一种多巴胺功能化聚(β-氨基酯)及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)及其制备方法和应用，该聚(β‑氨基酯)结构式如下，其制备方法是将1,4‑丁二醇双丙烯酸酯和含氨基单体进行聚合反应；再采用小分子胺对聚合物进行封端；最后对多巴胺酚羟基脱保护，得到多巴胺功能化聚(β‑氨基酯；将多巴胺引入到PBAE中，并采用三价铁离子与其络合，形成包封型纳米粒子结构，提高复合物的稳定性，获得转染效率高且细胞毒性小的基因转染载体，使得其在非病毒基因载体方面具有潜在的临床应用价值。

权利要求

1.一种多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)，其特征在于，结构式如下：其中，m/n＝1:1～9；R1选自如下结构式中一种：R2选自如下结构式中一种：

2.根据权利要求1所述的多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)，其特征在于，所述多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)的分子量为2000～20000Da。

3.根据权利要求1或2所述的多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对多巴胺的酚羟基进行保护；

(2)将1,4‑丁二醇双丙烯酸酯和含氨基单体进行聚合反应；

(3)再采用小分子胺对步骤(2)制备的聚合物进行封端；

(4)对步骤(3)封端后的聚合物中多巴胺的酚羟基脱保护，得到所述多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)；

所述含氨基单体为步骤(1)得到的多巴胺与5‑氨基‑1‑戊醇、N,N‑二甲基乙二胺、N,N‑二乙基乙二胺中至少一种的组合物；所述含氨基单体中所述多巴胺的摩尔占比为10～

50％。

4.根据权利要求3所述的多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，多巴胺的酚羟基保护剂选自三甲基氯硅烷或二甲基叔丁基氯硅烷；反应溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、N,N‑二甲基甲酰胺中至少一种；反应温度为0～30℃，反应时间为

10～15h。

5.根据权利要求3所述的多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述1,4‑丁二醇双丙烯酸酯与含氨基单体的摩尔比为1.1～1.2:1；所述聚合反应的温度为70～90℃，时间为12～48h。

6.根据权利要求3所述的多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述小分子胺包括多巴胺、N‑氨丙基吗啉、1‑(3‑氨丙基)‑4‑甲基哌嗪中至少一种；

所述小分子胺与聚合物的摩尔比为1.8～2.2:1；封端反应的溶剂为二甲基亚砜、四氢呋喃、N,N‑二甲基甲酰胺中至少一种，反应温度为5～30℃；反应时间为2～6h；

步骤(4)中，采用的脱保护剂包括三溴化硼、四丁基氟化铵、碳酸钾中至少一种；脱保护剂与聚合物的摩尔比为4～6:1；反应溶剂包括二甲基亚砜、四氢呋喃、N,N‑二甲基甲酰胺中的任一种，反应时间为2～6h，反应温度为5～30℃。

7.一种包括权利要求1或2所述多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)和siRNA的复合物。

8.根据权利要求7所述复合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：将多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)与siRNA加入到25mM，pH值为5.0乙酸‑乙酸钠缓冲溶液中涡旋5～30s，静置5～

30min，加入铁离子，即得复合物。

9.根据权利要求7所述复合物的制备方法，其特征在于，所述siRNA的浓度为0.05～0.2μmol/L，多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)与siRNA的N/P比值为1～40:1。

10.根据权利要求7所述复合物在制备基因治疗的药物或基因沉默的试剂盒中的应用。

说明书

一种多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 干扰RNA(RNAi)是一种自然发生的细胞机制，最终会导致特异性基因的敲低。通过siRNA传递靶向基因敲低在治疗异常基因表达引起的疾病方面具有潜在的临床应用价值。
但是，安全高效的细胞内siRNA递送仍然具有挑战性。目前研究已经将可以递送DNA的载体
材料(脂质体、无机材料和聚合物)用siRNA的递送。siRNA特有的两个主要传递障碍是：纳米
颗粒稳定性和细胞质靶向性。由于siRNA比DNA质粒小约200倍，且刚度相对较大，导致其与
阳离子聚合物的静电相互作用较低，阻碍两者自组装形成稳定且尺寸小的纳米粒子。另一
方面，siRNA只有有效进入细胞中，在细胞质基质中降解mRNA。

