生产赖氨酸的微生物以及赖氨酸的生产方法转让专利
申请号 : CN202010042203.2
文献号 : CN112877269B
文献日 : 2021-12-24
发明人 : 孙际宾 , 陈久洲 , 郑平 , 周文娟 , 郭轩 , 马延和
申请人 : 中国科学院天津工业生物技术研究所
摘要 :
本发明公开了一种生产L‑赖氨酸的谷氨酸棒杆菌。所述菌株中与SEQ ID NO:1所示多肽同源性高于98％以上且C末端具有FhuF结构域的多肽失活。本发明还公开了该L‑赖氨酸生产菌株的构建方法和利用所述菌株制备L‑赖氨酸的方法。本发明构建的L‑赖氨酸生产菌株的赖氨酸产量和葡萄糖转化率提高，从而能够降低生产成本。
权利要求 :
1.一种产L‑赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株中SEQ ID NO: 1所示多肽失活。
2.如权利要求1所述的L‑赖氨酸生产菌株，其特征在于，所述多肽失活是指，与内源性多肽相比，所述多肽的编码基因的转录、表达降低至少30%，或者所述多肽的活性降低至少
30%；或者所述多肽的编码基因被去除。
3.一种产L‑赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述菌株经修饰，其中SEQ ID NO: 1所示多肽失活。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多肽失活是指，与内源性多肽相比，所述多肽的编码基因的转录、表达降低至少30%，或者所述多肽的活性降低至少30%；或者所述多肽的编码基因被去除。
5.一种制备L‑赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
1) 培养权利要求1或2所述的L‑赖氨酸生产菌株或权利要求3或4所述方法构建的L‑赖氨酸生产菌株，使之产生L‑赖氨酸；和
2) 从步骤1)所得到的培养液中分离L‑赖氨酸。
6.权利要求1或2所述的L‑赖氨酸生产菌株或权利要求3或4所述的方法制备的L‑赖氨酸生产菌株在生产L‑赖氨酸中的应用。
说明书 :
生产赖氨酸的微生物以及赖氨酸的生产方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及L‑赖氨酸高产菌株、所述高产菌株的构建方法和应用。
背景技术
[0002] L‑赖氨酸，简称赖氨酸，是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中。全球产业分析(GIA)公司《氨基酸：全球战略
商业报告》显示，到2018年，全球赖氨酸的市场规模将达到60亿美元。赖氨酸主要采用微生
物发酵法来生产，目前，主要的生产菌株包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等的微生物，而由于
谷氨酸棒杆菌的生理优越性，谷氨酸棒杆菌已成为工业中最重要的生产菌株。随着生物技
术的不断发展，近年来，对谷氨酸棒杆菌进行代谢工程改造以提高其赖氨酸产量的方法也
不断出现，包括赖氨酸合成途径的改造，赖氨酸合成竞争途径的弱化等等，当前赖氨酸工业
生产菌株的产酸能力已达到较高的水平。
商业报告》显示，到2018年，全球赖氨酸的市场规模将达到60亿美元。赖氨酸主要采用微生
物发酵法来生产，目前，主要的生产菌株包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等的微生物，而由于
谷氨酸棒杆菌的生理优越性，谷氨酸棒杆菌已成为工业中最重要的生产菌株。随着生物技
术的不断发展，近年来，对谷氨酸棒杆菌进行代谢工程改造以提高其赖氨酸产量的方法也
不断出现，包括赖氨酸合成途径的改造，赖氨酸合成竞争途径的弱化等等，当前赖氨酸工业
生产菌株的产酸能力已达到较高的水平。
[0003] 然而，工业上仍然需要生产能力(产量及转化率)更高的赖氨酸生产菌株，以便进一步降低生产成本。因此，本领域急需新的赖氨酸生产菌株的构建方法，以便进一步提高赖
氨酸的产量。
氨酸的产量。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种新的赖氨酸生产菌株，该菌株的构建方法以及利用所构建的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法。
[0005] 在第一方面，本发明提供一种L‑赖氨酸的生产菌株，所述菌株中与SEQ ID NO:1所示多肽同源性为98％以上且C末端具有FhuF结构域的多肽失活。
[0006] 在具体的实施方式中，所述菌株是谷氨酸棒杆菌。
[0007] 在具体的实施方式中，所述菌株中SEQ ID NO:1所示多肽失活。
[0008] 在具体的实施方式中，所述多肽失活是指，与内源性多肽相比，所述多肽的编码基因的转录、表达降低至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，例如至少60％、至少70％、
至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，或者所述多肽
的活性降低至少30％、优选至少40％，更优选至少50％，例如至少60％、至少70％、至少
80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；或者所述多肽的编
码基因被去除。
至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，或者所述多肽
的活性降低至少30％、优选至少40％，更优选至少50％，例如至少60％、至少70％、至少
80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；或者所述多肽的编
码基因被去除。
