一种lncRNA在诊断和治疗口腔鳞癌中的应用

摘要

本发明公开了一种lncRNA在诊断和治疗口腔鳞癌中的应用，所述lncRNA为IGF2BP2‑AS1。在本发明的具体实施例中，通过对口腔鳞癌组织和癌旁组织样本进行检测，发现IGF2BP2‑AS1在口腔鳞癌组织中显著高表达。本发明同时公开了一种筛选口腔鳞癌的候选药物的方法。

权利要求

1.检测lncRNA的表达水平的试剂在制备诊断口腔鳞癌或预测口腔鳞癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述的lncRNA为IGF2BP2‑AS1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括通过PCR、原位杂交、或高通量测序平台检测IGF2BP2‑AS1的表达水平的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括探针、或引物。

4.根据权利要求 3所述的应用，其特征在于，所述的引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用所述的产品检测受试者样本中的IGF2BP2‑AS1的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的IGF2BP2‑AS1的表达水平上调，则诊断该受试者为口腔鳞癌患者或口腔鳞癌预后不良。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的样本为组织。

7.根据权利要求1‑6任一项所述的应用，其特征在于，所述的产品为芯片、或试剂盒。

8.IGF2BP2‑AS1功能性表达的抑制剂在制备治疗口腔鳞癌的药物组合物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂为siRNA。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的siRNA的序列如SEQ ID NO.5所示。

11.一种筛选治疗口腔鳞癌的候选药物的方法，其特征在于，所述的方法包括：(1) 用待测试物质处理表达或含有IGF2BP2‑AS1的体系；

(2) 检测所述体系中IGF2BP2‑AS1的表达；

(3) 选择可降低IGF2BP2‑AS1表达水平的测试物质为候选药物。

说明书

一种lncRNA在诊断和治疗口腔鳞癌中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种生物标志物，具体涉及一种LncRNA在诊断和治疗口腔鳞癌中的应用。

背景技术

[0002] 口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)，简称口腔鳞癌，是口腔颌面部发生率最高的恶性肿瘤，在口腔恶性疾病中，其比例高达90％左右。口腔鳞癌可出现
在口腔的不同部位，大多临近重要的组织器官，如颅脑、上呼吸道、颈部重要的神经血管，使
手术的范围受到严重的制约，而且由于头颈颌面组织血管、淋巴管丰富以及舌的频繁机械
运动，常发生早期颈淋巴结转移，预后较差，严重威胁着人们的生命健康。随着肿瘤综合治
疗的发展，口腔鳞癌的治疗取得了一定的进步，但是近年来，患者的5年生存率没有明显改
善。目前临床上对口腔鳞癌的治疗方法包括手术治疗、术前或术后放化疗等，但仅仅这些治
疗方法还远远不能满足患者生存的需要，有一部分患者即使经过手术和辅助放化疗，但依
然存在术后复发和转移的可能，严重影响患者的总体生存时间。这是因为现有病理诊断技
术不能准确判断口腔鳞癌生物学特性，缺乏特异性、高效性的针对口腔鳞癌的治疗药物和
方案。

[0003] 生物标志物是疾病进程期间细胞的生理状态和变化的提示因子，在准确、敏感地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可用于癌症的早期诊断、预测预后以及临床
治疗。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，尽管lncRNA不编码蛋白质，但它们
可以通过改变染色质构象、mRNA转录、转录后RNA拼接、蛋白降解和运输参与疾病的发生和
发展。有研究发现，lncRNA可以调节癌细胞的生长、增殖、侵袭、转移和血管生成等，可以作
为致癌基因或肿瘤抑制因子通过直接或间接的方式调节癌症相关信号通路，影响肿瘤的发
展。对于口腔鳞癌，找到具有准确诊断、预测预后和临床治疗能力的lncRNA具有重要意义。

发明内容

[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与口腔鳞癌相关的生物标志物，从而为口腔鳞癌的诊断和治疗提供一种分子手段。

