与鸡的皮肤颜色相关的分子标记、引物组及应用

摘要

本发明公开与鸡的皮肤颜色相关的分子标记、引物组及应用，涉及家禽遗传育种技术领域。本发明提供了一种与鸡的皮肤颜色相关的SNP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了检测所述SNP的特异性引物组和具体的检测方法，能够高效灵敏快捷的检测所述SNP序列，以鉴定皮肤颜色。本发明公开的SNP位点是独特的，具有很高的广义遗传力，能比较准确的鉴别肉鸡脱去羽毛后胸部或腿部的颜色，提高其后代鸡群皮肤颜色及胫色的一致性。

权利要求

1.一种利用分子标记快速鉴别鸡的皮肤颜色的方法，其特征在于，所述方法具体为：以待检测鸡的DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO:2‑3所示的引物组进行PCR扩增，将获得的产物进行测序，分析序列碱基，根据分析结果，鉴别鸡的皮肤颜色，其中，鸡的胸部的皮肤的红度，TC基因型大于TT基因型；

所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中该序列的第78位碱基为T/C，对应的基因型为TC和TT；

所述鸡的品种为广西灵山鸡。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性

3min；94℃变性25s，58℃退火25s，72℃延伸10s，共32个循环；72℃延伸5min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：DNA模板

100ng，2× M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 15μL，上下游引物各0.4μL，ddH2O补足至30μL。

说明书

与鸡的皮肤颜色相关的分子标记、引物组及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及家禽遗传育种技术领域，特别是涉及与鸡的皮肤颜色相关的分子标记、引物组及应用。

背景技术

[0002] 禽肉的品质与皮肤颜色有一定的关系，其色泽通常作为畜禽产品的外观指标。我国的禽肉消费市场主要以白羽和黄羽肉鸡为主，黄羽肉鸡因其良好的肉质风味受到消费者的偏好。随着生活水平的提高和行业的发展，鸡肉的生产方式逐步转向大规模养殖、集中定点屠宰，而鸡肉的消费方向也逐渐向低温肉制品转变，冷鲜整鸡、冷鲜分割鸡肉、冷冻鸡肉成为主要的鸡肉消费品。鸭肉消费品的色泽、触感、气味是消费者判别肉新鲜度的主要因素，而产品的色泽因为其最直观的感受，在贮存期间色泽变化是皮肤自身氧化还原反应、酶促反应与微生物降解共同作用的结果，往往最能影响消费者的购买欲。

[0003] 近些年来畜禽肉产品的颜色越来越成为人们关注的肉质特征，对畜禽肉色以及皮肤颜色的研究也逐渐增多。禽类皮肤颜色的呈现与皮肤中色素沉积、残余血红蛋白氧化等有关，其中色素如叶黄素、黑色素等的沉积是禽类皮肤颜色呈色的主要原因。畜禽皮肤呈现的红色以及黄色是由类胡萝卜素和叶黄素等黄色素沉积的结果，呈现的黑色是黑色素沉积的结果。除一些特别的品种如乌鸡等，家禽皮肤颜色大部分呈现的主要颜色为黄色，其呈色物质为类胡萝卜素和叶黄素。目前关于鸡的皮肤颜色的研究的实际应用仍然停留在营养调控水平，对于基因调控和分子标记相关的研究仍处在不断地探索和验证阶段。

[0004] 分子标记辅助选择(MAS)是一种常用的分子育种技术。MAS可以直接根据遗传物质的多态性进行相应的分析，如单核苷酸多态性(SNP)。分子标记辅助选择技术在其他家畜的育种中已有相当长的历史，与传统育种方法相比，MAS具有存在范围广、遗传稳定、直观准确等优点，目前并未大规模的应用于鸡的育种中。其原因一方面是对于鸡的经济性状的分子标记研究和挖掘较少，可应用于实际育种中选择重要经济性状的分子标记不足；另一方面是分子标记的检测往往成本较高，在世代间隔短、育种群体大的鸡育种中应用分子标记辅助选择技术的成本较常规育种方法更高。但随着更多低成本检测技术的发展以及分子标记的开发，分子标记辅助选择技术在鸡的育种中的应用成本显著降低。因此，进一步挖掘分子水平上与鸡重要经济性状相关的候选基因，通过对其多态性的研究并建立相关分子遗传标记，可以有效推动优质鸡的育种工作。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供与鸡的皮肤颜色相关的分子标记、引物组及应用，以解决上述现有技术存在的问题。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供与鸡的皮肤颜色相关的分子标记，分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中该序列的第78位碱基为T/C。

[0007] 本发明还提供一种根据所述的分子标记的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2‑3所示。

