一种杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组序列的获取方法及其应用转让专利
申请号 : CN202110127728.0
文献号 : CN112877354B
文献日 : 2022-07-08
发明人 : 赵嘉平 , 苏晓华 , 张冰玉 , 张一南 , 李敏 , 李金鑫 , 王黎 , 申宛娜
申请人 : 中国林业科学研究院林业新技术研究所 , 中国林业科学研究院林业研究所
摘要 :
本发明提供一种导致杨树花叶病毒的菜豆普通花叶病毒基因组序列及其应用，本发明采用RT‑PCR方法在接种绿豆叶片中获得菜豆普通花叶病毒基因组近全长序列，并采用菜豆普通花叶病毒特异性引物实现病毒的鉴定和检测,并提供了菜豆普通花叶病毒caf株系特异性鉴定引物，实现了病毒的快速识别和鉴定。
权利要求 :
1.一种杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组片段，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID No.1 所示。
2.根据权利要求1 所述的一种杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组片段，其特征在于：所述基因序列扩增后的多聚蛋白包括BCMV‑gp1多聚蛋白和BCMV‑gp2多聚蛋白，所述BCMV‑gp1多聚蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述BCMV‑gp2多聚蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种如权利要求1所述的杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组片段在VIGS载体以及基因沉默的应用。
4.一种如权利要求1所述的杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组片段的获取方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）对菜豆普通花叶病毒的总RNA 的提取和纯化，mRNA建库及转录组测序；
（2）对菜豆普通花叶病毒的基因组片段采用多个转录组测序数据整合后无参组装及Blast分析；
（3）对菜豆普通花叶病毒的基因组近全长序列的调取，采用的菜豆普通花叶病毒的基因组片段的RT‑PCR扩增，将组装获得序列拼接为单一序列；
（4）所述序列构建完成后对菜豆普通花叶病毒的特异性PCR检验。
5.根据权利要求4 所述的杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组片段的获取方法，其特征在于：所述RT‑PCR扩增上游引物为：5’GCAAATACAGGATTAGGAGA 3’下游引物为5’CCACTTAAATCATTAGCTGC 3’。
6.根据权利要求4 所述的杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组片段的获取方法，其特征在于：所述特异性PCR检验的检验引物分别为：上游引物为5’ATCGAAGTGGATGGAATTTA3’，下游引物为5’AGAATTTCCTGATCTCTTGG 3’。
说明书 :
一种杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组序列的获取方法
及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组序列的获取方法及其应用
背景技术
[0002] 杨树是重要的工业用材林、生态绿化树种，我国已发现杨树病毒害3种，分别由杨树花叶病毒(Poplar mosaic virus，PMV)，烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)以及黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)引起。研究发现BCMV病毒基因组较小，仅为约 10000碱基，编码1个多聚蛋白并可加工成为包括解旋酶、HC‑Pro、衣壳蛋白等在内的10个功能蛋白，由于其可以自然侵染杨树，因此可以作为一个新的杨树‑病毒互作体系进行病毒生物学的研究。