[0005] 本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

[0006] 本发明第一方面提供了一种诊断口腔鳞癌或预测口腔鳞癌预后的产品，所述的产品包括检测IGF2BP2‑AS1的表达水平的试剂。

[0007] 所述的“IGF2BP2‑AS1”，是指位于3号染色体，Gene ID为646600的基因。

[0008] 本文所用的术语“预后”是指对临床病症或疾病的可能的过程和结果的预测。患者的预后通常通过评价象征有利的或不利的疾病过程或结果的因素或症状确定。术语“预后”
并非是指能够100％准确地预测病症的过程或结果。相反，本领域技术人员能够理解，术语
“预后”是指特定的过程或结果将会发生的概率增加；也就是说，与不表现病症的个体相比，
该过程或结果更可能在表现出给定病症的患者体内发生。预后可以表示为预期患者可以存
活的时间量。或者，预后可以是指疾病缓解的可能性或疾病有望保持缓解的时间量。预后可
以以不同的方式表示；例如预后可以表示为病人在一年后、五年后、十年后等存活的百分比
概率。任选地，预后可以表示为患者由于病症或疾病可预期存活的平均月份数。患者的预后
可被认为是相对性的表现，有许多因素影响最终的结果。例如，对于特定病症的患者，预后
可以适当地表示为病症可治疗或可治愈的可能性、或疾病将缓解的可能性，而患有更严重
病症的患者的预后可更适当地表示为存活特定时间的可能性。

[0009] 进一步，所述的产品包括通过PCR、原位杂交、或高通量测序平台检测IGF2BP2‑AS1的表达水平的试剂。

[0010] 高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的不断发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，
容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知IGF2BP2‑AS1基因的异
常与口腔鳞癌的发生或预后相关也属于使用了本发明的IGF2BP2‑AS1的新用途，同样在本
发明的保护范围之内。

[0011] 进一步，所述的试剂包括探针、或引物。

[0012] 进一步，所述的引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示。

[0013] 在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为
“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全
序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，
包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

[0014] 术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(base pair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然
生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模
板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例
子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

[0015] 本发明第二方面提供了lncRNA在制备诊断口腔鳞癌或预测口腔鳞癌预后的产品中的应用，所述的lncRNA为IGF2BP2‑AS1。

[0016] 进一步，利用所述的产品检测受试者样本中的IGF2BP2‑AS1的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的IGF2BP2‑AS1的表达水平上调，则诊断该受试者为口腔鳞癌患者或口
腔鳞癌预后不良。

[0017] 术语中使用的术语“受试者”意指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动
物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；
以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。

[0018] 在优选的实施方式中，所述的受试者为人。

[0019] 术语“样本”与“样品”在本文中可以互换使用，用于本文时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来
表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣
的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限
于，组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血
小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，
尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液，组织提取物如匀浆化
的组织，肿瘤组织，细胞提取物及其组合。

[0020] 作为优选的实施方式，所述的样本选自组织。

[0021] 当在实验室环境中处理样本时，可能获得最可靠的结果。例如，可在医生办公室中从受试者获取样本，然后将其发送到医院或商业医学实验室进行进一步测试。然而，在许多
情况下，可能希望在临床医生的办公室提供即时结果或允许受试者在家中进行测试。在一
些情况下，对于便携式、预包装、一次性的、可由受试者在无协助或指导等的情况下即可使
用等等的测试的需求比高度准确度更为重要。在许多情况下，尤其是在有医师随访的情况
下，进行初步测试，甚至灵敏度和/或特异度降低的测试也可能就足够了。因此，以产品形式
提供的测定可涉及检测和测量相对少量的lncRNA，以降低测定的复杂性和成本。

[0022] 进一步，所述的产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述的芯片包括基因芯片；所述的试剂盒包括基因检测试剂盒。所述的基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷
酸探针，所述的寡核苷酸探针包括用于检测基因表达水平的针对IGF2BP2‑AS1基因的寡核
苷酸探针；所述的基因检测试剂盒包括用于检测IGF2BP2‑AS1基因表达水平的引物或芯片。

[0023] 本发明第三方面提供了一种治疗口腔鳞癌的药物组合物，所述的药物组合物包括IGF2BP2‑AS1功能性表达的抑制剂。所述的抑制剂选自：以IGF2BP2‑AS1或其转录本为靶序
列、且能够抑制IGF2BP2‑AS1基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小
干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、
dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

[0024] 本发明中术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症为目的对患者进行的医学管理。该术语包括积极疗法，即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的
的治疗，并且还包括病因治疗，即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗。
此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治
疗；预防性治疗，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展
为目的的治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目
的的特定疗法的治疗。

[0025] 进一步，所述的抑制剂为siRNA。

[0026] 进一步，所述的siRNA的序列如SEQ ID NO.5所示。

[0027] 本发明的siRNA可以包括部分纯化的RNA、相当纯的RNA、合成的RNA、或重组产生的RNA、以及通过添加、删除、替换和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的经
改变了的RNA。这样的改变可以包括添加非核苷酸材料至例如siRNA的末端(一个或多个)或
至siRNA的一个或多个内部核苷酸，包括使siRNA抵抗核酸酶消化的修饰。