[0008] 本发明还提供根据所述的分子标记或所述的引物组在鸡的皮肤颜色辅助选择中的应用。

[0009] 本发明还提供根据所述的分子标记或所述的引物组在制备鸡的皮肤颜色辅助选择工具中的应用。

[0010] 进一步的，所述工具为试剂、试剂盒或芯片。

[0011] 本发明还提供一种快速鉴别鸡的皮肤颜色的方法，所述方法具体为：以待检测鸡的DNA为模板，利用所述的引物组进行PCR扩增，将获得的产物进行测序，分析序列碱基，根据分析结果，鉴别鸡的皮肤颜色。

[0012] 进一步的，采用如SEQ ID NO:1所述的分子标记鉴别鸡的皮肤颜色，则所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2‑3所示。

[0013] 进一步的，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，58℃退火25s，72℃延伸10s，共32个循环；72℃延伸5min。

[0014] 进一步的，所述PCR扩增的反应体系包括：DNA模板100ng，2X M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 15μl，上下游引物各0.4μl，ddH2O补足至30μl。

[0015] 本发明公开了以下技术效果：(1)本发明公开的SNP位点是独特的，具有很高的广义遗传力，能比较准确的鉴别肉鸡脱去羽毛后胸部或腿部的红度或黄度，提高其后代鸡群皮肤颜色及胫色的一致性；(2)本发明公开鸡皮肤颜色的鉴别方法操作简便，速度快、成本低、准确度高。

附图说明

[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0017] 图1为琼脂糖凝胶电泳结果。其中M为DL2000的Marker，自上而下分别为2000、1000、750、500、250和100bp；1、2、3、4、5、6为PCR产物；

[0018] 图2为LPIN1基因多态位点不同基因型的测序峰图。

具体实施方式

[0019] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0020] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0021] 下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0022] ab值：色差是各行各业都必须重视的问题，为了让产品颜色有更加精准的衡量标准，国际上通用的表示就是色空间。常见的颜色空间有LAB、LCH、RGB、XYZ和YXY等，目前最主流的色空间还是Lab。其中“a”代表物体的红绿色：正值表示红色，负值表示绿色。“b”代表物体的黄蓝色：正值表示黄色，负值表示蓝色。

[0023] 实施例1筛选SNP位点

[0024] 1.1用于筛选SNP位点的个体

[0025] 选择的品种以及每个品种的数量如下：广西灵山鸡12只、矮脚黄鸡12只、江丰麻黄鸡12只、智诚杏花鸡10只、隐性白羽洛克鸡10只。

[0026] 1.2候选基因的选择

[0027] 选择LPIN1基因。

[0028] 1.3基因组DNA的提取

[0029] 使用血液DNA提取试剂盒提取鸡基因组DNA，根据血液DNA提取说明书操作，提取血液样品的基因组DNA后，检测DNA样本浓度和OD值，将DNA浓度大于25ng/μl、OD260/OD280之比值在1.7‑1.8之间的样品储存于‑20℃中备用。

[0030] 1.4候选基因引物

[0031] 根据NCBI中发表的鸡候选基因组序列，利用NCBI在线引物设计工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer‑blast)设计引物扩增候选基因片段，从3’端开始扩增大小约1000bp的基因片段，具体引物如下：

[0032] 表1候选基因PCR扩增引物

[0033]

[0034] 1.5候选基因片段的PCR扩增及测序分析

[0035] PCR反应体系如下：DNA模板100ng，2X M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix15μl，上下游引物各0.4μl，ddH2O补足至30μl。

[0036] PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，58℃退火25s，72℃延伸10s，32个循环；72℃延伸5min；12℃保存。

[0037] 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判定结果：

[0038] 用含EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产品进行检测，所述电泳条件为电压100V，时间为20min，在凝胶成像系统中观察条带(约1000bp，如图1所示)，并进行回收和纯化，最后进行测序，分析序列碱基，筛查到与皮肤颜色相关的SNP位点(部分测序峰图如图2所示)。

[0039] 实施例2飞行时间质谱分析

[0040] 采用北京六合华大基因科技有限公司的飞行时间质谱分型技术在500只N409(广西灵山鸡)群体中对通过直接测序得到的与皮肤颜色相关的SNP位点进行基因分型，通过SPSS 21.0软件对SNP分型结果和颜色相关的屠宰性状结合进行关联分析，鉴定出与皮肤颜色显著相关的SNP，如下表所示。

[0041] 表2 SNP信息表

[0042]

[0043]

[0044] 注：a表示红度。

[0045] 实施例3与皮肤颜色显著相关的SNP的基因型之间的差异分析

[0046] 通过SPSS 21.0软件，对与皮肤颜色显著相关的SNP位点的不同基因型与胸a、胸b、腿a和腿b等性状的分析结果如下表3所示。

[0047] 表3 SNP基因型与皮肤颜色性状的差异分析

[0048]

[0049] 注：a表示红度，b表示黄度。基因型后括号内数字表示基因型的样本数。

[0050] 因此，可以通过LPIN1基因标记辅助选择，在肉鸡育种中不需要去除鸡的羽毛就可以选择合适皮肤颜色的肉鸡，推动优质鸡的育种工作。

[0051] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。