[0003] 聚(β‑氨基酯，PBAE)是一种易于合成，结构适应性强的阳离子聚合物，并且PBAE结构中含有酯键，在体内可以水解以降低细胞毒性。CN111718494A公开了一种具有高效基因
递送能力的还原响应性超支化聚β‑氨基酯及其制备方法和应用，该聚合物通过“A2+B3+C2”
迈克尔加成方法聚合而成使其具有超支化结构。相比于线性结构，支化结构可增强聚合物
与核酸分子的相互作用，显著提高其基因缩合能力，同时可通过增强与细胞膜之间的相互
作用增加细胞摄取。该聚合物的主链上具有还原响应的基团(二硫键)，在受损血管内皮细
胞内的GSH作用下，聚β‑氨基酯在细胞质中可迅速被降解，释放出所包载的基因药物(ICAM‑
1siRNA)，实现基因的高效转染，同时降低材料毒性。

[0004] CN106554499A公开了一种含二硫键的聚(β‑氨基酯)类聚合物基因载体。该聚(β‑氨基酯)类聚合物是一种通过加成聚合反应制备的阳离子聚合物，可在体外通过静电作用
与带负电的质粒DNA结合，进而把DNA转运到细胞中实现基因传递。该聚(β‑氨基酯)类聚合
物引入二硫键，使其在细胞内具有氧化还原响应机制，有助于聚合物的降解以及DNA在细胞
内的充分释放。细胞毒性实验与细胞转染实验表明该含二硫键的聚(β‑氨基酯)类聚合物基
因载体在具有较低的细胞毒性的同时具备较高的转染效率，明显高于常规的商业化基因转
染试剂。

[0005] 现有技术中主要提高转染效率方面关注点主要集中在提高聚合物的分子量、正电荷及支化度上，但正电荷过高会导致包裹了siRNA后所形成的纳米颗粒过于紧密，胞吞后无
法在胞内充分释放，此外分子量大还会导致细胞毒性的增加。因此要解决基因载体与siRNA
纳米颗粒的不稳定性和细胞内高效释放来改善siRNA的递送问题，仍需继续探索。

发明内容

[0006] 本发明为了合成高效低毒且稳定的基因转染载体，提供了一种新型的聚(β‑氨基酯)，将多巴胺引入到阳离子聚合物中，与金属离子络合形成血清中稳定基因转染载体，使
得载体在体内运输过程中稳定性提高，从而进一步提高基因的转染效率。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

[0008] 一种多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)，结构式如下：

[0009]

[0010] 其中，R1选自5‑氨基‑1‑戊醇、N,N‑二甲基乙二胺、N,N‑二乙基乙二胺中一种；R2选自多巴胺、N‑氨丙基吗啉、1‑(3‑氨丙基)‑4‑甲基哌嗪中一种；m/n＝1:1～9。

[0011] 所述多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)的分子量为2000～20000Da。分子量过小无法与siRNA形成复合物，分子量过大毒性增加，并且复合物包载过去紧实，不能释放siRNA。

[0012] 本发明还提供所述的多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)的制备方法，包括如下步骤：

[0013] (1)对多巴胺的酚羟基进行保护；

[0014] (2)将1,4‑丁二醇双丙烯酸酯和含氨基单体进行聚合反应；

[0015] (3)再采用小分子胺对步骤(2)制备的聚合物进行封端；

[0016] (4)对步骤(3)封端后的聚合物中多巴胺的酚羟基脱保护，得到所述多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)；

