一种小单孢菌TMD166及其应用转让专利
申请号 : CN202110227667.5
文献号 : CN112899199B
文献日 : 2022-02-15
发明人 : 孙承航 , 蒋忠科 , 刘佳萌 , 邬刚 , 刘少伟 , 游雪甫 , 蒙建州
申请人 : 中国医学科学院医药生物技术研究所
摘要 :
本发明涉及微生物学和药学领域，公开了一种小单孢菌TMD166及其应用，更具体地，公开了一种小单孢菌TMD166及其产生的新型硫肽类抗生素的制备方法和应用。本发明的小单孢菌(Micromonospora sp.)TMD166，其保藏编号为CGMCC NO.21622。本发明的小单孢菌(Micromonospora sp.)的发酵液中包含一种新型硫肽类抗生素—玄奘米星(Xuanzangmicin)，该化合物具有很好的抗细菌活性，作为一个新的人或畜抗感染药物有着较好的应用前景。
权利要求 :
1.小单孢菌（Micromonosporasp.）TMD166，其特征在于，所述小单孢菌（Micromonospora sp.）的保藏编号为CGMCC NO. 21622。
2.权利要求1所述的小单孢菌（Micromonosporasp.）TMD166的发酵产物。
3.根据权利要求2所述的发酵产物，其特征在于，包含玄奘米星，所述玄奘米星的化学结构式如下所示：
。
4.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的小单孢菌（Micromonosporasp.）TMD166或权利要求2或3所述的发酵产物。
5.权利要求1所述的小单孢菌（Micromonosporasp.）TMD166或权利要求2或3所述的发酵产物或权利要求4所述的菌剂在制备抗细菌产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为葡萄球菌、肠球菌或分枝杆菌。
8.权利要求1所述的小单孢菌（Micromonosporasp.）TMD166在制备玄奘米星中的应用，所述玄奘米星如权利要求3所述。
9.一种玄奘米星的制备方法，其特征在于，所述玄奘米星如权利要求3中所述，所述制备方法包括：发酵培养权利要求1所述的小单孢菌（Micromonosporasp.）TMD166，收获发酵液；然后从发酵液中提取、分离所述玄奘米星。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养包括：将权利要求1所述的小单孢菌（Micromonosporasp.）TMD166接种于种子培养基上培养，然后转入发酵培养基震荡培养；
其中，在种子培养基上培养的条件为28‑30℃，150‑200r/min，培养时间48‑72h；在发酵培养基上培养的条件为28‑30℃，150‑200r/min，培养时间96‑120h；
所述种子培养基和发酵培养基的配方相同，具体为：葡萄糖4 g，酵母粉4g，麦芽浸粉
5g，ZnSO4.7H2O 0.001 g，MnCl2.4H2O 0.001g，FeSO4.7H2O 0.002 g，苯丙氨酸0.001 g，丙氨酸0.0003 g，维生素B1 0.001 g, 维生素B2 0.001 g, 维生素B6 0.001 g，烟酸0.001 g，生物素0.001 g，无菌蒸馏水1.0L；所述种子培养基和发酵培养基的pH为8.5。
说明书 :
一种小单孢菌TMD166及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物学和药学领域，具体地说，涉及一种小单孢菌TMD166及其产生的新型硫肽类抗生素的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 以“ESKAPE”(肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠道杆菌属)和结核分枝杆菌为代表的病原菌及其抗生素耐药菌，包括多重药物耐药
或泛耐药菌，严重威胁着人畜的健康。目前，随着这些病原菌对治疗用抗菌药物的耐药，有
效可用的抗生素逐渐减少，因此，发现结构新颖，作用机制独特的抗生素，特别是发现针对
“ESKAPE”和结核分枝杆菌的耐药菌有效的新型化合物分子是目前抗感染药物研发的重点。
或泛耐药菌，严重威胁着人畜的健康。目前，随着这些病原菌对治疗用抗菌药物的耐药，有
效可用的抗生素逐渐减少，因此，发现结构新颖，作用机制独特的抗生素，特别是发现针对
“ESKAPE”和结核分枝杆菌的耐药菌有效的新型化合物分子是目前抗感染药物研发的重点。
[0003] 硫肽类抗生素是含多个噻唑环，由微生物产生的结构复杂的多肽类次级代谢产物。第一个硫肽类抗生素是发现于1948年的微球菌素(micrococcin)，迄今为止，已有上百
种该类抗生素被报道。该类抗生素具有一个特征性的氮六元杂环，根据氮六元杂环氧化程
度及取代方式的差异，可以将硫肽类抗生素分为五类：哌啶类，脱氢哌啶类，二氢咪唑哌啶
类，三取代吡啶类，羟化吡啶类。硫肽类抗生素活性多样，包括抗菌、抗肿瘤、抗疟疾、免疫抑
制活性等，其中对革兰氏阳性菌具有很强的抗菌活性，已引起了学术界和制药工业界的广
泛关注。除硫链丝菌素和那西肽曾经作为动物饲料添加剂外，一些硫肽类抗生素的衍生物
已进入临床研究阶段，如GE2270A类似物LFF571作为治疗由艰难梭菌(Clostridioides
difficile)引起的肠道感染药物，完成了临床II期试验。另一个GE2270A衍生物NA1003对痤
疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)有窄谱抗菌活性，作为治疗痤疮新药也已完成临