[0028] 本发明第四方面提供了IGF2BP2‑AS1在制备治疗口腔鳞癌的药物组合物中的应用，所述的药物组合物还可以包括有效量的用于口腔鳞癌治疗的药物及药学上可接受的载
体和/或辅料。

[0029] 本文中使用的术语“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物
的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学
上有效量取决于几个因素，包括但不限于治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和
用药史)、罹患疾病的严重程度。

[0030] 所述的药物组合物与用于口腔鳞癌治疗的药物可以制备成单独的制剂联合应用，也可将两者制备成一种制剂以组合物的形式应用。

[0031] 所述的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域技术人员已知的治疗惰性的无机
或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基
化合物(例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油)，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿
润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液，诸如
此类的也可加入其中。

[0032] 适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's Pharmaceutical Sciences中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或
它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使
用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如
此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行
给药，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人。

[0033] 本发明的所述的药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而
可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有
效的给药剂量。

[0034] 进一步，所述的药物组合物包括IGF2BP2‑AS1功能性表达的抑制剂。所述的抑制剂选自：以IGF2BP2‑AS1或其转录本为靶序列、且能够抑制IGF2BP2‑AS1基因表达或基因转录
的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能
表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

[0035] 进一步，所述的抑制剂为siRNA。

[0036] 进一步，所述的siRNA的序列如SEQ ID NO.5所示。

[0037] 本发明第五方面提供了一种筛选治疗口腔鳞癌的候选药物的方法，所述的方法包括：

[0038] (1)用待测试物质处理表达或含有IGF2BP2‑AS1的体系；

[0039] (2)检测所述体系中IGF2BP2‑AS1的表达；

[0040] (3)选择可降低IGF2BP2‑AS1表达水平的测试物质为候选药物。

[0041] 进一步，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选药物进行进一步测试其抑制口腔鳞癌的效果，若测试物质对口腔鳞癌有显著的抑制效果，则说明该物质为预防或治疗
口腔鳞癌的候选物质。

[0042] 进一步，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选为非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)。

[0043] 进一步，当将通过本发明的筛选方法筛选出的候选药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，候选药物
可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法将其配制成各种剂型。例如，根据需要，
所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可
接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将候选药物
以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型、与药学可接受的载体或介质混合在一起，所
述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定
剂、调味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有效成分的含量，可以获得
在指定范围内的合适的给药量。

[0044] 本发明的优点和有益效果如下：

[0045] 本发明提供了一种口腔鳞癌的生物标志物，所述的生物标志物为IGF2BP2‑AS1。

[0046] 本发明所述的IGF2BP2‑AS1可以应用到诊断口腔鳞癌或预测口腔鳞癌预后中。

[0047] 本发明还提供了IGF2BP2‑AS1在治疗口腔鳞癌中的应用。

附图说明

[0048] 图1是数据集中IGF2BP2‑AS1的差异表达图及生存曲线图，其中，图(a)是IGF2BP2‑AS1在数据集的OSCC组织样本和正常组织样本中差异表达图，图(b)是IGF2BP2‑AS1的生存
曲线。

[0049] 图2是样本中IGF2BP2‑AS1的差异表达图和IGF2BP2‑AS1在细胞中的定位图，其中，其中，图(a)是RT‑qPCR验证IGF2BP2‑AS1的差异表达的实验结果图，图(b)是FISH检测
IGF2BP2‑AS1在细胞中的定位实验结果图。

[0050] 图3是采用细胞集落形成法测定细胞增殖实验结果图。

[0051] 图4是细胞划痕实验结果图。

[0052] 图5是Transwell实验结果图。

[0053] 图6是流式细胞术检测IGF2BP2‑AS1基因表达下调后OSCC细胞周期分布实验结果图。

[0054] 图7是流式细胞术检测IGF2BP2‑AS1基因表达下调后OSCC细胞凋亡实验结果图。

[0055] 图8是Western Blot分析OSCC细胞中Bax，Cyclin D1，MMP2和β‑catenin的表达实验结果图。

具体实施方式

[0056] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可
以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限
定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条
件实施检测。

[0057] 实验材料

[0058] 1、试剂：

[0059] TRIzol试剂、HiFi‑Script cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司；ECL化学发光检测试剂盒购自美国Proteintech公司；转染试
剂Lipofectamine 2000购自美国英杰生命技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期
检测试剂盒购自长春祈健生物制品有限公司；RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司；
BCA蛋白定量试剂盒购自陕西普罗安蒂生物科技发展有限公司。