[0009] 在优选的实施方式中，与包含内源性多肽的L‑赖氨酸生产菌株相比，所述L‑赖氨酸生产菌株的L‑赖氨酸产量提高至少5％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少
25％、更优选至少30％、最优选至少35％。
25％、更优选至少30％、最优选至少35％。
[0010] 在优选的实施方式中，与包含内源性多肽的L‑赖氨酸生产菌株相比，所述L‑赖氨酸生产菌株在生产L‑赖氨酸过程中的葡萄糖转化率提高至少10％，优选20％，更优选30％。
[0011] 在优选的实施方式中，所述内源性多肽的失活可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除多肽的编码基因；编码基因突变；改变编码基因的启动子、翻译调
控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或编码
的蛋白的结构不稳定；或其他任何通过修饰基因编码区及其临近的上下游区域使其失活的
方式等。
控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或编码
的蛋白的结构不稳定；或其他任何通过修饰基因编码区及其临近的上下游区域使其失活的
方式等。
[0012] 在优选的实施方式中，使得基因编码序列发生移码突变、错义突变、缺失、起始密码子改变等。
[0013] 在优选的实施方式中，所述赖氨酸生产菌株中选自以下的一个或几个基因被增强或过表达：
[0014] a.编码解除赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶lysC基因；
[0015] b.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；
[0016] c.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；
[0017] d.编码二氨基庚二酸脱水酶的ddh基因；
[0018] e.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；
[0019] f.编码天冬氨酸‑半醛脱水酶的asd基因；
[0020] g.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；或
[0021] h.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因。
[0022] 在优选的实施方式中，所述菌株中选自以下的一个或几个基因被弱化或表达降低：
[0023] a.编码乙醇脱水酶的adhE基因；
[0024] b.编码乙酸激酶的ackA基因；
[0025] c.编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；
[0026] d.编码乳酸脱水酶的ldhA基因；
[0027] e.编码甲酸转运蛋白的focA基因；
[0028] f.编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；
[0029] g.编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；
[0030] h.编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱水酶I双功能酶的thrA基因；
[0031] i.编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
[0032] j.编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和
[0033] h.编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。
[0034] 在第二方面，本发明提供一种L‑赖氨酸生产菌株的构建方法，所述菌株经修饰，其中与SEQ ID NO:1所示多肽同源性高于98％以上且C末端具有FhuF结构域的多肽失活。
[0035] 在具体的实施方式中，所述菌株是谷氨酸棒杆菌。
[0036] 在具体的实施方式中，所述菌株经修饰，其中SEQ ID NO:1所示多肽失活。
[0037] 在具体的实施方式中，所述多肽失活是指，与内源性多肽相比，所述多肽的编码基因的转录、表达降低至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，例如至少60％、至少70％、
至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，或者所述多肽
的活性降低至少30％、优选至少40％，更优选至少50％，例如至少60％、至少70％、至少
80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；或者所述多肽的编
码基因被去除。
至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，或者所述多肽
的活性降低至少30％、优选至少40％，更优选至少50％，例如至少60％、至少70％、至少
80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；或者所述多肽的编
码基因被去除。
[0038] 在优选的实施方式中，与包含内源性多肽的L‑赖氨酸生产菌株相比，所述L‑赖氨酸生产菌株的L‑赖氨酸产量提高至少5％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少
25％、更优选至少30％、最优选至少35％。
25％、更优选至少30％、最优选至少35％。