床II期研究。尽管硫肽类抗生素抗菌活性主要是通过细菌核糖体阻止细菌蛋白质的合成，
但不同类型的硫肽类抗生素作用的靶点不同，发现新结构硫肽类抗生素极有可能开发出新
颖的治疗药物，应对人畜相关的感染和细菌耐药性问题。
种该类抗生素被报道。该类抗生素具有一个特征性的氮六元杂环，根据氮六元杂环氧化程
度及取代方式的差异，可以将硫肽类抗生素分为五类：哌啶类，脱氢哌啶类，二氢咪唑哌啶
类，三取代吡啶类，羟化吡啶类。硫肽类抗生素活性多样，包括抗菌、抗肿瘤、抗疟疾、免疫抑
制活性等，其中对革兰氏阳性菌具有很强的抗菌活性，已引起了学术界和制药工业界的广
泛关注。除硫链丝菌素和那西肽曾经作为动物饲料添加剂外，一些硫肽类抗生素的衍生物
已进入临床研究阶段，如GE2270A类似物LFF571作为治疗由艰难梭菌(Clostridioides
difficile)引起的肠道感染药物，完成了临床II期试验。另一个GE2270A衍生物NA1003对痤
疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)有窄谱抗菌活性，作为治疗痤疮新药也已完成临
床II期研究。尽管硫肽类抗生素抗菌活性主要是通过细菌核糖体阻止细菌蛋白质的合成，
但不同类型的硫肽类抗生素作用的靶点不同，发现新结构硫肽类抗生素极有可能开发出新
颖的治疗药物，应对人畜相关的感染和细菌耐药性问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种能生产新的抗生素的小单孢菌属菌株及其应用。
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
[0006] 本发明的小单孢菌(Micromonospora sp.)是从新疆塔克拉玛干沙漠植物骆驼刺中分离得到的一株具有强抗菌活性的内生放线菌:小单孢菌属菌株TMD166，其于2021年1月
13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝
阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其分类命名为小单孢菌
(Micromonospora sp.)，保藏编号为CGMCC No.21622。
13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝
阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其分类命名为小单孢菌
(Micromonospora sp.)，保藏编号为CGMCC No.21622。
[0007] 所述小单孢菌TMD166的获得方法为：本发明提供的所述小单孢菌属菌株TMD166是从严格表面消毒的沙漠植物骆驼刺的茎中分离出来的。经表面消毒的骆驼刺，用消毒过的
粉碎机打碎，撒在分离培养基上，培养后分离，获得纯化菌株。
粉碎机打碎，撒在分离培养基上，培养后分离，获得纯化菌株。
[0008] 进一步地，本发明提供所述小单孢菌(Micromonospora sp.)TMD166的发酵产物。
[0009] 所述发酵产物包含玄奘米星(Xuanzangmicin)，所述玄奘米星的化学结构式如式一所示：
[0010]
[0011] 本发明通过液体发酵，改变培养基组分等方式，对小单孢菌TMD166的活性次级代谢产物进行了研究，应用多种色谱分离技术，从中分离得到一个具有强抗菌活性的化合物，
1 13 1 1 1 1 1
并根据UV、IR、HR‑ESI‑MS、H‑NMR、C‑NMR、DEPT数据测试和H‑ H相关谱(H‑ H COSY)、H‑
13 1 13
C相关谱(HSQC)、反向检测远程H‑ C异核多键相关谱(HMBC)，二维NOE谱(NOESY)，旋转坐
标系NOE谱(ROESY)，同核化学位移全相关谱(TOCSY)的分析确定了其结构。该化合物具有硫
肽类抗生素的核心骨架：多个噻唑环和具有特征的氮六元杂环，羟化吡啶；此外，这是首次
发现在吡啶环的羟基上连有一个二甲氧取代的吡喃糖；也是首次发现含有四个糖基侧链的
硫肽类抗生素。进一步通过最低抑菌浓度(MIC)(按照NCCLS即美国临床实验室标准化委员
会推荐的微量肉汤稀释法)测定了其抗菌活性。实验结果表明，玄奘米星具有细菌抑制活
性：对革兰氏阳性菌如葡萄球菌(耐β‑内酰胺抗生素的菌株)，肠球菌(耐万古霉素的菌株)
有强体外抗菌活性，MIC值在0.125‑0.5μg/ml范围内，以上结果表明玄奘米星具有较广谱的
抗革兰氏阳性菌活性；此外，玄奘米星对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)显示出中等强度的
抑制活性，MIC值为16μg/ml。本发明为研制抗细菌类药物提供了新的资源和新药候选物。
1 13 1 1 1 1 1
并根据UV、IR、HR‑ESI‑MS、H‑NMR、C‑NMR、DEPT数据测试和H‑ H相关谱(H‑ H COSY)、H‑
13 1 13
C相关谱(HSQC)、反向检测远程H‑ C异核多键相关谱(HMBC)，二维NOE谱(NOESY)，旋转坐
标系NOE谱(ROESY)，同核化学位移全相关谱(TOCSY)的分析确定了其结构。该化合物具有硫
肽类抗生素的核心骨架：多个噻唑环和具有特征的氮六元杂环，羟化吡啶；此外，这是首次
发现在吡啶环的羟基上连有一个二甲氧取代的吡喃糖；也是首次发现含有四个糖基侧链的
硫肽类抗生素。进一步通过最低抑菌浓度(MIC)(按照NCCLS即美国临床实验室标准化委员
