一种臭氧水与木霉菌组合防治白菜根肿病的方法转让专利
申请号 : CN202110377096.3
文献号 : CN112868675B
文献日 : 2022-03-08
发明人 : 魏艳丽 , 李纪顺 , 李红梅 , 扈进冬 , 赵忠娟 , 陈凯 , 杨合同
申请人 : 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心)
摘要 :
权利要求 :
1.一种臭氧水与木霉组合防治白菜根肿病的方法,其特征在于,包括如下步骤:3
(1)使用浓度为6~10mg/L的臭氧水浇灌土壤,每亩土壤浇灌70~100m臭氧水;
(2)待土壤含水量自然蒸发降至可机械整地时,施用哈茨木霉制剂作为基肥,每亩土壤
12
所施用的哈茨木霉制剂中有效活菌数为(0.5~5)×10 CFU;
哈茨木霉制剂为哈茨木霉TW21990制剂,哈茨木霉TW21990已于2016年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.12864,分类命名为哈茨木霉Trichoderma harzianum;
(3)播种前使用深绿木霉制剂对白菜种子拌种,每150g白菜种子用5g深绿木霉制剂拌8
种,深绿木霉制剂的有效活菌数为(1~10)×10CFU/g;
深绿木霉制剂为深绿木霉HB20111制剂,深绿木霉HB20111已于2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.16963,分类命名为深绿木霉Trichoderma atroviride。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,根据土壤中芸薹根肿菌基数确定6
臭氧水浓度,土壤中芸薹根肿菌基数大于10 CFU/g时,选择臭氧水浓度为8~10mg/L;土壤6
中芸薹根肿菌基数小于等于10CFU/g时,选择臭氧水的浓度为6~8mg/L。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,土壤中芸薹根肿菌基数的确定方法为:
提取土样DNA,利用芸薹根肿菌特异性引物PBF和PBR进行qPCR扩增,计算土壤中芸薹根肿菌基数,其中PBF序列为5'‑GAACGGGTTCACAGACTAGAT‑3',PBR序列为5'‑GCCCACTGTGTTAATGATCC‑3'。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,臭氧水采用多点灌溉。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,哈茨木霉制剂的制备方法为哈茨木霉通过发酵制备分生孢子,添加草炭土和/或麦饭石,制得有效活菌数为(1~10)×8
10CFU/g的哈茨木霉制剂。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)还包括向土壤施用500~1000kg蘑菇渣和/或200kg生物有机肥。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,深绿木霉制剂的制备方法为以麦饭石为载体,按质量百分比加入海藻酸钠1%、羧甲基纤维素钠2%、氯化钙0.2%和深绿木8
霉,制得有效活菌数为(1~10)×10CFU/g的深绿木霉制剂。
说明书 :
一种臭氧水与木霉菌组合防治白菜根肿病的方法
技术领域
背景技术
暖、栽培面积和复种指数增加等诸多因素影响,根肿病有逐年加重的趋势,每年约有320‑
400万公顷的大白菜等十字花科作物被芸薹根肿病菌侵染,平均损失达20%‑30%,严重制约
了白菜产业的可持续发展。
易造成土壤板结和碱性化。寻求并建立白菜根肿病绿色防控技术规程,安全、高效防治根肿
病对于白菜种植产业具有重要意义。
和植物生长也会产生负面影响,限制了臭氧在农业病虫害方面的推广应用。
发明内容
用臭氧水灌溉土壤,然后施用哈茨木霉制剂作为基肥,播前使用深绿木霉制剂对白菜种子
拌种,此方法对白菜根肿病的防治效果可达到90%以上,且不影响土壤微生态环境。
土壤所施用的哈茨木霉制剂中有效活菌数为(0.5 5)×10 CFU;
~
剂拌种,深绿木霉制剂的有效活菌数为(1 10)×10CFU/g。
~
根肿菌基数大于10CFU/g时,选择臭氧水浓度为8 10mg/L;小于等于10CFU/g时,选择臭氧
~
水的浓度为6 8mg/L。
~
GAACGGGTTCACAGACTAGAT‑3')和PBR(5'‑GCCCACTGTGTTAATGATCC‑3')进行qPCR扩增,计算土
壤中芸薹根肿菌基数。
设置一个灌溉点。
京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.12864,分类命名为哈茨木霉
Trichoderma harzianum。
子,添加草炭土和/或麦饭石,制得有效活菌数为(1 10)×10CFU/g的哈茨木霉制剂。
~
北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.16963,分类命名为深绿木霉
Trichoderma atroviride。
~
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×10CFU/g的深绿木霉制剂。
和改良土壤的多重功效。
附图说明
言,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
具体实施方式
例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通
技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护
的范围。
合物,海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、氯化钙的质量百分比分别为1%、2%和0.2%。