[0039] 在优选的实施方式中，与包含内源性多肽的L‑赖氨酸生产菌株相比，所述L‑赖氨酸生产菌株在生产L‑赖氨酸过程中的葡萄糖转化率提高至少10％，优选20％，更优选30％。
[0040] 在优选的实施方式中，所述内源性多肽的失活可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除编码基因；编码基因突变；改变编码基因的启动子、翻译调控区或
编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或编码的蛋白
的结构不稳定；或其他任何通过修饰细胞中基因编码区及其临近的上下游区域使其弱化或
失活的方式等。
编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或编码的蛋白
的结构不稳定；或其他任何通过修饰细胞中基因编码区及其临近的上下游区域使其弱化或
失活的方式等。
[0041] 在优选的实施方式中，使得多肽基因编码序列发生移码突变、错义突变、缺失、起始密码子改变等。
[0042] 在优选的实施方式中，所述方法还包括增强或过表达菌株中选自以下的一个或几个基因：
[0043] a.编码解除赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶lysC基因；
[0044] b.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；
[0045] c.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；
[0046] d.编码二氨基庚二酸脱水酶的ddh基因；
[0047] e.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；
[0048] f.编码天冬氨酸‑半醛脱水酶的asd基因；
[0049] g.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；或
[0050] h.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因。
[0051] 在优选的实施方式中，所述方法还包括弱化菌株中选自以下的一个或几个基因或使菌株中选自以下的一个或几个基因的表达降低：
[0052] a.编码乙醇脱水酶的adhE基因；
[0053] b.编码乙酸激酶的ackA基因；
[0054] c.编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；
[0055] d.编码乳酸脱水酶的ldhA基因；
[0056] e.编码甲酸转运蛋白的focA基因；
[0057] f.编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；
[0058] g.编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；
[0059] h.编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱水酶I双功能酶的thrA基因；
[0060] i.编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
[0061] j.编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和
[0062] h.编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。
[0063] 在第三方面，本发明提供一种制备L‑赖氨酸的方法，所述方法包括：
[0064] 1)培养第一方面所述的L‑赖氨酸生产菌株或第二方面所述方法构建的L‑赖氨酸生产菌株，使之产生L‑赖氨酸；和
[0065] 2)任选地从步骤1)所得到的培养液中分离L‑赖氨酸。
[0066] 在第四方面，本发明提供第一方面所述的L‑赖氨酸生产菌株或第二方面所述的方法制备的L‑赖氨酸生产菌株在生产L‑赖氨酸中的应用。
[0067] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
此不再一一累述。
具体实施方式
[0068] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一种编码假定蛋白的基因，使得该基因失活能够显著提高赖氨酸的产量，从而获得赖氨酸的高产菌株。在此基础上完成了
本发明。
本发明。
[0069] SEQ ID NO:1所示多肽
[0070] 本发明所述的SEQ ID NO:1(MSIWKRLLVQYPRFADTLTAGQPITLEELATPEVILEAVAKGQEIFGIEQPKHAAQLWFHSLCTAIVGPAVTAMVEFDVIPSLDIRRGQLHNIDGYWFGFRPEEMLVDASLHLSGTQFGE
SIRVVIDALCAATDLRPAPLWAVASDALGIAASGAGVEAFEEEHAREVAEALIEGMNSVNSVPSPRFNDDDYFIRA
GCCMIFHSPRADFCTSCPQKR)所示多肽来源于谷氨酸棒杆菌，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:
2所示(ATGAGCATCTGGAAACGTCTGTTAGTGCAGTACCCGCGCTTCGCCGACACCCTCACAGCCGGCCAACCCA
TCACGCTCGAGGAATTAGCAACCCCGGAAGTGATCTTGGAAGCTGTTGCCAAAGGCCAAGAAATTTTCGGCATTGA
GCAGCCAAAACATGCAGCACAACTCTGGTTTCACTCCCTGTGCACCGCAATTGTCGGCCCCGCCGTCACCGCCATG
