油菜α-6微管蛋白基因在提高油菜产量中的应用

摘要

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及油菜α‑6微管蛋白基因在提高油菜产量中的应用，所述的油菜BnaTUA6基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白为SEQ ID NO:2所示，通过将该基因在拟南芥中进行过量表达，发现此转基因株系粒重和种子大小显著增加，而每角粒数无显著变化，为最终产量的提高提供保证，因此本发明在油菜等作物高产育种中有很好的应用前景。

权利要求

1.油菜α‑6微管蛋白或编码该蛋白的基因在提高拟南芥产量中的应用，所述的油菜α‑6微管蛋白为SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的基因为SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的应用中，拟南芥产量的提高是通过提高种子重量实现的。

4.根据权利要求1所述的应用，所述的应用中，拟南芥产量的提高是通过拟南芥种子粒宽的增宽和/或粒长的增长实现的。

说明书

油菜α‑6微管蛋白基因在提高油菜产量中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程领域，更具体涉及油菜α‑6微管蛋白基因在提高油菜产量中的应用。

背景技术

[0002] 在植物生活史中，种子大小是一个重要的适应性性状。种子的散布、萌发、幼苗定居以及种群的分布格局皆与种子重量(大小)有关(Zhu et al.,2012；Zhao et al.,2013)。
在植物的性状中，种子大小处于中心地位，是植物生活史的一个核心特征。而驯化作为一种
特殊的选择方式，在很多作物的栽培过程中发挥重要的作用，控制着重要农艺性状的许多
基因发生变异。种子重量(大小)是作物驯化和人工育种的目标性状之一(Harlan et al.,
1973)。

[0003] 粒重作为油菜产量的三个构成因子之一，对最终产量的形成有着重要的作用。虽然油菜产量的三个构成因子(全株角果数、每角粒数和千粒重)之间呈现不同程度的负相
关，但其相关系数往往不是很大(Gupta et al.,2006)，这意味着可以通过提高单个产量构
成因子(如千粒重)来增加最终的产量。近20年中国冬油菜区域汇总资料显示，近年来产量
的增加主要归功于粒重的增加，其次是每角粒数(祝利霞等，2010)。2000‑2009年双低油菜
产量的提高，主要归功于单株结角数和千粒重的增加(俞琦英等，2010)。2001到2010年油菜
产量增幅达11.12％，产量构成因子之一千粒重的增幅最大，达到7.10％，表明粒重的增加
是这些年产量提高的主要原因(王健胜等，2012；张芳等，2012)。上述结果皆表明近年来中
国油菜千粒重呈逐年增加趋势，并且产量的增加主要归功于千粒重的增加。多年来中国甘
蓝型油菜区试品种千粒重一般不超过4g，而在油菜种质资源中千粒重最大可稳定在7.5g左
右(Li et al.,2014)，因此粒重还具有很大的增长空间。

[0004] 油菜粒重是典型的数量性状，表型连续分布且容易受到环境条件的影响，由众多数量性状位点(quantitative trait loci，QTL)控制。随着分子标记技术的发展，利用连锁
或关联分析的方法目前已定位了一百多个油菜粒重的QTL(Bailey‑Wilson et al.,2005；
Quijada et al.,2006；Udall et al.,2006；易斌等,2006；Radoev et al.,2008；Shi et 
al.,2009；Basunanda et al.,2010a,b；Fan et al.,2010；王峰等,2010；Zhang et al.,
2011；Yang et al.,2012；朱恒星等,2012；Li et al.,2014；Qi et al.,2014)。这些粒重
QTL在甘蓝型油菜所有19个染色体上都有分布，将其中连锁标记序列信息已知的整合到基
因组物理图谱上就有134个(Zhou et al.,2014)，而且只在A7(Basunanda et al.,2010；
Fan et al.,2010；Shi et al.,2009)和A9(Li et al.,2014；Qi et al.,2014；Yang et 
al.,2012；朱恒星等,2012)染色体上检测到了少数几个主效QTL。这极有力地说明了油菜粒
重是多基因控制的数量性状，遗传基础十分复杂。