会推荐的微量肉汤稀释法)测定了其抗菌活性。实验结果表明，玄奘米星具有细菌抑制活
性：对革兰氏阳性菌如葡萄球菌(耐β‑内酰胺抗生素的菌株)，肠球菌(耐万古霉素的菌株)
有强体外抗菌活性，MIC值在0.125‑0.5μg/ml范围内，以上结果表明玄奘米星具有较广谱的
抗革兰氏阳性菌活性；此外，玄奘米星对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)显示出中等强度的
抑制活性，MIC值为16μg/ml。本发明为研制抗细菌类药物提供了新的资源和新药候选物。
[0012] 本发明提供一种菌剂，其含有所述的小单孢菌(Micromonospora sp.)TMD166或所述的发酵产物。
[0013] 优选地，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
[0014] 本发明式一化合物还包括其异构体，消旋体，对映体和非对映体。
[0015] 本发明还提供一种所述的小单孢菌(Micromonospora sp.)TMD166或所述的发酵产物或所述的菌剂在在抑制细菌生长或制备抗细菌产品中的应用。
[0016] 所述细菌为革兰氏阳性菌。
[0017] 所述革兰氏阳性菌为葡萄球菌或肠球菌或分枝杆菌。
[0018] 特别地，本发明的小单孢菌(Micromonospora sp.)TMD166或发酵产物或菌剂适于耐β‑内酰胺抗生素的革兰氏阳性菌葡萄球菌、耐万古霉素的肠球菌以及结核分枝杆菌的抑
制。
制。
[0019] 本发明另提供所述小单孢菌(Micromonospora sp.)TMD166在制备玄奘米星中的应用，所述玄奘米星如上所述。
[0020] 本发明又提供一种玄奘米星的制备方法，所述玄奘米星如上所述，所述制备方法包括：发酵培养所述的小单孢菌(Micromonospora sp.)TMD166，收获发酵液；然后从发酵液
中提取、分离所述玄奘米星。
中提取、分离所述玄奘米星。
[0021] 所述发酵培养包括：将所述的小单孢菌(Micromonospora sp.)TMD166接种于种子培养基上培养，然后转入发酵培养基震荡培养；
[0022] 其中，在种子培养基上培养的条件为28‑30℃，150‑200r/min，培养时间48‑72h；在发酵培养基上培养的条件为28‑30℃，150‑200r/min，培养时间96‑120h；
[0023] 所述种子培养基和发酵培养基的配方相同(38号培养基)，具体为：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽浸粉5g，ZnSO4.7H2O 0.001g，MnCl2.4H2O 0.001g，FeSO4.7H2O 0.002g，苯丙氨酸
0.001g，丙氨酸0.0003g，维生素B1 0.001g，维生素B2 0.001g，维生素B6 0.001g，烟酸
0.001g，生物素0.001g，无菌蒸馏水1.0L；所述种子培养基和发酵培养基的pH为8.5。
0.001g，丙氨酸0.0003g，维生素B1 0.001g，维生素B2 0.001g，维生素B6 0.001g，烟酸
0.001g，生物素0.001g，无菌蒸馏水1.0L；所述种子培养基和发酵培养基的pH为8.5。
[0024] 所述提取、分离步骤包括：首先将发酵液离心，取上清液进行HP‑20大孔吸附树脂柱层析，洗脱剂为丙酮水(30％，50％，80％)，收集80％丙酮部分洗脱液，低温减压旋转浓缩
去除有机溶剂后，得粗提物。粗提物经Sephadex LH‑20凝胶柱层析，按体积收集，分离得半
纯品；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，冷冻干燥，得到纯品化合物。
去除有机溶剂后，得粗提物。粗提物经Sephadex LH‑20凝胶柱层析，按体积收集，分离得半
纯品；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，冷冻干燥，得到纯品化合物。
[0025] 具体的提取分离步骤为：发酵液经4500rpm大容量离心机离心，取上清液进行HP‑20大孔吸附树脂柱层析，弃去流出液；以两倍柱体积的无离子水洗脱，脱去盐及水溶性组
分，并弃洗脱液；以两倍柱体积的30％丙酮水洗脱液洗脱，弃洗脱液；再以两倍柱体积的
50％丙酮水洗脱液洗脱，弃洗脱液；最后以两倍柱体积的80％丙酮水洗脱液洗脱，收集此部
分洗脱液，低温减压旋蒸，去除有机溶剂后，水溶液进行冷冻干燥。上述冻干品溶于甲醇中，
进行Sephadex LH‑20凝胶柱层析，以甲醇洗脱，收集前端的淡黄色带，减压旋转蒸干，获得
半纯品；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，低温减压旋蒸除去甲醇，水溶液冷冻干燥，得到
微淡黄色粉末状的纯品化合物。
分，并弃洗脱液；以两倍柱体积的30％丙酮水洗脱液洗脱，弃洗脱液；再以两倍柱体积的
50％丙酮水洗脱液洗脱，弃洗脱液；最后以两倍柱体积的80％丙酮水洗脱液洗脱，收集此部
分洗脱液，低温减压旋蒸，去除有机溶剂后，水溶液进行冷冻干燥。上述冻干品溶于甲醇中，
进行Sephadex LH‑20凝胶柱层析，以甲醇洗脱，收集前端的淡黄色带，减压旋转蒸干，获得
半纯品；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制备，低温减压旋蒸除去甲醇，水溶液冷冻干燥，得到
微淡黄色粉末状的纯品化合物。
[0026] 作为一个优选实施方式，本发明的玄奘米星通过如下方法制得：