GTGGAATTCGATGTCATCCCCAGCCTCGACATACGTCGAGGTCAGCTGCATAACATCGACGGTTACTGGTTCGGCT
TCAGGCCGGAGGAGATGCTTGTCGACGCCTCCCTCCACCTGTCGGGCACCCAATTCGGCGAGAGTATCCGCGTGGT
GATTGATGCATTATGCGCTGCCACGGATCTGCGACCGGCACCCCTGTGGGCGGTTGCCTCAGATGCGTTGGGAATC
GCAGCTAGCGGCGCAGGTGTCGAGGCCTTTGAAGAAGAACATGCCCGCGAGGTGGCGGAAGCCCTCATTGAAGGAA
TGAATAGTGTGAACTCAGTTCCATCGCCGCGGTTTAACGACGACGATTATTTCATTCGAGCTGGATGCTGCATGAT
TTTCCACTCACCACGAGCTGATTTTTGCACGTCGTGCCCACAGAAGAGGTGA)，因其C末端含有一个FhuF的
结构域，也被注释为(2Fe‑2S)结合蛋白。通过BLAST分析发现，该蛋白多肽在不同谷氨酸棒
杆菌中保守性极高，氨基酸序列的一致性达到98.56％以上，且C末端都存在FhuF的结构域。
因此，虽然谷氨酸棒杆菌中该蛋白多肽的功能未知，但可以预测其在不同谷氨酸棒杆菌中
具有相同的功能。在本发明公开了SEQ ID NO:1所示多肽的失活可以提高谷氨酸棒杆菌L‑
赖氨酸产量后，本领域技术可以从中得到启示，即失活其他谷氨酸棒杆菌内源性的与SEQ
ID NO:1所示多肽同源性98％以上且C末端具有FhuF结构域的多肽，也可以提高L‑赖氨酸产
量，因此，采用同样手段失活与SEQ ID NO:1所示多肽同源性98％以上且C末端具有FhuF结
构域的多肽生产赖氨酸的方法，也应该包括在本发明的保护范围内。
SIRVVIDALCAATDLRPAPLWAVASDALGIAASGAGVEAFEEEHAREVAEALIEGMNSVNSVPSPRFNDDDYFIRA
GCCMIFHSPRADFCTSCPQKR)所示多肽来源于谷氨酸棒杆菌，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:
2所示(ATGAGCATCTGGAAACGTCTGTTAGTGCAGTACCCGCGCTTCGCCGACACCCTCACAGCCGGCCAACCCA
TCACGCTCGAGGAATTAGCAACCCCGGAAGTGATCTTGGAAGCTGTTGCCAAAGGCCAAGAAATTTTCGGCATTGA
GCAGCCAAAACATGCAGCACAACTCTGGTTTCACTCCCTGTGCACCGCAATTGTCGGCCCCGCCGTCACCGCCATG
GTGGAATTCGATGTCATCCCCAGCCTCGACATACGTCGAGGTCAGCTGCATAACATCGACGGTTACTGGTTCGGCT
TCAGGCCGGAGGAGATGCTTGTCGACGCCTCCCTCCACCTGTCGGGCACCCAATTCGGCGAGAGTATCCGCGTGGT
GATTGATGCATTATGCGCTGCCACGGATCTGCGACCGGCACCCCTGTGGGCGGTTGCCTCAGATGCGTTGGGAATC
GCAGCTAGCGGCGCAGGTGTCGAGGCCTTTGAAGAAGAACATGCCCGCGAGGTGGCGGAAGCCCTCATTGAAGGAA
TGAATAGTGTGAACTCAGTTCCATCGCCGCGGTTTAACGACGACGATTATTTCATTCGAGCTGGATGCTGCATGAT
TTTCCACTCACCACGAGCTGATTTTTGCACGTCGTGCCCACAGAAGAGGTGA)，因其C末端含有一个FhuF的
结构域，也被注释为(2Fe‑2S)结合蛋白。通过BLAST分析发现，该蛋白多肽在不同谷氨酸棒
杆菌中保守性极高，氨基酸序列的一致性达到98.56％以上，且C末端都存在FhuF的结构域。
因此，虽然谷氨酸棒杆菌中该蛋白多肽的功能未知，但可以预测其在不同谷氨酸棒杆菌中
具有相同的功能。在本发明公开了SEQ ID NO:1所示多肽的失活可以提高谷氨酸棒杆菌L‑
赖氨酸产量后，本领域技术可以从中得到启示，即失活其他谷氨酸棒杆菌内源性的与SEQ
ID NO:1所示多肽同源性98％以上且C末端具有FhuF结构域的多肽，也可以提高L‑赖氨酸产
量，因此，采用同样手段失活与SEQ ID NO:1所示多肽同源性98％以上且C末端具有FhuF结
构域的多肽生产赖氨酸的方法，也应该包括在本发明的保护范围内。
[0071] 术语定义
[0072] 多核苷酸，一般是指多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。本发明的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列，也可
以是在严格条件下与SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，也可以是与由SEQ
ID NO:2制备的探针杂交的核苷酸序列。这里所说的“严格条件”是指特异性杂交可发生而
非特异性杂交不发生的条件。如，在一定浓度的盐溶液中洗涤，洗涤1次，优选洗涤2次或3
次，相应地浓度为1*SSC、0.1％SDS，优选60℃下0.1*SSC、0.1％SDS，更优选68℃下0.1*SSC、
0.1％SDS，探针长度可根据杂交条件选择，通常为100bp到1kb。
以是在严格条件下与SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，也可以是与由SEQ
ID NO:2制备的探针杂交的核苷酸序列。这里所说的“严格条件”是指特异性杂交可发生而
