快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒转让专利
申请号 : CN202110278370.1
文献号 : CN112899402B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 张宇 , 庄林林 , 马明 , 吉永新 , 王建国
申请人 : 东南大学 , 徐州淮海生命科学产业研究院有限公司
摘要 :
本发明公开了快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒，所述检测试剂盒由病毒核酸等温扩增试剂和荧光免疫层析定量检测试纸条、运行缓冲液组成。病毒核酸等温扩增试剂包括反应缓冲液、新型冠状病毒ORF1ab（RdRP）、N基因特异性扩增引物和质控品。本发明的病毒核酸等温扩增反应完成后加入运行缓冲液，混匀滴加到试纸条加样窗口，2分钟后检测荧光信号。本方法可在1小时内完成。本发明新型冠状病毒检测方法操作简便、安全，灵敏度高、特异性强，有利于实际应用。
权利要求 :
1.等温扩增引物组，其特征在于，所述等温扩增引物组包括Orf1ab基因引物组和N基因引物组，所述Orf1ab基因引物组包括正向引物Orf1ab‑F、反向引物Orf1ab‑R和反向引物En‑Orf1ab‑R；所述N基因引物组包括正向引物N‑F、反向引物N‑R和反向引物En‑N‑R，所述正向引物Orf1ab‑F序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物Orf1ab‑R序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物En‑Orf1ab‑R序列如SEQ ID NO：3所示，所述正向引物N‑F序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物N‑R序列如SEQ ID NO：5所示，所述反向引物En‑N‑R序列如SEQ ID NO：6所示，所述正向引物Orf1ab‑F、反向引物Orf1ab‑R和反向引物En‑Orf1ab‑R摩尔比范围为1：
1：1 1：3：3；所述正向引物N‑F、反向引物N‑R和反向引物En‑N‑R摩尔比范围为1：1：1 1：3：3。
~ ~
2.权利要求1所述的等温扩增引物组在制备检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。
3.一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的等温扩增引物组，所述等温扩增引物组的引物上标记有特定标记物，选自生物素、地高辛、FAM、异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5荧光染料中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光免疫层析定量检测试纸条。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫层析定量检测试纸条包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，所述硝酸纤维膜上设有一条包被有二抗的质控线C线，还设有一条与所述质控线C线平行的包被有抗B抗体的检测线T线，所述结合垫包被有荧光微球抗A抗体偶联物，所述抗A抗体和抗B抗体，可选自链霉亲和素、生物素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，所述抗荧光染料抗体可选自抗FAM抗体、抗FITC抗体、抗Cy3抗体、抗Cy5抗体，所述抗B抗体应选用与抗A抗体不同的抗体。
7.根据权利要求3 6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增引物组中的引物~
适用同一恒定反应温度，所述引物反应温度为60 61℃。
~
说明书 :
快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒，属于分子生物学检测技术、侧流层析技术等技术领域。
背景技术
[0002] 新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)属于冠状病毒科β冠状病毒属，但与SARS和MERS冠状病毒有很大不同。SARS‑CoV‑2感染患者通常表现为肺炎样症状和腹泻等胃肠道症状，其次
为严重急性期呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症，甚至
导致死亡。传染源是SARS‑CoV‑2感染患者，包括无症状感染者，以呼吸道飞沫和接触传播为
主要传播途径。目前，SARS‑CoV‑2受感染者并无特定的治疗方法，早期诊断以及时管控对于
阻止疫情扩散至关重要。
为严重急性期呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症，甚至
导致死亡。传染源是SARS‑CoV‑2感染患者，包括无症状感染者，以呼吸道飞沫和接触传播为
主要传播途径。目前，SARS‑CoV‑2受感染者并无特定的治疗方法，早期诊断以及时管控对于