[0027] 玄奘米星产生菌的发酵及培养：首先是将生长于斜面的小单孢菌属菌株TMD166接种于种子培养基，在旋转摇床上培养72h，然后转入发酵培养基并在震荡摇床上培养，96h收
获发酵液；
获发酵液；
[0028] 玄奘米星的提取、分离：发酵液离心后，取上清液进行HP‑20大孔吸附树脂柱层析，以丙酮水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集80％丙酮部分洗脱液，低温减压旋蒸浓缩去除有机
溶剂后，得红褐色粗提物溶液，粗提物经冻干溶于甲醇中，进行Sephadex LH‑20凝胶柱层
析，以甲醇为洗脱剂，收集前端的淡黄色带，减压旋转蒸干；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制
备，冷冻干燥，得到微淡黄色粉末目标化合物。
溶剂后，得红褐色粗提物溶液，粗提物经冻干溶于甲醇中，进行Sephadex LH‑20凝胶柱层
析，以甲醇为洗脱剂，收集前端的淡黄色带，减压旋转蒸干；半纯品溶于甲醇，用HPLC进行制
备，冷冻干燥，得到微淡黄色粉末目标化合物。
[0029] 本发明的有益效果至少在于：
[0030] 本发明发现了一株塔克拉玛干沙漠植物来源的小单孢菌属菌株TMD166，从其次级代谢产物中，分离得到了硫肽类抗生素—玄奘米星，经紫外光谱、红外光谱、质谱及核磁共
振等波谱学数据的仔细分析，确定玄奘米星为新型硫肽类抗生素，该结构与迄今发现的所
有硫肽类抗生素不同，其母核结构羟化吡啶的羟基上连有一个二甲氧取代的吡喃糖。玄奘
米星是首次发现带有四个糖基侧链的该类抗生素。对玄奘米星进行抗菌活性评价发现，玄
奘米星对革兰氏阳性菌如葡萄球菌，粪肠球菌，屎肠球菌(包括耐β‑内酰胺抗生素和万古霉
素的菌株)等在体外具有极强抑制活性；玄奘米星对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)也显
示出中等强度的抑制活性；作为新抗感染先导化合物，具有潜在的良好开发前景。
振等波谱学数据的仔细分析，确定玄奘米星为新型硫肽类抗生素，该结构与迄今发现的所
有硫肽类抗生素不同，其母核结构羟化吡啶的羟基上连有一个二甲氧取代的吡喃糖。玄奘
米星是首次发现带有四个糖基侧链的该类抗生素。对玄奘米星进行抗菌活性评价发现，玄
奘米星对革兰氏阳性菌如葡萄球菌，粪肠球菌，屎肠球菌(包括耐β‑内酰胺抗生素和万古霉
素的菌株)等在体外具有极强抑制活性；玄奘米星对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)也显
示出中等强度的抑制活性；作为新抗感染先导化合物，具有潜在的良好开发前景。
附图说明
[0031] 图1为小单孢菌属菌株TMD166(Micromonospora sp.TMD166)的菌落形态。
[0032] 图2为小单孢菌属菌株TMD166基于16S rRNA基因序列构建的N‑J系统发育树。
[0033] 图3为玄奘米星的主要COSY、TOCSY、HMBC、NOE及ROE相关示意图。
[0034] 图4为玄奘米星的紫外光谱。
[0035] 图5为玄奘米星的红外光谱(显微镜透射法FT‑IR Microscope Transmission；扫描次数100；分辨率8.000)。
[0036] 图6为玄奘米星的高分辨质谱(HR‑ESI‑MS)。
[0037] 图7为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的1H‑NMR谱。
[0038] 图8为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的13C‑NMR谱。
[0039] 图9为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的DEPT谱。
[0040] 图10为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的1H‑1H COSY谱。
[0041] 图11为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的1HSQC谱。
[0042] 图12为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的1HMBC谱。
[0043] 图13为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的NOESY谱。
[0044] 图14为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的ROESY谱。
[0045] 图15为玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)中的TOCSY谱。
具体实施方式
[0046] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技
术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中，除HPLC制备甲醇为色谱
纯级外，加入的其它各原料如无特别说明，均为市售分析纯级。
纯级外，加入的其它各原料如无特别说明，均为市售分析纯级。
[0048] 实施例1小单孢菌菌株TMD166的分离
[0049] 将从塔克拉玛干沙漠采集的骆驼刺茎，用清水洗净，超声去除表面杂质，样品依次用1％吐温‑20浸泡1分钟，含0.4％有效氯的次氯酸钠水溶液7分钟，2.5％硫代硫酸钠浸泡9