[0003] 大量研究证明植物病毒原侵染可以诱导寄主植物体内的免疫防御反应，在寄主植物防御体系的作用下，病毒RNA分子被降解为小 RNA分子，即病毒来源的小RNA(virus‑derived small RNA,VsiRNA)。 VsiRNA特异性结合并降解寄主植物靶基因mRNA，引发RNA干扰(RNA interference，RNAi)，并在植物体内引起特定的表型改变。基于以上原理，可以通过对病毒RNA的改造，将外源基因引入寄主植物体内，并沉默其作用靶基因的表达，从而实现外源基因功能的鉴定。通过以上病毒介导的外源基因表达沉默途径(VIGS)研究外源基因功能，可以在短时间内向寄主植物种导入不同的基因，更重要的是，避免了难以从转化物种中获得再生植株的缺点，极大加快实验的进度。
[0004] 已经有少数病毒被开发成为适合木本植物的VIGS载体，如苹果潜伏球形病毒(ALSV)、葡萄藤卷叶相关病毒‑2(Glrav2)、以及烟草脆裂病毒(TRV)。其中基于TRV的VIGS载体克服了寄主范围和分生组织排斥的限制，可以应用于番茄、树种、油桐和白杨。然而，TRV介导的VIGS载体在杨树中诱导效果较弱；基于杨树花叶病毒PMV的基因沉默载体能够沉默烟草基因的表达，但是该载体并没有广泛应用于杨树基因功能研究。因此，需要继续探索木本植物特别是杨树的有效基因沉默VIGS载体。由于BCMV病毒系统感染新疆杨植株并引起典型花叶病害的特点，具有开发为新的杨树VIGS载体的潜力。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种来源于菜豆普通花叶病毒caf株系的近全长基因组序列，及其编码的多聚蛋白的氨基酸序列，本发明为了开发适用于杨树功能基因研究的VIGS基因沉默载体，提供了一种导致杨树花叶病毒的菜豆普通花叶病毒基因组序列、鉴定及其应用，利用本发明所述的RNA提取、建库、转录组测序及无参病毒基因组组装、RT‑PCR扩增方法，获得菜豆普通花叶病毒基因组近全长序列，提供菜豆普通花叶病毒鉴定引物序列。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明所包括如下：
[0008] (1)对菜豆普通花叶病毒的总RNA的提取和纯化，mRNA建库及转录组测序；
[0009] (2)对菜豆普通花叶病毒的基因组序列采用多个转录组测序数据整合后无参组装及Blast分析；
[0010] (3)对菜豆普通花叶病毒的基因组近全长序列的调取，采用的菜豆普通花叶病毒的基因组序列的RT‑PCR扩增，将组装获得序列拼接为单一序列；
[0011] (4)所述序列构建完成后对菜豆普通花叶病毒的特异性PCR检验。
[0012] 进一步地，所述RT‑PCR扩增上游引物为：5’ GCAAATACAGGATTAGGAGA 3’[0013] 下游引物为5’CCACTTAAATCATTAGCTGC 3’
[0014] 进一步地，所述特异性PCR检验的检验引物分别为：
[0015] 上游引物为5’ATCGAAGTGGATGGAATTTA3’，
[0016] 下游引物为5’AGAATTTCCTGATCTCTTGG 3’。
[0017] 一种杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组序列在VIGS载体以及基因沉默的应用。
[0018] 一种杨树花叶病毒VIGS载体的中间体基因组序列，所述基因序列如SEQ ID No.1所示。
[0019] 进一步地，所述基因组序列的RT‑PCR扩增引物序列如SEQ ID No.2所示。
[0020] 进一步地，所述氨基酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
[0021] 进一步地，所述基因组序列的PCR序列引物序列如SEQ ID No.5 所示。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0023] 本发明提供了一种核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的菜豆普通花叶病毒近全长基因组序列，是从感染菜豆花叶病毒的新疆杨以及接种绿豆发病叶片中分离得到的,利用本发明提供的新疆杨叶片总RNA提取、转录组建库及转录组测序方法，测序数据无参组装菜豆普通花叶病毒基因组序列，采用RT‑PCR方法在接种绿豆叶片中获得菜豆普通花叶病毒基因组近全长序列，并采用菜豆普通花叶病毒特异性引物实现病毒的鉴定和检测。并提供了菜豆普通花叶病毒caf株系特异性鉴定引物，实现了病毒的快速识别和鉴定。
[0024] 本发明获得菜豆普通花叶病毒caf株系的全长基因组，为基于菜豆普通花叶病毒的VIGS转化体系奠定了基础，可促进杨树以及其他木本植物基因的功能鉴定及遗传转化研究。