非特异性杂交不发生的条件。如，在一定浓度的盐溶液中洗涤，洗涤1次，优选洗涤2次或3
次，相应地浓度为1*SSC、0.1％SDS，优选60℃下0.1*SSC、0.1％SDS，更优选68℃下0.1*SSC、
0.1％SDS，探针长度可根据杂交条件选择，通常为100bp到1kb。
[0073] 本文所用的术语“野生型/内源性”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态，即自然状态。
[0074] 基于本发明的教导，本领域技术人员应该理解，本发明通过将谷氨酸棒杆菌的SEQ ID NO:1所示多肽失活来提高菌株的赖氨酸产量。因此，本文所述的“SEQ ID NO:1所示多肽
失活”表示，与野生型菌株相比，SEQ ID NO:1所示多肽的表达被降低、减弱甚至完全消失，
或指产生不表达的基因，或尽管表达但表达产物不具有活性或者具有降低的活性。在具体
实施方式中，相比于野生型或内源性多肽，突变后基因的转录、表达或编码的蛋白的活性降
低至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少
90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，或者该野生型或内源性多肽的
编码基因被去除。
失活”表示，与野生型菌株相比，SEQ ID NO:1所示多肽的表达被降低、减弱甚至完全消失，
或指产生不表达的基因，或尽管表达但表达产物不具有活性或者具有降低的活性。在具体
实施方式中，相比于野生型或内源性多肽，突变后基因的转录、表达或编码的蛋白的活性降
低至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少
90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，或者该野生型或内源性多肽的
编码基因被去除。
[0075] 本发明所述“修饰”是指任何对野生型菌株或亲本菌株进行的遗传操作，包括但不限于各种分子生物学手段。
[0076] 本发明中术语“失活”可以通过修饰来实现，包括但不限于通过删除部分或全部编码基因、基因阅读框移码突变、弱化转录或翻译强度、或使用编码具有较低活性的相应酶或
蛋白质的基因或等位基因，或使对应基因或酶失去活性，及任选地组合使用这些方法。采用
合适的培养方法或基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)可以实现基因表达的降低，例如
基因表达的信号结构是阻遏基因，活性基因，操纵基因，启动子，弱化子，核糖体结合位点，
起始密码子和终止子。
蛋白质的基因或等位基因，或使对应基因或酶失去活性，及任选地组合使用这些方法。采用
合适的培养方法或基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)可以实现基因表达的降低，例如
基因表达的信号结构是阻遏基因，活性基因，操纵基因，启动子，弱化子，核糖体结合位点，
起始密码子和终止子。
[0077] 基于本发明的教导，本领域技术人员知晓，可以通过失活SEQ ID NO:1所示多肽的编码基因，或者使得SEQ ID NO:1所示多肽在细胞中不能正常发挥功能来提高赖氨酸的产
量。本领域技术人员可以通过本领域已知的技术手段实现上述目的。例如，可以通过使染色
体上的酶编码基因缺陷，或者通过修饰一个表达控制序列如启动子或SD序列来实现；也可
以通过向编码区域引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)，或向编码区引入
一个或两个碱基的插入或缺失(移码突变)或缺失部分基因来实现(Journal of
Biological Chemistry 1997，272:8611‑8617)，包括但不限于上述方法。
量。本领域技术人员可以通过本领域已知的技术手段实现上述目的。例如，可以通过使染色
体上的酶编码基因缺陷，或者通过修饰一个表达控制序列如启动子或SD序列来实现；也可
以通过向编码区域引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)，或向编码区引入
一个或两个碱基的插入或缺失(移码突变)或缺失部分基因来实现(Journal of
Biological Chemistry 1997，272:8611‑8617)，包括但不限于上述方法。
[0078] 本文所述的“葡萄糖转化率”是指底物葡萄糖转化为产物赖氨酸的摩尔比例。
[0079] 本文所说的“赖氨酸生产菌株”是指，当细菌在培养基中培养时可以生产赖氨酸并且能够积累赖氨酸，或者能够将赖氨酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离赖氨
酸的菌株。例如，可以是天然存在的赖氨酸生产菌株，也可以是经过遗传改造获得的赖氨酸
生产工程菌株，这些改造包括但不限于所述菌株中的选自以下的一个或几个基因被增强或
多表达：
酸的菌株。例如，可以是天然存在的赖氨酸生产菌株，也可以是经过遗传改造获得的赖氨酸
生产工程菌株，这些改造包括但不限于所述菌株中的选自以下的一个或几个基因被增强或
多表达：
[0080] a.编码解除赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶lysC基因；
[0081] b.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；
[0082] c.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；
[0083] d.编码二氨基庚二酸脱水酶的ddh基因；
[0084] e.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；