分钟，75％乙醇浸泡2分钟，10％碳酸氢钠浸泡10分钟，每次浸泡后均用无菌水清洗3次。样
品晾干后，用粉碎机打成粉末状并均匀地撒于M‑WA培养基(甘油10g，酵母0.5g，脯氨酸
1.0g，天冬氨酸1.0g，硝酸钾0.5g，丙酮酸钠1.25g，甜菜碱1.25g，琼脂20g，无菌水1L，
pH8.0，121℃灭菌30分钟)，28℃恒温培养。同时取表面消毒之后，第三次洗涤的蒸馏水200μ
l，涂布在ISP2平板上，28℃培养2周，以检查表面消毒是否彻底。无菌条件下挑取单菌落于
ISP‑2为培养基的纯化平板上，做三区划线，纯化3次获得纯培养菌落，将此菌株命名为
TMD166。
分钟，75％乙醇浸泡2分钟，10％碳酸氢钠浸泡10分钟，每次浸泡后均用无菌水清洗3次。样
品晾干后，用粉碎机打成粉末状并均匀地撒于M‑WA培养基(甘油10g，酵母0.5g，脯氨酸
1.0g，天冬氨酸1.0g，硝酸钾0.5g，丙酮酸钠1.25g，甜菜碱1.25g，琼脂20g，无菌水1L，
pH8.0，121℃灭菌30分钟)，28℃恒温培养。同时取表面消毒之后，第三次洗涤的蒸馏水200μ
l，涂布在ISP2平板上，28℃培养2周，以检查表面消毒是否彻底。无菌条件下挑取单菌落于
ISP‑2为培养基的纯化平板上，做三区划线，纯化3次获得纯培养菌落，将此菌株命名为
TMD166。
[0050] 实施例2小单孢菌菌株TMD166的鉴定
[0051] (1)形态鉴定：
[0052] 本发明所述的小单孢菌TMD166，如图1所示。ISP‑2培养基上的菌落表明呈淡橘色，表面覆盖一层粉末状孢子，在28‑30℃培养温度下生长较迅速。
[0053] (2)分子鉴定：
[0054] 提取其基因组DNA，利用通用引物27f和1492r进行扩增分析，得到单一DNA条带。将其在GenBank数据库中，进行Blast比对，筛选相似度最高的典型菌株序列，再用MEGA5.2软
件以邻近法(Neighbor‑joining)进行聚类分析和构建系统发育树，如图2所示，TMD166与
T
Micromonospora polyrhachis NEAU‑ycm2聚在同一分支，相似度为99.48％，最终鉴定骆
驼刺内生菌TMD166为小单孢菌属菌株(Micromonospora sp.)。
件以邻近法(Neighbor‑joining)进行聚类分析和构建系统发育树，如图2所示，TMD166与
T
Micromonospora polyrhachis NEAU‑ycm2聚在同一分支，相似度为99.48％，最终鉴定骆
驼刺内生菌TMD166为小单孢菌属菌株(Micromonospora sp.)。
[0055] 实施例3小单孢菌属菌株TMD166的发酵
[0056] 将生长于斜面培养基中的小单孢菌属菌株TMD166接种于种子培养基，种子培养基为38号培养基(葡萄糖4.0g，酵母粉4.0g，麦芽浸粉5.0g，ZnSO4.7H2O 0.001g，MnCl2.4H2O
0.001g，FeSO4.7H2O 0.002g，苯丙氨酸0.001g，丙氨酸0.0003g，维生素B1 0.001g，维生素B2
0.001g，维生素B6 0.001g，烟酸0.001g，生物素0.001g，1.0L无菌蒸馏水，pH 8.5)。每500mL
摇瓶中装100mL 38号培养基，28‑30℃，180rpm旋转摇床上培养72h，然后以10％的接种量，
转入发酵培养基(同种子培养基)，每5.0L摇瓶中装1.0L发酵培养基，在28‑30℃于180rpm旋
转摇床上培养96h，收获发酵液。
0.001g，FeSO4.7H2O 0.002g，苯丙氨酸0.001g，丙氨酸0.0003g，维生素B1 0.001g，维生素B2
0.001g，维生素B6 0.001g，烟酸0.001g，生物素0.001g，1.0L无菌蒸馏水，pH 8.5)。每500mL
摇瓶中装100mL 38号培养基，28‑30℃，180rpm旋转摇床上培养72h，然后以10％的接种量，
转入发酵培养基(同种子培养基)，每5.0L摇瓶中装1.0L发酵培养基，在28‑30℃于180rpm旋
转摇床上培养96h，收获发酵液。
[0057] 实施例4玄奘米星的提取
[0058] 将实施例3所得的发酵液，离心(4500rpm，20min)后，取上清液(18L)进行HP‑20(1.5L)大孔吸附树脂柱层析，以丙酮水梯度洗脱(30％，50％，80％丙酮各3L作为洗脱剂)，
收集80％丙酮部分洗脱液，低温减压旋蒸去除有机溶剂后，得红褐色粗提物(320mg)。
收集80％丙酮部分洗脱液，低温减压旋蒸去除有机溶剂后，得红褐色粗提物(320mg)。
[0059] 实施例5玄奘米星的分离
[0060] 将实施例4所得粗提物，用8ml甲醇溶解后，上样于Sephadex LH‑20(500mL)凝胶色谱柱，以甲醇洗脱，收集前端的黄色色带，减压旋转蒸干，得到含有目标化合物的半纯品
(42mg)。半纯品溶于3.0mL甲醇，用HPLC进行制备:色谱柱为Shimadzu公司shim‑pack PREP‑
2
ODS(H)柱(20×250mm ，5μm)；流动相为80％甲醇水溶液；流速为3mL/min。收集保留时间为
45min附近的组分(紫外检测波长为230nm)，合并收集组分后，旋转蒸发除去甲醇，经过冷冻
干燥获得玄奘米星纯品，为微淡黄色粉末状的纯品化合物(20mg)。
(42mg)。半纯品溶于3.0mL甲醇，用HPLC进行制备:色谱柱为Shimadzu公司shim‑pack PREP‑
2