[0060] 2、细胞株：OSCC细胞株(Cal27、Tca8113)来源于中国科学院细胞库。

[0061] 3、抗体：cyclin D1鼠源抗体、β‑actin鼠源抗体、β‑catenin兔源抗体、Bax兔源抗体购自美国Proteintech公司；MMP2兔源抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司；抗兔IgG、
抗鼠IgG购自美国Affinity Biosciences公司。

[0062] 4、仪器：

[0063] Amersham Imager 600化学发光成像系统购自美国GE Healthcare公司。

[0064] 实施例1与口腔鳞癌相关的生物标志物

[0065] 从TCGA数据库下载包含372个样本(包括339个OSCC患者组织样本和33个正常组织样本)的数据集，使用edgeR软件包分析IGF2BP2‑AS1的差异表达情况。基于IGF2BP2AS1的表
达量，以最佳临界值将患者分为两组，并使用Kaplan‑Meier方法构建生存曲线。p值<0.05被
认为具有统计学意义。

[0066] 结果：如图1(a)所示，与正常组织相比，OSCC患者组织中IGF2BP2‑AS1的表达量显著增高。此外，如图1(b)所示，IGC2BP2‑AS1表达量与OSCC患者的生存呈负相关(P＝0.031)。
该实验结果提示IGF2BP2‑AS1可用于OSCC诊断，且与OSCC患者的不良预后相关。

[0067] 实施例2 IGF2BP2‑AS1在OSCC组织和细胞中的表达。

[0068] 1、样本获取

[0069] 从山东省立医院收集30个OSCC组织和20个癌旁组织(距原发肿瘤5cm以上)，切下的样本均在‑80℃速冻，且经过病理学诊断证实。上述所有样本的取得均通过山东省立医院
伦理委员会的同意。

[0070] 2、mRNA提取和RT‑qPCR

[0071] 首先采用TRIzol试剂提取样品的总RNA，然后采用HiFi‑Script cDNA第一链合成试剂盒进行RNA逆转录获得cDNA，最后采用UltraSYBR Mixture预混体系进行qPCR扩增，其
中具体引物序列如下：

[0072] IGF2BP2‑AS1：

[0073] 正向引物为5'‑ATGGTGGTGCATGGAGGAAG‑3'(SEQ ID NO.1)；

[0074] 反向引物为5'‑CTCTTCAGCAAAGCAGACTTC‑3'(SEQ ID NO.2)。

[0075] β‑actin：

[0076] 正向引物为5'‑AGACCTGTACGCCAACACAG‑3'(SEQ ID NO.3)；

[0077] 反向引物为5'‑CGGACTCGTCATACTCCTGC‑3'(SEQ ID NO.4)。

[0078] 3、统计学分析

[0079] 采用统计学软件Graphpad Prism 8.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。采用Student's t检验比较两组之间的值和百分比差异，以P<0.05为差异
具有统计学意义。

[0080] 4、采用FISH技术检测IGF2BP2‑AS1在OSCC细胞(Cal27、Tca8113)中的定位。

[0081] 5、结果

[0082] (1)如图2(a)所示，与癌旁组织相比，OSCC组织中IGF2BP2‑AS1表达量显著增加，差异具有统计学意义(*P<0.05)。

[0083] (2)如图2(b)所示，IGF2BP2‑AS1主要定位在OSCC细胞的细胞质中。

[0084] 实施例3 IGF2BP2‑AS1的沉默检验和功能验证

[0085] 1、细胞培养

[0086] 在5％CO2、37℃恒温的培养箱中培养细胞(Cal27、Tca8113)，培养基为含有10％FBS的DMEM培养基。

[0087] 2、细胞转染

[0088] 由北京Oligobio有限公司(中国北京)合成针对IGF2BP2‑AS1的siRNA，其序列如下：

[0089] si‑IGF2BP2‑AS1为GGTCATGCCTGGTTAACAT(SEQ ID NO.5)。

[0090] 作为对照的siRNA的序列如下：

[0091] si‑NC为TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO.6)。

[0092] 使用Lipofectamine 2000试剂盒进行转染，具体操作按照说明书进行。

[0093] 3、细胞集落形成实验

[0094] 将细胞(Cal27、Tca8113)接种到35mm直径的培养皿中(1000细胞/孔)，培养14天。用4％多聚甲醛溶液固定细胞15min，0.1％结晶紫染色10min。最后，在显微镜下计数细胞集
落，每个细胞集落由至少50个细胞组成。