[0085] f.编码天冬氨酸‑半醛脱水酶的asd基因；
[0086] g.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；或
[0087] h.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因。
[0088] 此外，包含但不限于所述菌株中选自以下的一个或几个基因被弱化或表达降低：
[0089] a.编码乙醇脱水酶的adhE基因；
[0090] b.编码乙酸激酶的ackA基因；
[0091] c.编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；
[0092] d.编码乳酸脱水酶的ldhA基因；
[0093] e.编码甲酸转运蛋白的focA基因；
[0094] f.编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；
[0095] g.编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；
[0096] h.编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱水酶I双功能酶的thrA基因；
[0097] i.编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
[0098] j.编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和
[0099] h.编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。
[0100] 本发明的优点：
[0101] 1.本发明提供了一种构建赖氨酸生产菌株的新方法，从而为L‑赖氨酸高产菌株的构建开辟了新的思路；
[0102] 2.本发明构建的赖氨酸生产菌株的赖氨酸产量以及葡萄糖转化率均有所提高；和
[0103] 3.通过本发明方法生产赖氨酸的成本有所降低。
[0104] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory
Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory
Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0105] 除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验
本发明，但优选本文所述的方法和材料。
本发明，但优选本文所述的方法和材料。
[0106] 实施例1.谷氨酸棒杆菌lysC基因突变载体构建
[0107] 由于关键基因存在反馈调控作用，野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032不能积累赖氨酸。文献报道解除天冬氨酸激酶(lysC基因编码)反馈抑制的菌株可以积累赖氨酸，因此本
发明人首先通过突变天冬氨酸激酶(第311位Thr突变为Ile)构建一株具有一定赖氨酸合成
能力的菌株。根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别设计引物lysC‑F1/R1
和lysC‑F2/R2，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得用于lysC突变的上游和下游
同源臂片段(其中lysC基因的第932位碱基C突变为T)。上述PCR片段回收后，与EcoRI和
BamHI酶切处理的pK18mobsacB载体进行重组连接，获得lysC基因的突变载体pK18‑lysC。
发明人首先通过突变天冬氨酸激酶(第311位Thr突变为Ile)构建一株具有一定赖氨酸合成
能力的菌株。根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别设计引物lysC‑F1/R1
和lysC‑F2/R2，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得用于lysC突变的上游和下游
同源臂片段(其中lysC基因的第932位碱基C突变为T)。上述PCR片段回收后，与EcoRI和
BamHI酶切处理的pK18mobsacB载体进行重组连接，获得lysC基因的突变载体pK18‑lysC。
[0108] 实施例2.谷氨酸棒杆菌lysC基因突变菌株构建
[0109] 制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞，将上述构建的pK18‑lysC质粒转化该菌株，涂布含有25ug/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基(酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠
5g/L，脑心浸液18.5g/L，山梨醇91g/L)上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确转化子
转接含有5g/L葡萄糖的LB培养基过夜培养，然后转接含有100g/L蔗糖的LB培养基，30℃培
养6h后涂布添加100g/L蔗糖的LB培养基进行筛选，获得lysC突变的菌株SCgL30。
5g/L，脑心浸液18.5g/L，山梨醇91g/L)上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确转化子
转接含有5g/L葡萄糖的LB培养基过夜培养，然后转接含有100g/L蔗糖的LB培养基，30℃培
养6h后涂布添加100g/L蔗糖的LB培养基进行筛选，获得lysC突变的菌株SCgL30。