ODS(H)柱(20×250mm ，5μm)；流动相为80％甲醇水溶液；流速为3mL/min。收集保留时间为
45min附近的组分(紫外检测波长为230nm)，合并收集组分后，旋转蒸发除去甲醇，经过冷冻
干燥获得玄奘米星纯品，为微淡黄色粉末状的纯品化合物(20mg)。
[0061] 实施例6玄奘米星的结构鉴定
[0062] 对实施例5所得纯品进行结构鉴定，玄奘米星的理化特性见表1。根据UV光谱(图1
4)、IR光谱(图5)、HR‑ESI‑MS(图6)，以及以CDCl3+CD3OD(9：1)为溶剂的核磁共振光谱：H‑
13 1 1 1 13
NMR(图7)、C‑NMR谱(图8)、DEPT谱(图9)、H‑ H COSY相关谱(图10)、H‑ C相关谱HSQC(图
1 13
11)、反向检测远程 H‑ C异核多键相关谱HMBC(图12)，NOESY谱(图13)，ROESY谱(图14)和
TOCSY谱(图15)的分析结果，确定了玄奘米星的结构如上述式一所示。
4)、IR光谱(图5)、HR‑ESI‑MS(图6)，以及以CDCl3+CD3OD(9：1)为溶剂的核磁共振光谱：H‑
13 1 1 1 13
NMR(图7)、C‑NMR谱(图8)、DEPT谱(图9)、H‑ H COSY相关谱(图10)、H‑ C相关谱HSQC(图
1 13
11)、反向检测远程 H‑ C异核多键相关谱HMBC(图12)，NOESY谱(图13)，ROESY谱(图14)和
TOCSY谱(图15)的分析结果，确定了玄奘米星的结构如上述式一所示。
[0063] 表1玄奘米星的理化特性
[0064]
[0065]
[0066] 通过对玄奘米星的1H‑NMR、13C‑NMR、HSQC和DEPT谱综合分析可知分子中含有83个碳原子，其中31个季碳(δC:180.8，170.4，170.2，168.1，168.0，166.8，164.7，162.1，161.5，
161.4，160.8，160.4，160.1，159.7，155.0，154.3，151.7，150.4，148.4，145.9，144.7，
138.8，137.5，133.3，131.8，131.5，129.7，129.3，124.9，117.8，110.5)，32个叔碳(δC:
128.0，126.5，125.6，125.5，124.4，124.4，121.3，114.6，102.1，100.2，98.5，96.7，88.4，
83.1，81.6，81.0，80.3，80.3，77.2，75.9，70.5，70.2，69.9，69.9，69.2，68.9，56.8，66.9，
53.8，71.7，71.4，49.5)，6个仲碳(δC:104.6，66.9，64.5，40.1，38.3，29.2)，14个伯碳(δC:
60.9，60.8，59.9，59.4，59.0，57.8，57.8，55.9，17.7，17.7，17.7，17.7，17.6，13.7)。
161.4，160.8，160.4，160.1，159.7，155.0，154.3，151.7，150.4，148.4，145.9，144.7，
138.8，137.5，133.3，131.8，131.5，129.7，129.3，124.9，117.8，110.5)，32个叔碳(δC:
128.0，126.5，125.6，125.5，124.4，124.4，121.3，114.6，102.1，100.2，98.5，96.7，88.4，
83.1，81.6，81.0，80.3，80.3，77.2，75.9，70.5，70.2，69.9，69.9，69.2，68.9，56.8，66.9，
53.8，71.7，71.4，49.5)，6个仲碳(δC:104.6，66.9，64.5，40.1，38.3，29.2)，14个伯碳(δC:
60.9，60.8，59.9，59.4，59.0，57.8，57.8，55.9，17.7，17.7，17.7，17.7，17.6，13.7)。
[0067] 根据HSQC确定了与H直接相连的各个C的化学位移(见表2)。
[0068] 表2玄奘米星在CDCl3+CD3OD(9:1)的NMR数据
[0069]
[0070]
[0071]
[0072] 1H‑NMR：600MHz；13C‑NMR：150MHz。
[0073] 对氢谱，碳谱的进一步分析，可以推断玄奘米星是含有5个噻唑环的硫肽类抗生素，包括3个羰基噻唑环(Thz1，Thz2，Thz5)，1个全取代的羰基噻唑环(Thz3)，1个噻唑环
(Thz4)；1个四取代的羟化吡啶(Pyr)，1个苏氨酸(Thr)，1个甲氧基取代的脱氢苏氨酸
(Dht)，1个脱氢丙氨酸(Deala)，1个2，3，4‑三取代的吲哚环(Ind)，1个羟基谷氨酸(Glu)和
一个半胱氨酸(Cys)。
(Thz4)；1个四取代的羟化吡啶(Pyr)，1个苏氨酸(Thr)，1个甲氧基取代的脱氢苏氨酸
(Dht)，1个脱氢丙氨酸(Deala)，1个2，3，4‑三取代的吲哚环(Ind)，1个羟基谷氨酸(Glu)和
一个半胱氨酸(Cys)。
[0074] 在1H‑1HCOSY中，δ5.73(1H，d，J＝1.8Hz，S1‑1H)和δ4.12(1H，dd，J＝3.6，1.8Hz，S1‑2H)；δ4.30(1H，dd，10.2，3.6Hz，S1‑3H)和δ4.12(1H，dd，J＝3.6，1.8Hz，S1‑2H)及δ3.20(1H，
m，S1‑4H)；δ3.20(1H，m，S1‑4H)和δ3.57(1H，m，S1‑5H)；δ3.57(1H，m，S1‑5H)和δ1.32(3H，d，J
＝6.0，S1‑C5‑Me‑H)相关。在2D TOCSY中，显示S1‑1H和S1‑2H，S1‑3H；S1‑2H和S1‑1H，S1‑3H，