[0005] 随着功能基因组学的相继开展，通过突变体分析、图位克隆、基因表达分析和功能验证等方法在主要农作物(主要是水稻)和模式植物(拟南芥)中已克隆了数十个影响种子
重量(大小)的基因(李娜,2015)。截至目前，油菜中只有几个基因被证明和粒重有关，如Bna 
ARF18(Liu et al.,2015)，BnaCYP78A9(Shi et al.,2019)。

[0006] 申请人发现将(油菜α‑6微管蛋白基因，本发明或称为BnaTUA6基因)通过在拟南芥中过表达能显著增加粒重，目前该基因调控种子重量的功能尚未有报道。属于粒重调控新
基因，因而将其应用到作物育种中，可以提高粒重和产量。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供了油菜α‑6微管蛋白基因在提高油菜产量中的应用，所述的油菜α‑6微管蛋白为SEQ ID NO.2所示，本发明的基因可用于拟南芥和甘蓝型油菜。通过
模式植物拟南芥证实，BnaTUA6通过增加粒长、粒宽最终增加粒重。

[0008] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

[0009] 油菜BnaTUA6基因(基因序列链接：http://cbi.hzau.edu.cn/cgi‑bin/bnapus/gene？org＝ZS11&locus＝BnaC06G0043700ZS)在提高油菜产量中的应用，包括利用本领域
的常规方式，将BnaTUA6基因在植物中进行过表达，可筛选得到种子粒重或/和种子粒长或/
和粒宽提高的转基因植株，因此可用于提高植物的种子产量。

[0010] 以上所述的方案，优选的，所述的植物为甘蓝型油菜或拟南芥。

[0011] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0012] 本发明首次公开了油菜基因BnaTUA6在调控种子大小的功能中的应用。利用拟南芥为受体的转基因结果证实，BnaTUA6增加了粒重和种子大小。本发明实验结果表明
BnaTUA6基因的种子粒重与野生型受体相比均有显著的提高。因此本发明提出可利用
BnaTUA6的过量表达来增加粒重。

附图说明

[0013] 图1为BnaTUA6转拟南芥T1种子在卡那霉素抗性平皿上的筛选过程；

[0014] 箭头表示阳性植株。

[0015] 图2为BnaTUA6不同的转基因单株的分子水平阳性鉴定示意图；

[0016] 其中：BnaTUA6‑1‑1～12为BnaTUA6‑1该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定；

[0017] BnaTUA6‑2‑1～12为BnaTUA6‑2该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定；

[0018] BnaTUA6‑3‑1～12为BnaTUA6‑3该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定；

[0019] BnaTUA6‑4‑1～12为BnaTUA6‑4该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定；

[0020] BnaTUA6‑9‑1～12为BnaTUA6‑9该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定；

[0021] BnaTUA6‑10‑1～12为BnaTUA6‑10该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定；

[0022] BnaTUA6‑11‑1～12为BnaTUA6‑11该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定；

[0023] BnaTUA6‑12‑1～12为BnaTUA6‑12该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定；

[0024] BnaTUA6‑13‑1～12为BnaTUA6‑13该株系下的1～12个不同的单株PCR阳性鉴定。

[0025] 图3为各阳性转基因株系叶片中BnaTUA6的相对表达水平。

[0026] **表示在P<0.01水平差异显著。

[0027] 图4为转基因阳性株BnaTUA6‑1的种子与野生型对照种子的大小比较示意图。

[0028] 其中左图为野生型(Col)对照，右图为转基因BnaTUA6‑1株系的种子。

[0029] 图5为BnaTUA6的各转基因株系与野生型(Col)对照粒重相关表型性状。

[0030] *、**、***分别表示在P<0.05、P<0.01、P<0.005水平差异显著。

具体实施方式

[0031] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

[0032] 实施例1：

[0033] 油菜BnTUA6基因编码区的克隆：

[0034] 以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中双11号的cDNA第一链为模板对BnTUA6基因进行PCR扩增，BnTUA6正向引物：5’‑ACGGGGGACTGGTACATGAGGGAGTGCATCTCGATC‑3’，反向引
物：5’‑GCTCACCATGGGATCGTACTCCTCGCCTTCGTCATC‑3’，最终获得包含SEQ ID NO:1所示的核
苷酸序列，编码SEQ ID NO:2所示的蛋白。

[0035] 以上方案中，为了实现和载体的连接，在正向和反向引物的5’端分别加了Kpn I酶切位点(5’‑GGTACC‑3’)和BamH I酶切位点(5’‑GGATCC‑3’)和相应的保护碱基。