[0095] 4、细胞划痕实验

[0096] 将细胞(Cal27、Tca8113)接种到6孔板中培养24小时，转染si‑IGF2BP2‑AS1或si‑NC后，使用10μL移液器吸头在细胞层划横线；使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗细胞，加入
无血清培养基，将细胞置于培养箱培养48小时，分别于0、48小时取样，在倒置显微镜下拍
照，使用ImageJ软件测量划痕闭合面积。

[0097] 5、Transwell实验

[0098] 将转染24h后的细胞(Cal27、Tca8113)用胰蛋白酶消化，取6×104个细胞接种在Transwell小室上室中的100μL无血清培养基中，下室加入含30％FBS的培养基，继续于培养
箱内培养48h；除去上表面残留的细胞，将迁移至膜下侧的细胞用PBS冲洗，用4％多聚甲醛
溶液固定15min，然后用0.1％结晶紫染色10min。最后，在显微镜下进行细胞计数。

[0099] 6、流式细胞术检测细胞周期分布

[0100] 细胞(Cal27、Tca8113)转染72h后，采用细胞凋亡检测试剂盒，结合流式细胞术检测细胞凋亡。采用细胞周期检测试剂盒分析细胞周期。具体操作按照说明书进行。

[0101] 7、蛋白质印迹分析(Western Blot)

[0102] 使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞(Cal27、Tca8113)释放出蛋白，使用BCA蛋白质定量试剂盒对蛋白质浓度进行定量。通过十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)分
离总蛋白样品(20μg/泳道)，然后转印到PVDF膜上。将膜置于5％脱脂乳室温封闭2h，分别加
入cyclin D1鼠抗(1：5,000稀释)，β‑actin抗体(1：5000稀释)，β‑catenin兔抗(1：5000稀
释)，Bax抗体(1：2000稀释)和MMP2抗体(1：1000稀释)，4℃孵育过夜。用含0.05％Tween‑20
(TBST)的tris缓冲液洗涤膜3次后，向膜中加入二抗抗兔IgG(1：5000稀释)或抗鼠IgG(1：
5000稀释)，室温静置1h，用TBST缓冲液洗涤3次。采用ECL化学发光检测试剂盒进行底物检
测，然后使用Amersham Imager 600化学发光成像系统进行分析，最后采用Image J软件对
目标蛋白的条带进行定量。

[0103] 8、统计学分析

[0104] 采用统计学软件Graphpad Prism 8.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。采用Student's t检验比较两组之间的值和百分比差异，以P<0.05为差异
具有统计学意义。

[0105] 9、结果：

[0106] (1)如图3所示，IGF2BP2‑AS1表达下调导致细胞集落数显著减少(*P<0.05)，该数据表明下调IGF2BP2‑AS1的表达可以抑制OSCC细胞增殖。

[0107] (2)细胞划痕实验结果表明，与转染si‑NC的对照组相比，转染si‑IGF2BP2‑AS1的实验组OSCC细胞的迁移作用显著减弱(如图4所示)，差异具有统计学意义*P<0.05。

[0108] (3)Transwell实验结果显示，下调IGF2BP2‑AS1的表达后，实验组中迁移细胞数量明显减少(如图5所示)，差异具有统计学意义(*P<0.05)。

[0109] (4)流式细胞术检测细胞周期分布实验结果显示，与转染si‑NC组和对照组相比，IGF2BP2‑AS1基因表达下调后通过阻滞G2/M期延缓细胞周期进展(如图6所示)。

[0110] (5)流式细胞术检测细胞凋亡实验结果显示，转染IGF2BP2‑AS1 siRNA组的细胞凋亡率明显高于转染si‑NC的对照组和未转染siRNA的对照组(如图7所示)。该数据表明，
IGF2BP2‑AS1的表达下调可能会增加OSCC细胞凋亡。

[0111] (6)Western Blot实验结果显示，与对照组相比，IGF2BP2‑AS1表达下调的细胞中β‑catenin、Cyclin D1和MMP2蛋白表达水平较低，而bax蛋白水平较高，β‑actin为内参(如
图8所示)。

[0112] 上述实验结果证明，IGF2BP2‑AS1通过Wnt/β‑catenin通路调控OSCC细胞的增殖、凋亡和迁移，提示IGF2BP2‑AS1可以应用于OSCC治疗。

[0113] 以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简
单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。

[0114] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可
能的组合方式不再另行说明。

[0115] 此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。