S1‑4H，S1‑5H，S1‑C5‑Me‑H相关。结合在HMBC中，两个甲氧基氢δ3.57(3H，s，S1‑C2‑OMe)和δ
3.52(3H，s，S1‑C4‑OMe)分别和C‑2和C‑4相关。综合这些信息可以确定S1为2，4二甲氧基取
代的吡喃鼠李糖苷。S1‑2H和S1‑1H，S1‑3H的耦合常数分别为1.8Hz和3.6Hz，S1‑3H和S1‑4H
的耦合常数为10.2Hz，表明S1‑1H和S1‑2H在吡喃环上位于平伏键方向，而S1‑3H和S1‑4H则
位于直立键方向。在NOESY和ROESY中，S1‑4H和S1‑C5‑Me‑H相关，表明S1‑5H也位于直立键方
向。从而确定糖苷S1为2，4二甲氧基取代的α‑L‑吡喃鼠李糖苷。此外，在HMBC中，S1‑1H和
Pyr‑C3相关，确定了糖苷S1和吡啶环的连接位置。
m，S1‑4H)；δ3.20(1H，m，S1‑4H)和δ3.57(1H，m，S1‑5H)；δ3.57(1H，m，S1‑5H)和δ1.32(3H，d，J
＝6.0，S1‑C5‑Me‑H)相关。在2D TOCSY中，显示S1‑1H和S1‑2H，S1‑3H；S1‑2H和S1‑1H，S1‑3H，
S1‑4H，S1‑5H，S1‑C5‑Me‑H相关。结合在HMBC中，两个甲氧基氢δ3.57(3H，s，S1‑C2‑OMe)和δ
3.52(3H，s，S1‑C4‑OMe)分别和C‑2和C‑4相关。综合这些信息可以确定S1为2，4二甲氧基取
代的吡喃鼠李糖苷。S1‑2H和S1‑1H，S1‑3H的耦合常数分别为1.8Hz和3.6Hz，S1‑3H和S1‑4H
的耦合常数为10.2Hz，表明S1‑1H和S1‑2H在吡喃环上位于平伏键方向，而S1‑3H和S1‑4H则
位于直立键方向。在NOESY和ROESY中，S1‑4H和S1‑C5‑Me‑H相关，表明S1‑5H也位于直立键方
向。从而确定糖苷S1为2，4二甲氧基取代的α‑L‑吡喃鼠李糖苷。此外，在HMBC中，S1‑1H和
Pyr‑C3相关，确定了糖苷S1和吡啶环的连接位置。
[0075] 同样综合分析1H‑1HCOSY，2D TOCSY确定了S2为2，3二甲氧基取代的吡喃鼠李糖苷，S3为2‑脱氧己糖苷，S4为2，4二甲氧基取代的吡喃鼠李糖苷(相关的COSY，TOCSY见图3)。S2‑
2H和S2‑1H，S2‑3H的耦合常数分别为1.8和3.0Hz，结合S2和philipimycin的S1的碳、氢化学
位移几乎一致，表明S2和philipimycin的S1构型相同，为2，3‑二甲氧基取代的α‑L‑吡喃鼠
李糖苷。S3‑1H和S3‑2H1、S3‑2H2的耦合常数为9.6Hz和1.8Hz，表明S3‑1H位于直立键的方向；
S3‑2H1的耦合常数为13.2、5.4、1.8Hz，表明S3‑2H1位于平伏键方向，S3‑3H位于直立键的方
向，S3‑4H的耦合常数为9.0Hz的双二重峰，说明S3‑4H和S3‑5H在吡喃环上也位于直立键方
向，从而确定糖苷S3为脱氧β‑D‑吡喃糖苷。S4‑2H的耦合常数为3.0Hz和1.8Hz，S4‑4H的耦合
常数为9.0Hz的双二重峰，表明S4‑3H、S4‑4H、S4‑5H在吡喃环上位于直立键的方向，S4‑2H位
于平伏键的方向，结合在NOESY和ROESY中，S4‑1H和S4‑4H、S4‑5H没有相关峰，确定S4为2，4
二甲氧基取代的α‑L‑吡喃鼠李糖苷。在HMBC中，S2‑1H和Thz3‑C5，S2‑4H和S3‑C1，S3‑4H和
S4‑C1相关，确定了糖苷S2和噻唑环‑5的连接位置，以及糖苷S2和S3，S3和S4的连接位置。
2H和S2‑1H，S2‑3H的耦合常数分别为1.8和3.0Hz，结合S2和philipimycin的S1的碳、氢化学
位移几乎一致，表明S2和philipimycin的S1构型相同，为2，3‑二甲氧基取代的α‑L‑吡喃鼠
李糖苷。S3‑1H和S3‑2H1、S3‑2H2的耦合常数为9.6Hz和1.8Hz，表明S3‑1H位于直立键的方向；
S3‑2H1的耦合常数为13.2、5.4、1.8Hz，表明S3‑2H1位于平伏键方向，S3‑3H位于直立键的方
向，S3‑4H的耦合常数为9.0Hz的双二重峰，说明S3‑4H和S3‑5H在吡喃环上也位于直立键方
向，从而确定糖苷S3为脱氧β‑D‑吡喃糖苷。S4‑2H的耦合常数为3.0Hz和1.8Hz，S4‑4H的耦合
常数为9.0Hz的双二重峰，表明S4‑3H、S4‑4H、S4‑5H在吡喃环上位于直立键的方向，S4‑2H位
于平伏键的方向，结合在NOESY和ROESY中，S4‑1H和S4‑4H、S4‑5H没有相关峰，确定S4为2，4
二甲氧基取代的α‑L‑吡喃鼠李糖苷。在HMBC中，S2‑1H和Thz3‑C5，S2‑4H和S3‑C1，S3‑4H和
S4‑C1相关，确定了糖苷S2和噻唑环‑5的连接位置，以及糖苷S2和S3，S3和S4的连接位置。
[0076] 实施例7玄奘米星对细菌的抗菌活性测定
[0077] 利用实施例5所得化合物进行活性测定。最低抑菌浓度(MIC)的测定按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法进行。具体实施步骤为：将玄奘米星溶
解在DMSO中，母液浓度为2.0mg/ml，用培养基溶液将药物倍半稀释。倍半稀释后，不同浓度
的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔100μl，第12
孔不加药作为生长对照。细菌的活性测定培养基使用NCCLS推荐的Mueller‑Hinton(MH)肉
8