[0036] 实施例2：

[0037] 过表达载体的构建

[0038] 将克隆得到的油菜BnTUA6的PCR产物和质粒表达载体pCAMBIA2300S(即在pCAMBIA2300载体骨架的基础上在其多克隆位点处添加了35S启动子)均进行双酶切，其反应体
系如下：

[0039]

[0040] 37℃反应＞1小时。

[0041] 然后，双酶切质粒与PCR产物分别利用试剂盒按照说明书进行纯化回收，回收结果利用1％琼脂糖凝胶检测其浓度。

[0042] 目标基因与表达质粒载体的连接与转化，具体步骤如下：

[0043] a.配置连接反应体系(10μl)

[0044] 10×T4 DNA ligase Buffer 1μl

[0045] T4 DNA ligase 1μl

[0046] DNA片段(DNA片段的摩尔数控制在载体DNA的3‑10倍载体DNA)

[0047] ddH2O至 10μl

[0048] b.16℃培养箱反应＞12h；

[0049] c.全量加入100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置25min；

[0050] d.42℃加热90s后，冰水浴放置3min；

[0051] e.加入890μl LB液体培养基，37℃，150rpm/min振荡培养60min；

[0052] f.在含有卡那霉素(Kan，50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜；

[0053] g.挑取单菌落于划板的LB固体培养基(Kan，50mg/L)培养12小时左右，同时PCR菌落检测阳性克隆。

[0054] 实施例3：

[0055] 根癌农杆菌GV3101的转化

[0056] 质粒的提取利用质粒提取试剂盒操作参照说明书进行。利用双酶切检测目标片段是否与表达载体成功连接。

[0057] 冰融法转化农杆菌，方法步骤如下：

[0058] (1)将2μg纯化的质粒加入到100μl感受态农杆菌GV3101中，轻轻振荡混匀；

[0059] (2)冰上放置5min，立即置入液氮中，5min；

[0060] (3)37℃水浴5min；

[0061] (4)加800μl的LB培养基，在28℃的摇床上200rpm/min振荡培养1h；

[0062] (5)离心去大部分上清，沉淀，用枪轻轻吸附混匀，取下部约100μl菌液，涂于含50m g/L的Rif、Gen和Kan的LB平板上；

[0063] (6)28℃培养48小时，可见有抗性菌落长出。挑单菌落接种至2ml LB培养基(Rif、G en、Kan均50mg/L)中，28℃振荡培养过夜；

[0064] (7)PCR鉴定阳性菌落。

[0065] 实施例4：

[0066] 农杆菌介导的浸花法转化拟南芥：

[0067] 浸染液配置：5％蔗糖+0.015％表面活性剂；

[0068] YEP培养基配制：酵母提取物：10g/L，蛋白胨：10g/L，NaCl：5g/L；121℃，18min高压灭菌。

[0069] 转化具体步骤如下：

[0070] (1)挑取单菌落于10ml YEP培养基(Kan+：50mg/L，Gen+：25mg/L，Rif+：25mg/L)中，28℃，200rpm/min振荡培养8h；

[0071] (2)取(1)中500μl菌液+200ml YEP培养基(Kan：50mg/L，Gen：25mg/L，Rif：25mg/L)，于28℃，200rpm/min振荡培养至OD600＝1.5‑2.0；