附图说明
[0025] 图1BCMV基因的RT‑PCR扩增；
[0026] 图2杨树花叶病毒BCMV基因组组装、扩增、拼接及编码蛋白质位置示意图；
[0027] 图3菜豆普通花叶病毒检测的特异性扩增条带。
具体实施方式
[0028] 本发明提供了一种来源于菜豆普通花叶病毒caf(BCMV‑caf)杨树株系的近全长基因组序列，所述BCMV‑caf基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述BCMV‑caf的近全长基因组分离自感染花叶病毒的新疆杨中，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列全长序列9546bp。
[0029] 在本发明中，本发明所述BCMV‑caf基因组序列通过新疆杨叶片转录组测序数据组装得到2个长片段序列，然后采用RT‑PCR扩增，扩增产物测序后和上述2个长片段拼接得到。RT‑PCR扩增上游引物核酸序列为：5’GCAAATACAGGATTAGGAGA 3’，下游引物的核酸序列为：
5’CCACTTAAATCATTAGCTGC 3’，扩增产物长度为649nt。扩增序列如SEQ ID NO.2所示。
5’CCACTTAAATCATTAGCTGC 3’，扩增产物长度为649nt。扩增序列如SEQ ID NO.2所示。
[0030] 在本发明中，利用上述引物对扩增所述BCMV‑caf基因组的PCR 扩增程序优选为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s， 72℃延伸45s，循环数为35；最后72℃延伸
7min。在本发明中，利用上述引物对扩增所述BCMV‑caf基因组的PCR扩增体系优选为：cDNA
2.5μL，10×Buffer 5.0μL，10μmol/L上下游引物各1.25μ L，dNTP mix(10mM each)1.5μL，
25mM MgCl24.5μL，5u.μ L‑1Taq酶0.75μL，终体积为50.0μL。
7min。在本发明中，利用上述引物对扩增所述BCMV‑caf基因组的PCR扩增体系优选为：cDNA
2.5μL，10×Buffer 5.0μL，10μmol/L上下游引物各1.25μ L，dNTP mix(10mM each)1.5μL，
25mM MgCl24.5μL，5u.μ L‑1Taq酶0.75μL，终体积为50.0μL。
[0031] 本发明还提供了2种上述技术方案所述BCMV‑caf基因编码的多聚蛋白，所述BCMV‑gp1多聚蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列共3100个氨基酸残基；所述 BCMV‑gp2多聚蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。如SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列共74个氨基酸残基。
[0032] 本发明还提供了一种可以应用于BCMV病毒鉴定及检疫的特异性引物，其编码区段位于BCMV基因组编码的NIb protein基因(在基因组上位置为8088‑8253)，PCR产物序列共166个碱基。上游引物核酸序列为：5’ATCGAAGTGGATGGAATTTA 3’,下游引物的核酸序列为：
5’AGAATTTCCTGATCTCTTGG 3’。
5’AGAATTTCCTGATCTCTTGG 3’。
[0033] 在本发明中，利用上述引物对扩增所述BCMV‑caf基因组的PCR 扩增程序优选为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s， 72℃延伸30s，循环数为35；最后72℃延伸
7min。反应体系：cDNA 2.5 μL，10×Buffer 5.0μL，10μmol/L上下游引物各1.25μL，dNTP mix(10mM each)1.5μL，25mM MgCl24.5μL，5u.μL‑1Taq酶 0.75μL，终体积为30.0μL。扩增序列如SEQ ID NO.5所示。
7min。反应体系：cDNA 2.5 μL，10×Buffer 5.0μL，10μmol/L上下游引物各1.25μL，dNTP mix(10mM each)1.5μL，25mM MgCl24.5μL，5u.μL‑1Taq酶 0.75μL，终体积为30.0μL。扩增序列如SEQ ID NO.5所示。