[0017] 所述含氨基单体为多巴胺与5‑氨基‑1‑戊醇、N,N‑二甲基乙二胺、N,N‑二乙基乙二胺中至少一种的组合物；所述含氨基单体中多巴胺的摩尔占比为10‑50％。本发明基于聚
(β‑氨基酯)中的叔胺结构可以与带负电的siRNA的电荷作用形成复合物的基础上，增加多
巴胺结构，将所形成的复合物进一步通过三价铁离子与酚羟基的络合作用，增加复合物的
尺寸稳定性，使得降低聚合物毒性的同时增加基因转染效率。当多巴胺的含量过高时，复合
物与铁离子的络合作用高，导致复合物的尺寸多大，产品效果不理想。多巴胺含量太低时，
无法有效与铁离子络合，复合物的尺寸稳定性较差。

[0018] 步骤(1)中，对多巴胺的酚羟基进行保护的具体步骤为：将多巴胺盐酸盐与缚酸剂溶于溶剂中，缓慢滴加多巴胺的酚羟基保护剂，反应结束后产物经旋蒸、洗涤、干燥得到酚
羟基被保护的多巴胺单体。

[0019] 步骤(1)中，多巴胺的酚羟基保护剂选自三甲基氯硅烷或二甲基叔丁基氯硅烷；反应溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、N,N‑二甲基甲酰胺中至少一种；反应温度为0～30
℃，反应时间为10～15h。优选反应时间为12h。该步骤目的在于将多巴胺的两个酚羟基先进
行保护。

[0020] 所述缚酸剂包括咪唑、三乙胺、吡啶中任一种，优选地，缚酸剂为咪唑。

[0021] 步骤(2)中，所述1,4‑丁二醇双丙烯酸酯与含氨基单体的摩尔比为1.1～1.2:1无溶剂条件下进行反应；所述聚合反应的温度为70～90℃，时间为12～48h；优选地，反应温度
为90℃，反应时间为24h。单体聚合后形成多巴胺接枝化的聚(β‑氨基酯)。

[0022] 步骤(3)中，所述小分子胺包括多巴胺、N‑氨丙基吗啉、1‑(3‑氨丙基)‑4‑甲基哌嗪中至少一种；封端反应的溶剂为二甲基亚砜、四氢呋喃、N,N‑二甲基甲酰胺中至少一种，反
应温度为5～30℃；反应时间为2～6h。所述小分子胺与聚合物的摩尔比为1.8～2.2:1。封端
后的聚合物在后期形成的复合物稳定性更高。

[0023] 步骤(4)中，采用的脱保护剂包括三溴化硼、四丁基氟化铵、碳酸钾中至少一种；脱保护剂与聚合物的摩尔比为4～6:1；反应溶剂包括二甲基亚砜、四氢呋喃、N,N‑二甲基甲酰
胺中至少一种，反应时间为2～6h，反应温度为5～30℃。

[0024] 本发明还提供一种包括所述多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)和siRNA的复合物。

[0025] 本发明还提供所述复合物的制备方法，包括步骤：将多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)与siRNA加入到25mM，pH值为5.0乙酸‑乙酸钠缓冲溶液中涡旋5～30s，静置5～30min，加入
铁离子，即得复合物。

[0026] 所述siRNA的浓度为0.05～0.2μmol/L，多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)与siRNA的N/P比值为1～40:1。优选地，所述siRNA的浓度为0.1μmol/L。

[0027] 本发明还提所述复合物在制备基因治疗的药物或基因沉默的试剂盒中的应用。

[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0029] 本发明将多巴胺引入到PBAE中，并采用三价铁离子与其络合，形成包封型纳米粒子结构，提高复合物的稳定性；并在复合物进入细胞后通过细胞质内谷胱甘肽等作用将铁
离子还原，释放siRNA，获得转染效率高且细胞毒性小的基因转染载体，使得其在非病毒基
因载体方面具有潜在的临床应用价值。