3 5个点,大于670m时取6 10个点,采样深度为耕作层土壤20cm左右。将所取土样集中起来
~ ~
混合均匀,用四分法将多余的土壤弃去,留取200g作为一个样品。每个地块重复取样,获得3
个样品。
根据芸薹根肿菌ITS区保守序列,设计特异性引物PBF(5'‑GAACGGGTTCACAGACTAGAT‑3')和
PBR(5'‑GCCCACTGTGTTAATGATCC‑3'),预期扩增片段大小为200bp。扩增的片段连接到T载体
上,构建标准质粒。
壤DNA 2μL,超纯水7.2μL。空白对照用水代替土壤DNA。
品加热到95℃,立刻降至60℃保持5s,然后每5s提高0.5℃递增到95℃,绘制熔解曲线,由标
准质粒建立标准曲线(图1),根据标准曲线可计算出土壤中芸薹根肿菌的基数。
样待测。试验用盆为深20cm、直径15cm的圆形花盆,每盆装土2kg,用浓度分别为2mg/L、4mg/
L、6mg/L、8mg/L、10mg/L的臭氧水浇灌,每盆浇臭氧水2L,对照浇等量无菌水,每个处理设3
个重复。无菌培养室放置7天后,每盆混合取土样0.5g,利用DNeasy Power Soil DNA
Isolation Kit(Qiagen,Valencia,CA)试剂盒,按照说明书提取土壤DNA,以PBF/PBR为引物
进行qPCR反应,计算土壤中根肿菌的数量,结果如表1所示。
5%低含量病土 416.24 234.17 61.38 0.23 0.17 0.02 0.00
25%高含量病土 1386.36 1081.46 276.35 17.86 0.35 0.11 0.02
理可将5%低含量病土中根肿菌的数量从4.16×10CFU/g降至2.3×10CFU/g,将25%高含量
8 6
病土中根肿菌的数量从1.39×10CFU/g降至1.79×10CFU/g;浓度为8mg/L的臭氧水处理可
4
将5%低含量病土中根肿菌的数量降至0.2×10CFU/g,将25%高含量病土中根肿菌的数量降
4
至1.1×10CFU/g,浓度为10mg/L的臭氧水处理,两种土中基本检测不到根肿菌。
土壤中芸薹根肿菌基数低于10CFU/g时,臭氧水的浓度为6 8mg/L;高于10CFU/g时,臭氧水
~
的浓度在8 10mg/L。
~
层土后,采集0 20cm土样,多点采样混匀后过50目筛。试验用盆为深20cm、直径15cm的圆形
~
花盆,每盆装土2kg,分别用浓度为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L的臭氧水浇灌,每盆
浇臭氧水2L,对照浇等量无菌水,各处理设3个重复,待土壤湿度合适时进行播种,常规管
理,4周后调查白菜各生长指标,结果如表2所示。
对照 96.41±2.35a 13.15±1.38a 0.57±0.03a 0.508±0.012a
2mg/L 94.05±1.64a 14.76±0.87a 0.65±0.18a 0.498±0.025a
4mg/L 97.82±1.91a 13.67±0.63a 0.61±0.10a 0.514±0.023a
6mg/L 96.53±2.62a 10.06±0.56ab 0.55±0.07a 0.528±0.012a
8mg/L 91.59±1.24a 9.34±0.81b 0.45±0.03b 0.537±0.084a
10mg/L 92.48±2.76a 8.97±0.38b 0.41±0.02b 0.551±0.116b
发芽率和幼苗生长产生显著影响,使植株矮小,株高和单株干重与其他处理间差异显著。原
因是臭氧的极强灭生性氧化作用,破坏了土壤的微生态环境,从而影响植物的生长,需要在
臭氧处理后添加木霉等有益微生物来重建健康土壤微生态环境。
样混匀后过50目筛。
接用臭氧浇灌臭氧处理组和臭氧+木霉制剂组,调节臭氧水浓度为8mg/L,每盆浇臭氧水2L,
对照浇等量自来水。待土壤含水量适宜种植操作后,木霉制剂组和臭氧+木霉制剂组每盆加
7
入1.5g有效活菌数为3×10CFU/g的哈茨木霉TW21990制剂,与表层10cm土混匀。取30g白菜
8
种子用1g活菌数为3×10 CFU/g的深绿木霉HB20111固体菌剂拌种,每盆播种15粒。依据土
壤干湿情况每间隔3 4d浇一次水,温室中培养5周后,调查白菜株高、干重、根肿病发病情
~
况,并以PBF/PBR为引物对白菜根际土壤DNA进行qPCR反应,检测根际土壤中病原菌的数量,
具体检测方法同实施例1。
78.17%;而臭氧水浇灌处理组,白菜根系健康,根肿病发病率仅为2.5%,臭氧水与木霉制剂
联合处理发病率为6.25%;木霉处理能有效缓解臭氧水消毒土壤后对植株的影响,其株高和
干重都与对照无显著差异。
中根肿菌的数量,从而也可减轻下一茬白菜的发病程度。
8
木霉HB20111制剂,二者的有效活菌数均为3×10CFU/g。
斤/亩;处理2:6mg/L臭氧水100m /亩浇灌+哈茨木霉TW21990制剂5公斤/亩+蘑菇渣800公
斤/亩;处理3:常规处理+蘑菇渣800公斤/亩;处理4:常规处理(农民习惯种植)。各处理均机
械翻耕20cm,播种前,处理1和处理2用深绿木霉HB20111制剂拌种,具体操作为每150g白菜
种子用5g深绿木霉HB20111制剂拌种。11月15日收获时进行病害调查和测产,结果如表3所
示。
1 38.67 53.59 3.92 7056 28.52
2 8.21 90.15 4.37 7866 43.28
3 56.84 31.79 3.67 6606 20.33
4 83.33 — 3.05 5490 —
的实施例进行各种等效的修改或替换,而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任
何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应
涵盖在本发明的保护范围之内。