汤，pH7.2‑7.4。直接取培养24h的菌落用生理盐水调配成0.5麦氏比浊标准(2×10CFU/ml)
的菌悬液。用MH肉汤将待测细菌菌悬液进行1:1000稀释后，每孔中加100μl，置35℃恒温培
养箱中，培养20h判断结果。结果判定：在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，
并重复三次测定。
解在DMSO中，母液浓度为2.0mg/ml，用培养基溶液将药物倍半稀释。倍半稀释后，不同浓度
的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔100μl，第12
孔不加药作为生长对照。细菌的活性测定培养基使用NCCLS推荐的Mueller‑Hinton(MH)肉
8
汤，pH7.2‑7.4。直接取培养24h的菌落用生理盐水调配成0.5麦氏比浊标准(2×10CFU/ml)
的菌悬液。用MH肉汤将待测细菌菌悬液进行1:1000稀释后，每孔中加100μl，置35℃恒温培
养箱中，培养20h判断结果。结果判定：在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，
并重复三次测定。
[0078] 玄奘米星对常见致病细菌的活性结果如表3所示。玄奘米星对革兰氏阳性菌具有强的抑制活性：包括葡萄球菌、肠球菌，MIC值在0.125‑0.5μg/ml范围内。
[0079] 表3玄奘米星的抗菌活性
[0080]
[0081] 其中，菌株Staphylococcus epidermidis 16‑5见已发表论文：Beilunmycin，a new virginiamycins antibiotic from mangrove‑derived Streptomyces sp.2BBP‑J2
and the antibacterial activity by inhibiting translation.Journal of Asian
Natural Products Research.2020，Sep 14；1‑9(https://doi.org/10.1080/
10286020.2020.1810669)；菌株Enterococcus faecium12‑1见已发表论文：Xiakemycin A，
a novel pyranonaphthoquinone antibiotic，produced by the Streptomyces sp.CC8‑
201 from the soil of a karst cave.The Journal of Antibiotics，2015，68，771–774.
and the antibacterial activity by inhibiting translation.Journal of Asian
Natural Products Research.2020，Sep 14；1‑9(https://doi.org/10.1080/
10286020.2020.1810669)；菌株Enterococcus faecium12‑1见已发表论文：Xiakemycin A，
a novel pyranonaphthoquinone antibiotic，produced by the Streptomyces sp.CC8‑
201 from the soil of a karst cave.The Journal of Antibiotics，2015，68，771–774.
[0082] 实施例8玄奘米星对结核分枝杆菌H37Rv的抗菌活性测定
[0083] 利用实施例5所得化合物进行活性测定。选取结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)培养3周的培养物，制成菌悬液，接种到米氏7H9液体培养基(Middlebrook 7H9 broth
7
medium)中，37℃静置培养2周，生长至浊度为10CFU/mL，再用米氏7H9液体培养基稀释至
OD580值为0.01，加入到96孔板，每孔100μL。化合物以DMSO溶解，制成浓度为10mg/mL的初始
液，用米氏7H9液体培养基对半稀释成浓度为0.125‑64μg/mL的溶液。再将化合物溶液加入
含有菌悬液的96孔板中，化合物终浓度为0.0625‑32μg/mL，用异烟阱(INH)为阳性对照。96
孔板于37℃孵育10天，测定OD580值，MIC值为没有菌生长的最低化合物浓度，并重复三次测
定。
7
medium)中，37℃静置培养2周，生长至浊度为10CFU/mL，再用米氏7H9液体培养基稀释至
OD580值为0.01，加入到96孔板，每孔100μL。化合物以DMSO溶解，制成浓度为10mg/mL的初始
液，用米氏7H9液体培养基对半稀释成浓度为0.125‑64μg/mL的溶液。再将化合物溶液加入
含有菌悬液的96孔板中，化合物终浓度为0.0625‑32μg/mL，用异烟阱(INH)为阳性对照。96
孔板于37℃孵育10天，测定OD580值，MIC值为没有菌生长的最低化合物浓度，并重复三次测
定。
[0084] 玄奘米星对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)显示出中等强度的抑制活性，MIC值为16μg/mL。
[0085] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因
此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。