附图说明

[0030] 图1为实施例1～3中制备的PBAE1～3的核磁谱图。

[0031] 图2为实施例1、4和5中制备的PBAE1、PBAE4和PBAE5的核磁谱图。

[0032] 图3为实施例1～5中制备的PBAE1～5与商业化转染试剂Lipofectamine2000细胞毒性的对比结果。

[0033] 图4为实施例1～5中制备的PBAE1～5与siRNA形成的复合物的粒径。

[0034] 图5为实施例1～5中制备的PBAE1～5与siRNA形成的复合物的电势。

[0035] 图6为实施例1、4和5中制备的PBAE1、PBAE4和PBAE5与siRNA形成的复合物粒径稳定性。

[0036] 图7为实施例1～5中制备的PBAE1～5和商业化转染试剂Lipofectamine2000与siRNA形成的复合物的HeLa‑GFP细胞转染结果。

具体实施方式

[0037] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于
限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未
脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

[0038] 实施例中化学品均来自市售商品化化学试剂，siRNA源自生物试剂公司定制，siGFP序列为：5’‑CAA GCU GAC CCU GAA GUU CTT‑3’；5’‑GAA CUU CAG GGU CAG CUU GTT‑
3’。

[0039] 实施例1

[0040] (1)多巴胺酚羟基保护：将多巴胺盐酸盐(2mmol)和咪唑(2.4mmol)溶解于二氯甲烷溶液(10mL)中，在冰浴中滴加二甲基叔丁基氯硅烷(4mmol)，于25℃下搅拌反应12h。反应
后混合溶液经旋蒸得粗产物，通过溶液洗涤、分液、旋蒸、干燥的方式得到酚羟基被保护的
多巴胺单体；

[0041] (2)将步骤(1)制备的多巴胺单体(0.5mmol)与5‑氨基‑1‑戊醇(2mmol)混合后，与1,4‑丁二醇二丙烯酸酯(2.75mmol)一同在二甲基亚砜中90℃搅拌反应24h，得到聚合物；

[0042] (3)将步骤(2)制备的聚合物(1mmol)溶解于四氢呋喃溶液(4mL)中，反应体系中加入2mmol N‑氨丙基吗啉，室温搅拌4h，得到封端的聚合物；

[0043] (4)将封端后的1mmol聚合物加入到5mmol四丁基氟化铵的四氢呋喃(5mL)溶液中搅拌4h，最终得到多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)PBAE1。

[0044] 实施例2～3

[0045] 按照实施例1的制备工艺，将步骤(2)中多巴胺单体与5‑氨基‑1‑戊醇的量分别替换为1mmol与1.5mmol、1.25mmol与1.25mmol，其余步骤不变，分别得到多巴胺功能化聚(β‑
氨基酯)PBAE2和PBAE3。

[0046] 实施例4～5

[0047] 按照实施例1的制备工艺，将步骤(1)中5‑氨基‑1‑戊醇分别替换为N,N‑二甲基乙二胺和N,N‑二乙基乙二胺，其余步骤不变，分别得到多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)PBAE4和
PBAE5。

[0048] 对比例1

[0049] 以商业化转染试剂Lipofectamine 2000作为对比例。

[0050] 核磁表征

[0051] 对实施例制备的聚合物PBAE1～5进行核磁氢谱表征，氘代试剂为CDCl3，结果如图1和图2所示，PBAE1～5聚合物主体结构峰的化学位移为：1.2‑1.45(m,‑CH2),1.6(s,‑
COOCH2CH2),2.25‑2.5(m,‑NCH2),2.6‑2.7(m,‑COOCH2NCH2),3.4(s,‑N(CH2)2),4.0(s,‑
COOCH2)。PBAE1～3在化学位移6.0‑7.0处出现的峰为多巴胺苯环上的氢，随着多巴胺在聚
合物中比例增加，其峰强度逐渐增加；PBAE4在1.3处出现N,N‑二甲基乙二胺中出现‑NCH3
峰。PBAE5在1.0处出现N,N‑二乙基乙二胺中出现‑NCH2CH3峰。