[0072] (3)6000rpm/min离心(2)中的菌液10min。沉淀用转化浸染液充分悬浮，并使最终OD600在1.5‑2.0之间；

[0073] (4)转化前把开过花的角果剪掉；

[0074] (5)浸染花序，浸染30s‑1min，于黑暗中培养24h后转为正常培养。

[0075] (6)一周后再浸染花序转化一次，正常培养至开花结果，收获种子记为T0代。

[0076] 实施例5：

[0077] 筛选阳性转基因拟南芥：

[0078] 1/2MS固体培养基配置：1/2MS+24％蔗糖+0.8％琼脂(微生物培养专用)配制：

[0079] (1)称取2.215g MS(Murashing&Skoog basal mediun w/vitamins)，加纯水溶解(少量)；

[0080] (2)称取24g蔗糖，溶解，定容至1L；

[0081] (3)称取8g琼脂；

[0082] (4)调节PH为5.8；

[0083] (5)分装，高压灭菌(120℃，20min)。

[0084] 拟南芥种子消毒，具体步骤如下：

[0085] (1)75％乙醇洗1遍，3‑5min；

[0086] (2)ddH2O洗3遍；

[0087] (3)10％次氯酸钠洗一遍，3‑5min；

[0088] (4)ddH2O洗3遍；

[0089] (5)加少量的0.1％琼脂悬浮。

[0090] 抗性筛选转基因拟南芥及PCR阳性鉴定：

[0091] 将收获的T0拟南芥种子消毒后，在含有卡那霉素(50mg/L)和美罗陪南(抑菌作用25mg/L)的抗性平板上筛选，7‑10天后，未转化的拟南芥种子不生根，黄化死亡，而转化的拟
南芥幼苗能够正常生长(图1)。待开花结种后，单株系收取种子，记为T1代。将T1代拟南芥抗
性苗所结的T1种子再次进行抗性筛选，T1代种子会有不同比例的分离，将分离比接近3:1的
株系单株收取T2代种子，T2代种子抗性筛选后种植长势正常的抗性苗，T2代抗性苗的每个株
系(共挑选了9个株系，分别命名为BnaTUA6‑1、BnaTUA6‑2、BnaTUA6‑3、B naTUA6‑4、
BnaTUA6‑9、BnaTUA6‑10、BnaTUA6‑11、BnaTUA6‑12、BnaTUA6‑13)挑选12个单株，提取叶片全
基因组DNA，然后对这些植株进行PCR阳性鉴定。

[0092] 鉴定引物如下：载体反向引物：pC2300s‑R：5’–gagaaactcgagcttgcatgc‑3’目的片段正向引物TU‑VT‑F1:5’–CACAAGTTCGATCTCATGTACG‑3’扩增体系及方法如下：

[0093] 20μL反应体系如表1：

[0094] 表1阳性植株的PCR反应体系

[0095]

[0096] PCR反应程序：

[0097] 扩增反应程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃退火延伸45s(依据片段长短调整时间，约1min扩增1kb)，34个循环；72℃延伸10min，4℃保存备用。然
后对以上PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

[0098] 图2显示，卡那霉素的筛选存在一定的假阳性，需要结合PCR阳性鉴定才能准确判断阳性情况。

[0099] 实施例6：

[0100] 实时荧光定量RCR检测转化基因的表达情况：

[0101] 实施例5中转化超表达载体的9个T2代株系的所有单株经过阳性鉴定后，每个株系选取阳性单株的混合叶片进行RNA的提取并进行反转录及实时荧光定量PCR来检测该基因
的表达情况。

[0102] 拟南芥β‑actin1(at2g37620)(Rus et al.,2006)为内参基因。BnTUA6基因正向引物为5’–GTCACTTCTCCTTGAGAGGCT‑3’，反向引物为5’–CGTCTGCAGATGTCGTAGATAG‑3’。

[0103] 拟南芥叶片RNA提取、反转录cDNA第一链、荧光定量PCR均利用试剂盒参照说明书进行。其结果如图3所示，BnTUA6在某些转基因株系中强烈表达，在转基因株系BnTUA6‑1、
BnTUA6‑2、BnTUA6‑3、BnTUA6‑4的表达量分别是粒重未显著增加的株系(BnTUA6‑9、BnTUA6‑
10、BnTUA6‑11、BnTUA6‑12、BnTUA6‑13)均值(Average)的依次8、5、5、6倍。

[0104] 实施例7：

[0105] T2代转基因株系表型鉴定

[0106] 实施例6中所用的T2代拟南芥种子，千粒重性状考查使用SC‑G型考种及千粒重自动分析仪(万深)进行，1200pbi的分辨率。每个株系取五个角果，数出数量，称重，计算出千
粒重和每角粒数。

[0107] 结果如图4和图5所示：BnTUA6‑1、BnTUA6‑2、BnTUA6‑3、BnTUA6‑4的转基因株系显著的增加粒长、粒宽和粒重。此外，大部分转基因株系的每角粒数和Col相比无显著性差异
(图5)，说明粒重的增加没有以每角粒数的减少作为补偿，这个基因可通过增加粒重来提高
产量。