[0110] 实施例3.谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO:1所示多肽编码基因敲除载体构建
[0111] 根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别设计引物SEQ ID NO:1‑F1/R1和SEQ ID NO:1‑F2/R2，以ATCC13032基因组为模板通过PCR扩增获得SEQ ID NO:1所
示多肽基因的上下游同源臂。上述PCR片段回收后，与EcoRI和BamHI酶切处理的
pK18mobsacB载体进行重组连接，获得SEQ ID NO:1所示多肽基因的突变载体pK18‑SEQ ID
NO:1。
示多肽基因的上下游同源臂。上述PCR片段回收后，与EcoRI和BamHI酶切处理的
pK18mobsacB载体进行重组连接，获得SEQ ID NO:1所示多肽基因的突变载体pK18‑SEQ ID
NO:1。
[0112] 实施例4.谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO:1所示多肽缺失菌株构建
[0113] 制备SCgL30菌株的感受态细胞，将上述构建的pK18‑SEQ ID NO:1质粒转化该菌株，涂布含有5g/L葡萄糖和25ug/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基上，30℃培养获得第一次
重组的转化子。正确转化子转接含有5g/L葡萄糖的LB培养基过夜培养，然后转接含有100g/
L蔗糖的LB培养基，30℃培养6h后涂布添加100g/L蔗糖的LB培养基进行筛选，获得SEQ ID
NO:1所示多肽缺失的菌株SCgL31。
重组的转化子。正确转化子转接含有5g/L葡萄糖的LB培养基过夜培养，然后转接含有100g/
L蔗糖的LB培养基，30℃培养6h后涂布添加100g/L蔗糖的LB培养基进行筛选，获得SEQ ID
NO:1所示多肽缺失的菌株SCgL31。
[0114] 实施例5.SEQ ID NO:1所示多肽缺失对谷氨酸棒杆菌赖氨酸合成的影响
[0115] 为了测试谷氨酸棒杆菌中SEQ ID NO:1所示多肽基因敲除对菌株产赖氨酸的影响，分别对SCgL30和SCgL31进行发酵测试，发酵培养基为CGXII培养基，主要成份为(g/L)：
(NH4)2SO4，20；尿素，5；KH2PO4，1；K2HPO4·3H2O，1.3；3‑(N‑吗啉基)丙磺酸(MOPS)，42；CaCl2，
0.01；FeSO4·7H2O，0.01、MnSO4·H2O，0.01、ZnSO4·7H2O，0.001；CuSO4，0.0002；NiCl·
6H2O，0.00002；MgSO4·7H2O，0.25；原儿茶酸，0.03；维生素B1，0.0001；生物素，0.0002；葡萄
糖，80。首先将菌株接种到含有10g/L葡萄糖的LB培养基中过夜培养，培养物作为种子接种
到每孔含有600μl发酵培养基的24孔板中，初始OD控制为0.5，30度培养29h，孔板摇床转速
为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测赖氨酸产量和葡萄糖消耗量。结果如表1所
示，SEQ ID NO:1所示多肽敲除后Lys产量及葡萄糖转化率均显著提升。
(NH4)2SO4，20；尿素，5；KH2PO4，1；K2HPO4·3H2O，1.3；3‑(N‑吗啉基)丙磺酸(MOPS)，42；CaCl2，
0.01；FeSO4·7H2O，0.01、MnSO4·H2O，0.01、ZnSO4·7H2O，0.001；CuSO4，0.0002；NiCl·
6H2O，0.00002；MgSO4·7H2O，0.25；原儿茶酸，0.03；维生素B1，0.0001；生物素，0.0002；葡萄
糖，80。首先将菌株接种到含有10g/L葡萄糖的LB培养基中过夜培养，培养物作为种子接种
到每孔含有600μl发酵培养基的24孔板中，初始OD控制为0.5，30度培养29h，孔板摇床转速
为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测赖氨酸产量和葡萄糖消耗量。结果如表1所
示，SEQ ID NO:1所示多肽敲除后Lys产量及葡萄糖转化率均显著提升。
[0116] 表1.
[0117]
[0118] 实施例6.基于dCas9的SEQ ID NO:1所示多肽弱化菌株构建
[0119] 首先将pCas9(LIU,Jiao,et al.Development of a CRISPR/Cas9 genome editing toolbox for Corynebacterium glutamicum.Microbial cell factories,2017,
16.1:205)质粒的Cas9基因进行D10A和H840A突变，同时将质粒骨架中的BsaI酶切位点去
除，获得pdCas9质粒；再从pnCas9(D10A)‑AID‑gRNA‑ccdBTS(WANG,Yu,et al.Expanding
targeting scope,editing window,and base transition capability of base editing
in Corynebacterium glutamicum.Biotechnology and bioengineering,2019，116：3016‑
3029)质粒上扩增gRNA‑ccdB表达盒克隆至pdCas9的相同位置，获得可以高效构建的
CRISPRi质粒pdCas9gRNA‑ccdB。
16.1:205)质粒的Cas9基因进行D10A和H840A突变，同时将质粒骨架中的BsaI酶切位点去
除，获得pdCas9质粒；再从pnCas9(D10A)‑AID‑gRNA‑ccdBTS(WANG,Yu,et al.Expanding