[0052] 细胞毒性测试

[0053] 将实施例1～5制备的PBAE1～5通过四唑盐(MTT)比色法测定其细胞毒性，商业化产品Lipofectamine 2000作为阳性对照。Hela细胞培养在含10％FBS的DMEM培养液(含
100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中，并放置于37℃，5％CO2的孵箱中。取对数生长期的细
3
胞，以每孔5×10个细胞接种于96孔板，每孔体积为180μL。将培养板移入孵箱中孵育过夜。
每孔加入不同剂量的PBAE或对照组20μL，培养48h。每孔加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，孵育4
小时。小心吸取孔内培养上清液，每孔加入100μL二甲亚砜，室温温育30分钟。振荡后通过酶
标仪测定各孔在562nm和620nm的光吸收值，计算各个组别的细胞毒性。

[0054] 测试结果如图3所示，与对比例1相比，PBAE聚合物在最高使用浓度条件下(10μg/mL)细胞活性均在80％以上，说明所制备的PBAE系列聚合物具有较低的细胞毒性。

[0055] 实施例6

[0056] 将实施例1～5制备的多巴胺功能化聚(β‑氨基酯)PBAE1～5和商业化转染试剂Lipofectamine 2000分别溶解于二甲基亚砜中配制成100mg/mL的母液，将siRNA溶于乙酸‑
乙酸钠缓冲溶液(pH＝5.0,10mM)中，按照不同N/P比例制备聚合物溶液，并其与siRNA溶液
等体积混合，然后加入铁离子(与多巴胺摩尔比为1:3)，立即涡旋振荡10s后室温静置
10min，经过前期粒径及其PDI综合筛选和分析，采用N/P＝5的比例通过粒径分析仪
Zetasizer进行粒径和电位测试。

[0057] 粒径测试结果如图4所示，PBAE1～5所形成的纳米颗粒的粒径均在100～250nm的范围内，且在PBAE1～3中，PBAE1的粒径最小。说明PBAE结构中多巴胺的含量增加与铁离子
络合越强，纳米粒子聚集能力越强，导致粒径增加；在PBAE3～5中，PBAE5的粒径最小，说明
疏水结构有利于纳米粒子形成更稳定的结构。纳米颗粒电位测试结果如图5所示，表明
PBAE1～5的Zeta电位均在5～20mV之间，有利于基因输送和转染。

[0058] 粒径稳定性测试

[0059] 将实施例1、4和5制备的复合物PBAE1、PBAE4、PBAE5和对比例1的Lipo2000分别置于pH＝7.4HEPES缓冲液中，在间隔时间内测试复合物粒径，观察其稳定性。结果如图6所示，
PBAE1和PBAE5所形成的纳米粒子的粒径随时间变化与商业化试剂相比变化较小，说明尺寸
稳定性较好。

[0060] 应用例

[0061] 复合物体外细胞转染—绿色荧光蛋白基因转染：

[0062] 将HeLa细胞分别培养于24孔扳中，细胞密度为8×104个/孔，毎孔1mL培养基，并将细胞置于孵箱中培养24h。将每孔中培养基替换为无血清培养基，并加入制备好N/P＝5的纳
米复合物(siRNA为siGFP)溶液，培养4h。然后弃去培养基，替换为含血清的培养基继续培养
至48h。弃去培养基，用胰酶将细胞消化收集到离心管中，PBS溶液清洗两次，最后将细胞悬
浮于0.5mL PBS溶液中，采用流式细胞仪检测。绿色荧光蛋白的激发波长为488nm。实验中，
阳性对照为Lipofectamine 2000/siGFP复合物，阴性对照为不经任何处理的细胞。

[0063] 测试结果如图7所示，Control组为未进行基因转染的空白对照组，将其他实验组与其进行对比得到图7的相对GPF荧光相对值。PBAE1～5与商业化试剂相比，PBAE1和5的转
染能力略优于Lipofectamine 2000，且其纳米粒子稳定性优于商业化转染试剂，具有潜在
的应用前景。