阻止疫情扩散至关重要。
[0003] 目前，国内外检测新型冠状病毒方法主要有以下几种：(1)病毒分离。该方法结果准确、可区分活病毒，但操作烦琐、耗费时间长，且只能检测样本中具有感染能力的病毒颗
粒，因此灵敏度不足，不利于感染的早期诊断。(2)免疫学检测方法。以免疫胶体金技术为代
表的免疫学检测方法(试纸条法)由于操作简便、易于判定等特点适于在基层医疗单位及现
场检测中使用，但免疫胶体金法检测具有滞后性，灵敏度和特异性也有待提高。(3)病毒核
酸检测。这是目前新冠病毒检测的“金标准”，应用最为广泛的是聚合酶链式反应(PCR)技
术。常规PCR检测结果的判断主要依赖于琼脂糖凝胶电泳，耗时较长，且需使用含有一定毒
性的核酸染料等试剂，操作安全性有待提高。实时荧光定量PCR可以对靶标进行快速定量检
测且无需电泳，但由于仪器和试剂成本较高而未能在基层医疗单位和现场检测中广泛使
用。
粒，因此灵敏度不足，不利于感染的早期诊断。(2)免疫学检测方法。以免疫胶体金技术为代
表的免疫学检测方法(试纸条法)由于操作简便、易于判定等特点适于在基层医疗单位及现
场检测中使用，但免疫胶体金法检测具有滞后性，灵敏度和特异性也有待提高。(3)病毒核
酸检测。这是目前新冠病毒检测的“金标准”，应用最为广泛的是聚合酶链式反应(PCR)技
术。常规PCR检测结果的判断主要依赖于琼脂糖凝胶电泳，耗时较长，且需使用含有一定毒
性的核酸染料等试剂，操作安全性有待提高。实时荧光定量PCR可以对靶标进行快速定量检
测且无需电泳，但由于仪器和试剂成本较高而未能在基层医疗单位和现场检测中广泛使
用。
[0004] 根据目前已公开的文献或专利中等温扩增技术包括环介导等温扩增、链替代等温扩增、滚环扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增、交叉引物
等温扩增以及重组酶聚合酶扩增及其衍生技术，而且在常规链交换等温扩增方法中，反向
引物同时充当反转录引物阻碍了反应进程，削弱了反应效率。
等温扩增以及重组酶聚合酶扩增及其衍生技术，而且在常规链交换等温扩增方法中，反向
引物同时充当反转录引物阻碍了反应进程，削弱了反应效率。
[0005] 新型冠状病毒作为一种RNA病毒，极其容易发生碱基突变。目前已知的重要突变包括N501Y、E484K和K417N等，给新型冠状病毒核酸检测带来了挑战。新冠病毒核酸检测的重
要靶点序列长度有限，因此能高效扩增短序列的等温扩增方法将具有显著优势。目前，已发
表或公开的有关新型冠状病毒等温扩增方法的文献或专利中应用最广泛的是环介导等温
扩增技术。但是，该方法需使用4～6条引物进行扩增，且对靶序列及长度有一定的要求。
要靶点序列长度有限，因此能高效扩增短序列的等温扩增方法将具有显著优势。目前，已发
表或公开的有关新型冠状病毒等温扩增方法的文献或专利中应用最广泛的是环介导等温
扩增技术。但是，该方法需使用4～6条引物进行扩增，且对靶序列及长度有一定的要求。
[0006] 因此，本领域亟需开发一种能够准确检测SARS‑CoV‑2，检测时间短、灵敏度高、适于高突变率的靶标、不需要昂贵的设备和试剂且适于现场快速检测的病毒核酸检测方法。
这对于有效防止SARS‑CoV‑2的扩散具有极其重要的意义。
这对于有效防止SARS‑CoV‑2的扩散具有极其重要的意义。
发明内容
[0007] 发明目的：针对现有技术中的在常规链交换等温扩增方法中，反向引物同时充当反转录引物阻碍了反应进程，削弱了反应效率等问题，本发明提供了一种三引物介导的等
温扩增引物组以及增强链交换等温扩增方法，其中两条反向引物充当逆转录引物以有效提
升针对RNA模板的扩增效率，同时三引物协同作用保证了方法的特异性，且本发明的引物和
扩增方法相较上述技术具有适于短序列扩增、适用范围广、方法稳定等显著优势。而且本发
明方法可扩增大于等于30个核苷酸的靶序列，且对目前已知的重要突变株均可有效检测，
未来可根据新冠病毒的突变位点灵活调整引物设计，方便快捷、适用性强，具有环介导等温
扩增技术等不具备的技术优势。
温扩增引物组以及增强链交换等温扩增方法，其中两条反向引物充当逆转录引物以有效提
升针对RNA模板的扩增效率，同时三引物协同作用保证了方法的特异性，且本发明的引物和
扩增方法相较上述技术具有适于短序列扩增、适用范围广、方法稳定等显著优势。而且本发
明方法可扩增大于等于30个核苷酸的靶序列，且对目前已知的重要突变株均可有效检测，
未来可根据新冠病毒的突变位点灵活调整引物设计，方便快捷、适用性强，具有环介导等温
扩增技术等不具备的技术优势。
[0008] 本发明还要解决的技术问题是提供了等温扩增引物组在制备检测新型冠状病毒试剂盒中的应用。
[0009] 本发明最后所要解决的技术问题是针对现有技术在检测新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)和试纸条应用中存在的问题，提供一种快速检测新型冠状病毒的荧光定量试剂盒及
检测方法，而且还进一步提供了一种基于新型等温扩增的荧光免疫层析定量检测方法，兼
具核酸等温扩增的高效、灵敏、特异性和荧光定量检测结果可数字化判读的优势，有利于实
际应用，具有操作便捷、灵敏度高、特异性强、可定量的特点。
检测方法，而且还进一步提供了一种基于新型等温扩增的荧光免疫层析定量检测方法，兼
