时，拉曼传感器的拉曼光谱及标准曲线。

具体实施方式

[0029] 下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

[0030] 实施例1

[0031] 1，等离子纳米材料Au‑Ag Janus NPs的制备：

[0032] ①单分散Au NPs的制备：

[0033] 采用柠檬酸还原法制备Au NPs作为种子。将0.8mL HAuCl4与超纯水混合加热至沸腾。在剧烈搅拌下快速加入0.9mL柠檬酸钠溶液，混合溶液继续沸腾15min。随后自然冷却至
室温，用超纯水离心洗涤，即得Au NPs；

[0034] ②Au‑Ag Janus NPs的制备：

[0035] 在剧烈搅拌下，向步骤(1)中合成的柠檬酸稳定1mL Au NPs中加入20μL 0.8mM 2‑巯基苯并咪唑‑5‑羧酸(MBIA)。混合溶液在60℃的水浴中孵育2h。反应结束后溶液冷却至室
温，并在剧烈搅拌下匀速加入50μL，8mM的对苯二酚(HQ)和终浓度为50μM的AgNO3溶液。得到
的混合溶液在室温下静置3h，以使AgNO3完全还原。反应结束后离心收集产物，并均匀分散
在超纯水中，得到Au‑Ag Janus NPs。

[0036] 2，介孔二氧化硅包覆的CsPbBr3纳米粒子的制备及表面肠毒素抗原(SEC‑1)的修饰：

[0037] ①CsPbBr3@MSNs的制备：

[0038] 称取2.0mg CsBr、3.4mg PbBr2、18mg介孔二氧化硅(MSNs)于反应瓶中，加入180μL二甲基亚砜(DMSO)，粉末和试剂振荡均匀后置于145℃的真空烘箱反应28min。溶剂烘干后
通过研钵研磨反应瓶中的粉末，即得绿色发射的CsPbBr3@MSNs粉末；

[0039] ②表面肠毒素抗体SEC‑1的修饰：

[0040] CsPbBr3@MSNs表面修饰氨基后，将10μL浓度为20％的戊二醛和20μL,24mM NaBH4溶液加入到10μL氨基化的CsPbBr3@MSNs中，室温振荡20min，离心去除未完全吸附的戊二醛。
用PBS缓冲溶液复溶，加入50μL，10μM SEC‑1溶液，室温下孵育2h，离心并用BSA溶液封闭反
应位点，室温下保存2h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯
水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中。反应结束后即得浓度为0.8mg/
mL的CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液；

[0041] 3，Au‑Ag Janus NPs表面肠毒素抗原(SEC‑2)的修饰：

[0042] 用TBE缓冲液稀释肠毒素抗体SEC‑2至浓度为10μM，再加入0.9mL步骤(1)中所得Au‑Ag Janus NPs溶液，室温下搅拌5h；离心用BSA溶液重悬产物，室温下保存2h，封闭未结
合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水离心清洗三次，最后将沉淀物重
新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为2nM的Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液。

[0043] 4，肠毒素检测的拉曼传感器的构建：

[0044] 将20μL配制好的一系列浓度为0.1pg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的SEC标准溶液分别与150μL Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液在
100μLPBS缓冲液中混合，室温下孵育1.8h；之后加入12μL CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液，室温
下孵育1.6h；反应结束后通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，得到一条以SEC浓度对
数为横坐标，以拉曼信标MBIA的信号强(I‑I0)为纵坐标的标准曲线。

[0045] 实施例2

[0046] 1，等离子纳米材料Au‑Ag Janus NPs的制备：

[0047] ①单分散Au NPs的制备：

[0048] 采用柠檬酸还原法制备Au NPs作为种子。将1.0mL HAuCl4与超纯水混合加热至沸腾。在剧烈搅拌下快速加入1.0mL柠檬酸钠溶液，混合溶液继续沸腾17.5min。随后自然冷却
至室温，用超纯水离心洗涤，即得Au NPs；

[0049] ②Au‑Ag Janus NPs的制备：

[0050] 在剧烈搅拌下，向步骤(1)中合成的柠檬酸稳定1.1mL Au NPs中加入22μL 1mM 2‑巯基苯并咪唑‑5‑羧酸(MBIA)。混合溶液在65℃的水浴中孵育2.5h。反应结束后溶液冷却至
室温，并在剧烈搅拌下匀速加入60μL,10mM的对苯二酚(HQ)和终浓度为52.5μM的AgNO3溶
液。得到的混合溶液在室温下静置4h，以使AgNO3完全还原。反应结束后离心收集产物，并均
匀分散在超纯水中，得到Au‑Ag Janus NPs，其形貌如图1所示。所制备的纳米粒子粒径均
一，均由35nm左右的Au和40nm左右的Ag组成。

[0051] 2，介孔二氧化硅包覆的CsPbBr3纳米粒子的制备及表面肠毒素抗原(SEC‑1)的修饰：

[0052] ①CsPbBr3@MSNs的制备：

[0053] 称取2.2mg CsBr、3.6mg PbBr2、21mg介孔二氧化硅(MSNs)于反应瓶中，加入190μL二甲基亚砜(DMSO)，粉末和试剂振荡均匀后置于150℃的真空烘箱反应30min。溶剂烘干后
通过研钵研磨反应瓶中的粉末，即得绿色发射的CsPbBr3@MSNs粉末(图2)；