[0034] 本发明还提供了前述技术方案所述菜豆普通花叶病毒caf (BCMV‑caf)基因组、前述技术方案所述菜豆普通花叶病毒caf (BCMV‑caf)蛋白或上述技术方案所述特异性检测引物在菜豆普通花叶病毒所致杨树花叶病毒生物学研究中的基础作用，及开发杨树VIGS 沉默表达载体中的应用。
[0035] 在本发明中，优选的利用前述技术方案所述菜豆普通花叶病毒 caf(BCMV‑caf)基因组序列涉及特异性引物，可以应用于菜豆普通花叶病毒的检测以及菜豆普通花叶病毒所致杨树花叶病毒的检验检疫，从而控制病害的传播。在本发明中，所述检验检疫的对象可以是杨树以及其他菜豆普通花叶病毒的潜在侵染寄主植物。
[0036] 在本发明中，优选的利用前述技术方案所述菜豆普通花叶病毒 caf(BCMV‑caf)基因组构建VIGS沉默表达载体并转基因植株，使与外源基因同源的杨树功能基因沉默，可以应用于杨树基因功能的鉴定及遗传转化。在本发明中，所述基因沉默及遗传转化的品种可以是杨树。
[0037] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0038] 实施例1
[0039] 1从杨树高通量转录组测序组装获取病毒基因组序列：
[0040] 1.1总RNA的提取和纯化：
[0041] 采集出现典型花叶病毒症状的新疆杨叶片新鲜材料6份，分别为发病约15天和30天样品。所有6份样品使用改良的CTAB方法提取杨树总 RNA。
[0042] 1.2杨树叶片mRNA建库及高通量转录组序列测定及测序数据处理
[0043] 采用Oligo(dT)磁珠，从步骤1.1所述总RNA中提取mRNA；利用 Promega公司的M‑MLV反转录酶，采用随机六碱基引物将mRNA反转录成第一链互补链DNA(cDNA)，在合成cDNA第二链。按照制造商的建议，采用Illumina(美国)试剂盒建立转录组测序文库。然后采用 Illumina 2000测序平台进行双端测序。从测序原始数据去除包含的接头序列、低质量序列以及包含poly‑N的reads数据，获得Clean data。
[0044] 1.3病毒基因组序列的无参组装、Blast检索获得病毒基因组序列
[0045] 以步骤1.2所得6份Clean data数据，利用基因组组装软件Trinity v2.0.6从感病的杨树叶片中组装杨树及病毒转录本。采用Perl脚本提取最长的转录本(unigenes)，再将unigenes在NCBI病毒基因组数据库(GenBank Virus RefSeq)中进行BLASTN搜索。
[0046] 2近全长病毒基因组序列的获得
[0047] 2.1菜豆花叶病毒基因组核苷酸序列的无参组装
[0048] 从步骤1.2的6个不同转录组数据组装获得25个菜豆花叶病毒BCMV 的部分序列，在MEGA软件中进行拼接，获得两个长片段菜豆花叶病毒序列，其长度分别为2089碱基和7553碱基。与BCMV病毒参考基因组序列NC_003397.1比较，发现两个长序列之间存在6碱基的未知序列。
[0049] 2.2菜豆花叶病毒基因组的RT‑PCR扩增
[0050] 采集具有典型花叶病症状的新疆杨毒叶片，叶片用干净刀片切碎，在0.01M PBS溶液中侵泡15分钟，过滤后摩擦接种2个月的绿豆幼苗。温室内培养观察花叶病症状的形成，并采集病叶，采用1.1所述方法提取绿豆叶片总RNA。
[0051] 根据步骤2.1所得2个菜豆花叶病毒基因组片段(2089碱基和7553 碱基)，设计引物(上游引物：5’GCAAATACAGGATTAGGAGA 3’，下游引物：5’CCACTTAAATCATTAGCTGC 3’)以扩增两个片段之间的未知序列。PRT‑PCR产物长度649nt，PCR产物琼脂糖电泳如图1所示。PCR 产物采用Sanger直接双端测序，PCR测序序列引物同PCR扩增引物。测序获得的PCR产物如SEQ ID No.2所示。反应体系和反应程序如下所示：
[0052] 反应体系：cDNA 2.5μL，10×Buffer 5.0μL，10μmol/L上下游引物各1.25μL，dNTP mix(10mM each)1.5μL，25mM MgCl2 4.5μL，5u.μL‑1Taq酶0.75μL，终体积为50.0μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，循环数为35；最后72℃延伸7min。
[0053] 2.3菜豆花叶病毒基因组核苷酸序列的拼接
[0054] 步骤2.1所得2个菜豆花叶病毒基因组长片段，步骤2.2所得RT‑PCR 扩增片段序列，在MEGA软件中进行比对、拼接，获得菜豆花叶病毒基因组近全长序列，长度为9546nt。序列如SEQ ID No.1所示。