具核酸等温扩增的高效、灵敏、特异性和荧光定量检测结果可数字化判读的优势，有利于实
际应用，具有操作便捷、灵敏度高、特异性强、可定量的特点。
[0010] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了等温扩增引物组，所述等温扩增引物组包括Orf1ab基因引物组和/或N基因引物组，所述Orf1ab基因引物组包括正向引物
Orf1ab‑F、反向引物Orf1ab‑R和反向引物En‑Orf1ab‑R；所述N基因引物组包括正向引物N‑
F、反向引物N‑R和反向引物En‑N‑R，所述正向引物Orf1ab‑F序列如SEQ ID NO：1所示，所述
反向引物Orf1ab‑R序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物En‑Orf1ab‑R序列如SEQ ID NO：
3所示，所述正向引物N‑F序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物N‑R序列如SEQID NO：5所
示，所述反向引物En‑N‑R序列如SEQ ID NO：6所示。
Orf1ab‑F、反向引物Orf1ab‑R和反向引物En‑Orf1ab‑R；所述N基因引物组包括正向引物N‑
F、反向引物N‑R和反向引物En‑N‑R，所述正向引物Orf1ab‑F序列如SEQ ID NO：1所示，所述
反向引物Orf1ab‑R序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物En‑Orf1ab‑R序列如SEQ ID NO：
3所示，所述正向引物N‑F序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物N‑R序列如SEQID NO：5所
示，所述反向引物En‑N‑R序列如SEQ ID NO：6所示。
[0011] 其中，所述正向引物Orf1ab‑F、反向引物Orf1ab‑R和反向引物En‑Orf1ab‑R摩尔比范围为1∶1∶1～1∶3∶3，所述正向引物N‑F、反向引物N‑R和反向引物En‑N‑R摩尔比范围为1∶1
∶1～1∶3∶3。
∶1～1∶3∶3。
[0012] 本发明内容还包括所述的等温扩增引物组在制备检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。
[0013] 本发明内容还包括一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的等温扩增引物组。
[0014] 其中，所述等温扩增引物组的引物上标记有特定标记物，可选自生物素、地高辛、FAM、异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5荧光染料中的一种或几种，使扩增后的DNA产物两端分别含
有不同的标记物。
有不同的标记物。
[0015] 其中，所述试剂盒还包括等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。
[0016] 其中，所述阳性对照：新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品；阴性对照：生理盐水。
[0017] 其中，所述试剂盒还包括荧光免疫层析定量检测试纸条。
[0018] 其中，所述荧光免疫层析定量检测试纸条包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，所述硝酸纤维膜上设有一条包被有二抗的质控线C线，还设有一条与所述质控线C
线平行的包被有抗B抗体的检测线T线，所述结合垫包被有荧光微球抗A抗体偶联物，所述抗
A抗体和抗B抗体，可选自链霉亲和素、生物素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，所述抗荧
光染料抗体可选自抗FAM抗体、抗FITC抗体、抗Cy3抗体、抗Cy5抗体等，所述抗B抗体应选用
与抗A抗体不同的抗体。
线平行的包被有抗B抗体的检测线T线，所述结合垫包被有荧光微球抗A抗体偶联物，所述抗
A抗体和抗B抗体，可选自链霉亲和素、生物素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，所述抗荧
光染料抗体可选自抗FAM抗体、抗FITC抗体、抗Cy3抗体、抗Cy5抗体等，所述抗B抗体应选用
与抗A抗体不同的抗体。
[0019] 其中，所述等温扩增引物组中的引物适用同一恒定反应温度，所述温度范围为55～70℃，所述引物优选反应温度为60～61℃。
[0020] 本发明的引物设计包括如下特征：
[0021] (1)靶基因(Orf1ab基因和N基因)检测引物组由一条正向引物和两条反向引物构成；
[0022] (2)所述正向引物(F)和两条反向引物的序列长度均为15～30个核苷酸之间。其中一条反向引物(R)作为扩增起始阶段的逆转录引物，同时与正向引物组成扩增引物对。另一
条反向引物(En‑R)作为增强逆转录引物，辅助扩增起始模板的合成；
条反向引物(En‑R)作为增强逆转录引物，辅助扩增起始模板的合成；
[0023] (3)所述两条反向引物，反向引物(En‑R)的位置在反向引物(R)的5’端侧，且引物(En‑R)的3’末端与反向引物(R)的5’末端间隔大于等于1个核苷酸；