[0054] ②表面肠毒素抗体SEC‑1的修饰：

[0055] CsPbBr3@MSNs表面修饰氨基后，将15μL浓度为23％的戊二醛和30μL,25mM NaBH4溶液加入到15μL氨基化的CsPbBr3@MSNs中，室温振荡25min，离心去除未完全吸附的戊二醛。
用PBS缓冲溶液复溶，加入55μL,12μM SEC‑1溶液，室温下孵育2.5h，离心并用BSA溶液封闭
反应位点，室温下保存2.5h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用
超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中。反应结束后即得浓度为
0.9mg/mL的CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液；

[0056] 3，Au‑Ag Janus NPs表面肠毒素抗原(SEC‑2)的修饰：

[0057] 用TBE缓冲液稀释肠毒素抗体SEC‑2至浓度为12μM，再加入1.0mL步骤(1)中所得Au‑Ag Janus NPs溶液，室温下搅拌5.5h；离心用BSA溶液重悬产物，室温下保存2.5h，封闭
未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水离心清洗三次，最后将沉淀
物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为4nM的Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液。

[0058] 4，肠毒素检测的拉曼传感器的构建：

[0059] 将25μL配制好的一系列浓度为0.1pg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的SEC标准溶液分别与160μL Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液在
125μLPBS缓冲液中混合，室温下孵育2.1h；之后加入15μL CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液，室温
下孵育1.8h；反应结束后通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，得到一条以SEC浓度对
数为横坐标，以拉曼信标MBIA的信号强(I‑I0)为纵坐标的标准曲线(图3)。根据标准曲线可
知SEC的检测范围在1pg/mL‑100ng/mL之间，该拉曼传感器可以实现SEC的灵敏检测。

[0060] 实施例3

[0061] 1，等离子纳米材料Au‑Ag Janus NPs的制备：

[0062] ①单分散Au NPs的制备：

[0063] 采用柠檬酸还原法制备Au NPs作为种子。将1.2mL HAuCl4与超纯水混合加热至沸腾。在剧烈搅拌下快速加入1.1mL柠檬酸钠溶液，混合溶液继续沸腾20min。随后自然冷却至
室温，用超纯水离心洗涤，即得Au NPs；

[0064] ②Au‑Ag Janus NPs的制备：

[0065] 在剧烈搅拌下，向步骤(1)中合成的柠檬酸稳定1.2mL Au NPs中加入24μL 1.2mM 2‑巯基苯并咪唑‑5‑羧酸(MBIA)。混合溶液在70℃的水浴中孵育3h。反应结束后溶液冷却至
室温，并在剧烈搅拌下匀速加入70μL,12mM的对苯二酚(HQ)和终浓度为55μM的AgNO3溶液。
得到的混合溶液在室温下静置5h，以使AgNO3完全还原。反应结束后离心收集产物，并均匀
分散在超纯水中，得到Au‑Ag Janus NPs。

[0066] 2，介孔二氧化硅包覆的CsPbBr3纳米粒子的制备及表面肠毒素抗原(SEC‑1)的修饰：

[0067] ①CsPbBr3@MSNs的制备：

[0068] 称取2.4mg CsBr、4.0mg PbBr2、24mg介孔二氧化硅(MSNs)于反应瓶中，加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，粉末和试剂振荡均匀后置于155℃的真空烘箱反应32min。溶剂烘干后
通过研钵研磨反应瓶中的粉末，即得绿色发射的CsPbBr3@MSNs粉末；

[0069] ②表面肠毒素抗体SEC‑1的修饰：

[0070] CsPbBr3@MSNs表面修饰氨基后，将20μL浓度为25％的戊二醛和40μL，26mM NaBH4溶液加入到20μL氨基化的CsPbBr3@MSNs中，室温振荡30min，离心去除未完全吸附的戊二醛。
用PBS缓冲溶液复溶，加入60μL，14μM SEC‑1溶液，室温下孵育3h，离心并用BSA溶液封闭反
应位点，室温下保存3h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯
水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中。反应结束后即得浓度为1mg/mL
的CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液；

[0071] 3，Au‑Ag Janus NPs表面肠毒素抗原(SEC‑2)的修饰：

[0072] 用TBE缓冲液稀释肠毒素抗体SEC‑2至浓度为14μM，再加入1.2mL步骤(1)中所得Au‑Ag Janus NPs溶液，室温下搅拌6h；离心用BSA溶液重悬产物，室温下保存3h，封闭未结
合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水离心清洗三次，最后将沉淀物重
新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为6nM的Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液。

[0073] 4，肠毒素检测的拉曼传感器的构建：

[0074] 将30μL配制好的一系列浓度为0.1pg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的SEC标准溶液分别与170μL Au‑Ag Janus NPs/SEC‑2溶液在
150μLPBS缓冲液中混合，室温下孵育2.4h；之后加入18μL CsPbBr3@MSNs/SEC‑1溶液，室温
下孵育2.0h；反应结束后通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，得到一条以SEC浓度对
数为横坐标，以拉曼信标MBIA的信号强(I‑I0)为纵坐标的标准曲线。