targeting scope,editing window,and base transition capability of base editing
in Corynebacterium glutamicum.Biotechnology and bioengineering,2019，116：3016‑
3029)质粒上扩增gRNA‑ccdB表达盒克隆至pdCas9的相同位置，获得可以高效构建的
CRISPRi质粒pdCas9gRNA‑ccdB。
[0120] 利用上述基于dCas9的弱化系统，构建SEQ ID NO:1所示多肽的弱化载体及其对照载体。根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别设计引物dCas‑F/R，两条引
物通过变性和退火程序，获得互补区片段。上述片段与BsaI酶切处理的pdCas9‑ccdB质粒通
过Goldengate连接，构建获得带有SEQ ID NO:1所示多肽gRNA的弱化载体pdCas‑SEQ ID
NO:1。根据pdCas9gRNA‑ccdB序列设计引物Cas‑1、Cas‑2、Cas‑3和Cas‑4，通过PCR扩增获得
两个质粒片段，通过Vazyme重组酶重组获得gRNA不含任何互补区的对照载体pdCas9。将上
述重组载体pdCas‑SEQ ID NO:1和pdCas9分别转化SCgL30菌株，获得SEQ ID NO:1所示多肽
的弱化菌株SCgL30/pdCas‑SEQ ID NO:1及其对照菌株SCgL30/pdCas9。
物通过变性和退火程序，获得互补区片段。上述片段与BsaI酶切处理的pdCas9‑ccdB质粒通
过Goldengate连接，构建获得带有SEQ ID NO:1所示多肽gRNA的弱化载体pdCas‑SEQ ID
NO:1。根据pdCas9gRNA‑ccdB序列设计引物Cas‑1、Cas‑2、Cas‑3和Cas‑4，通过PCR扩增获得
两个质粒片段，通过Vazyme重组酶重组获得gRNA不含任何互补区的对照载体pdCas9。将上
述重组载体pdCas‑SEQ ID NO:1和pdCas9分别转化SCgL30菌株，获得SEQ ID NO:1所示多肽
的弱化菌株SCgL30/pdCas‑SEQ ID NO:1及其对照菌株SCgL30/pdCas9。
[0121] 实施例7.SEQ ID NO:1所示多肽弱化对谷氨酸棒杆菌赖氨酸合成的影响
[0122] 为了测试谷氨酸棒杆菌中SEQ ID NO:1所示多肽基因表达弱化对菌株产赖氨酸的影响，分别对SCgL30/pdCas9和SCgL30/pdCas‑SEQ ID NO:1进行发酵测试，发酵培养基成份
为(g/L)：葡萄糖，80；酵母粉8；尿素，9；K2HPO4，1.5；MnSO4，0.01；MgSO4，0.6；FeSO4，0.01；
MOPS，42。首先将菌株接种到含有10g/L葡萄糖的LB培养基中过夜培养，培养物作为种子接
种到每孔含有600μl发酵培养基的24孔板中，初始OD控制为0.5，30度培养29h，孔板摇床转
速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测赖氨酸产量和葡萄糖消耗量。结果如表2所
示，SEQ ID NO:1所示多肽弱化后，Lys产量及葡萄糖转化率均显著提升。RT‑PCR检测结果显
示SCgL30/pdCas‑SEQ ID NO:1菌株中SEQ ID NO:1所示多肽的转录水平与对照菌株相比下
降31％。
为(g/L)：葡萄糖，80；酵母粉8；尿素，9；K2HPO4，1.5；MnSO4，0.01；MgSO4，0.6；FeSO4，0.01；
MOPS，42。首先将菌株接种到含有10g/L葡萄糖的LB培养基中过夜培养，培养物作为种子接
种到每孔含有600μl发酵培养基的24孔板中，初始OD控制为0.5，30度培养29h，孔板摇床转
速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测赖氨酸产量和葡萄糖消耗量。结果如表2所
示，SEQ ID NO:1所示多肽弱化后，Lys产量及葡萄糖转化率均显著提升。RT‑PCR检测结果显
示SCgL30/pdCas‑SEQ ID NO:1菌株中SEQ ID NO:1所示多肽的转录水平与对照菌株相比下
降31％。
[0123] 表2.
[0124]
[0125] 本发明实施例中所用的引物见下表：
[0126]
[0127]
[0128] 实施例8.SEQ ID NO:1所示多肽在不同谷氨酸棒杆菌中同源性的比较
[0129] 利用NCBI数据库对SEQ ID NO:1所示多肽进行序列比对分析，结果显示该蛋白多肽在不同谷氨酸棒杆菌中DNA和氨基酸序列的一致性分别达到98.01％和98.56％以上，表
明该蛋白多肽在谷氨酸棒杆菌中的保守性非常高。此外，通过序列分析发现该蛋白的C末端
含有一个FhuF(大肠杆菌细胞质中的一种含有2Fe‑2S的铁还原酶)的C‑末端结构域，且该结
构域在上述谷氨酸棒杆菌的同源序列中均存在。因此，虽然SEQ ID NO:1所示多肽的功能未
知，但可以预测其在不同谷氨酸棒杆菌中具有相同的功能。基于以上分析，推测在不同谷氨
酸棒杆菌中上述同源基因的缺失或弱化都有利于赖氨酸的合成。
明该蛋白多肽在谷氨酸棒杆菌中的保守性非常高。此外，通过序列分析发现该蛋白的C末端
含有一个FhuF(大肠杆菌细胞质中的一种含有2Fe‑2S的铁还原酶)的C‑末端结构域，且该结
构域在上述谷氨酸棒杆菌的同源序列中均存在。因此，虽然SEQ ID NO:1所示多肽的功能未
知，但可以预测其在不同谷氨酸棒杆菌中具有相同的功能。基于以上分析，推测在不同谷氨
酸棒杆菌中上述同源基因的缺失或弱化都有利于赖氨酸的合成。
[0130] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。