[0055] 2.4菜豆花叶病毒完整基因组编码蛋白氨基酸序列的获取
[0056] 将步骤2.3所得菜豆花叶病毒caf株系基因组近全长序列(9546nt， SEQ ID No.1)与其亲缘关系最近的菜豆花叶病毒菌株的基因组序列 (NCBI登录号NC_003397.1)注释信息相比较，同时参考采用BLAST 软件软件的多聚蛋白预测结果，确定菜豆花叶病毒caf株系基因组序列编码两个多聚蛋白：BCMVgp1和BCMVgp2。BCMVgp1多聚蛋白编码3100 个氨基酸残基，包括P1蛋白部分序列，HC‑Pro蛋白、P3蛋白、6K1蛋白、CI蛋白、6K2蛋白、NIa‑VPg蛋白、NIa‑Pro蛋白、NIb蛋白和衣壳蛋白全序列。BCMVgp1多聚蛋白编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示， P1蛋白等10个蛋白在基因组上的位置如图2所示。BCMVgp1多聚蛋白编码PIPO蛋白，长度为74个氨基酸残基，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其在BCMV基因组上的位置如图2所示。本发明所涉及BCMV 病毒基因组核苷酸序列覆盖参考BCMV基因组序列NC_003397.1的 95.5％长度，与NC_003397.1序列的核苷酸水平相似性为84.4％，与 NC_
003397.1序列的编码氨基酸水平相似性为76.6％。
003397.1序列的编码氨基酸水平相似性为76.6％。
[0057] 本发明所涉及BCMV病毒基因组核苷酸序列的5端序列的变异较大，如本发明所涉及BCMV病毒编码P1蛋白的核苷酸序列与NC_003397.1相应序列相似性为82.3％，氨基酸编码水平相似性为72.8％。
[0058] 3菜豆普通花叶病毒caf株系的特异性检验
[0059] 根据上述步骤所得菜豆花叶病毒caf株系基因组全长序列及各编码蛋白位置信息，与NCBI病毒基因组数据库(GenBank Virus RefSeq) 中马铃薯Y病毒属代表性菌株的对应核苷酸序列，在NCBI‑primer设计特异性扩增引物。上游引物序列为5’ATCGAAGTGGATGGAATTTA；下游引物序列为5’AGAATTTCCTGATCTCTTGG。以如下所述反应体系和反应程序，对步骤2.2所得总RNA进行RT‑PCR扩增。反应体系：cDNA 2.5μ L，10×Buffer
5.0μL，10μmol/L上下游引物各1.25μL，dNTP mix(10mM each)1.5μL，25mM MgCl24.5μL，5u.μL‑1Taq酶 0.75μL，终体积为30.0μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火
30s，72℃延伸30s，循环数为35；最后72℃延伸7min。扩增得到166bp的PCR片段，琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。显示可以进行BCMV基因的特异性检测。
5.0μL，10μmol/L上下游引物各1.25μL，dNTP mix(10mM each)1.5μL，25mM MgCl24.5μL，5u.μL‑1Taq酶 0.75μL，终体积为30.0μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火
30s，72℃延伸30s，循环数为35；最后72℃延伸7min。扩增得到166bp的PCR片段，琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。显示可以进行BCMV基因的特异性检测。
[0060] 该病害基因组的症状特征导致病叶变色、焦黑、提前脱落，严重影响叶片生长并引发小枝枯死。经基因序列分析及电镜观察，鉴定为马铃薯Y病毒属(Potyvirus属)菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus，BCMV)，本发明采用RT‑PCR方法在接种绿豆叶片中获得菜豆普通花叶病毒基因组近全长序列，并采用菜豆普通花叶病毒特异性引物实现病毒的鉴定和检测。并提供了菜豆普通花叶病毒caf 株系特异性鉴定引物，实现了病毒的快速识别和鉴定。征，通过对菜豆普通花叶病毒基因组的操作开发形成适合于杨树的基因沉默表达载体，在木本植物特别是杨树的基因功能验证方面将具有广泛的应用前景。
[0061] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。