[0024] (4)所述扩增引物对的扩增产物长度为大于等于30个核苷酸；
[0025] (5)采用生物信息学方法设计引物及进行引物筛选得到如上所述的引物组。
[0026] 本发明内容还包括一种快速检测新型冠状病毒的方法，当Orf1ab基因和N基因扩增产物荧光值分别高于11和12时判定为阳性；当Orf1ab和N基因扩增产物荧光值分别低于
11和12时判定为阴性；当双靶标中只有一个扩增产物的荧光值高于其对应的临界值时，判
定为可疑，建议重新取样检测。
11和12时判定为阴性；当双靶标中只有一个扩增产物的荧光值高于其对应的临界值时，判
定为可疑，建议重新取样检测。
[0027] 有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
[0028] 1)病毒核酸一步法高效扩增：核酸等温扩增所使用的聚合酶同时具有5’到3’的聚合酶活性和反转录活性，可以实现对RNA靶标一步法扩增，无需额外的反转录步骤。本发明
采用的引物组合比使用一对引物扩增效率高一倍以上。
采用的引物组合比使用一对引物扩增效率高一倍以上。
[0029] 2)检测用时短：等温反应只需50min，即可扩增出满足荧光定量检测要求的产物数量。本发明从核酸扩增到结果判定可在1小时内完成。
[0030] 3)仪器简单：扩增反应只需要一台普通水浴锅就能完成，扩增反应条件温和，安全、不易污染。
[0031] 4)特异性强：本发明引物组合高效特异，与同为冠状病毒属的其他6种人类冠状病毒、常见呼吸道病原菌以及临床症状相似的11种人类致病性病毒均无交叉反应性。
[0032] 5)灵敏度高：本发明的试剂盒最低检测极限可达到70～90拷贝/μL，与RT‑qPCR灵敏度相当。
[0033] 6)广泛的适用性：核酸等温扩增方法和荧光定量检测试剂盒具有广泛的适用性，对靶序列无特殊要求，常规引物即可扩增，应用前景广阔。
[0034] 7)适于基因组高突变率的靶标的检测：本发明方法对短序列具有良好的扩增效率，适于基因组高突变率的病原微生物的检测。
[0035] 8)适于现场检测：本发明荧光定量分析仪可手持式使用，试纸条判读简单快捷，参考临界值(cutoff值)即可判定结果。
[0036] 综上，本发明的荧光定量试剂盒及其检测方法具有用时短、仪器简单、高特异性、高灵敏度、通用性强、适于现场检测等优点，无需复杂仪器，为医疗卫生、出入境检验检疫等
单位筛查和检测新型冠状病毒提供了新的技术支持，具有广阔的市场前景和较大的社会、
经济效益。
单位筛查和检测新型冠状病毒提供了新的技术支持，具有广阔的市场前景和较大的社会、
经济效益。
[0037] 下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
附图说明
[0038] 图1为本发明荧光定量检测试剂盒检测结果判断示意图。其中，当两个靶基因扩增产物的检测线和控制线处均有扩增峰曲线时为阳性，当两个靶基因扩增产物只有控制线有
扩增峰曲线时为阴性。
扩增峰曲线时为阴性。
[0039] 图2为本发明靶向新型冠状病毒Orf1ab基因等温扩增引物筛选结果。
[0040] 图3为本发明靶向新型冠状病毒N基因等温扩增引物筛选结果。
[0041] 图4为本发明靶向新型冠状病毒Orf1ab基因等温扩增的增加反向引物筛选结果。
[0042] 图5为本发明靶向新型冠状病毒N基因等温扩增的增加反向引物筛选结果。
[0043] 图6为本发明等温扩增方法Orf1ab基因和N基因扩增引物与其他11种临床表现类似的人类致病性病毒基因组比对结果。
[0044] 图7为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法Orf1ab基因不同反应温度测试结果图。
[0045] 图8为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法Orf1ab基因不同反应时间测试结果图。
[0046] 图9为本发明Orf1ab基因等温扩增方法酶切鉴定结果图。图为使用限制性内切酶MseI反应结果。
[0047] 图10为本发明基于Orf1ab基因的新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品和阴性质控检测结果对比图。其中，图A为阳性质控和阴性质控的测试线荧光信号值，图B为阳性质
控和阴性质控对应的试纸条荧光成像结果。
控和阴性质控对应的试纸条荧光成像结果。
[0048] 图11为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法N基因不同反应温度测试结果图。
[0049] 图12为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法N基因不同反应时间测试结果图。
[0050] 图13为本发明N基因等温扩增方法酶切鉴定结果图。图为使用限制性内切酶BsaAI反应结果。
[0051] 图14为本发明基于N基因的新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品和阴性质控检测结果对比图。其中，图A为阳性质控和阴性质控的测试线荧光信号值，图B为阳性质控和阴
性质控对应的试纸条荧光成像结果。
性质控对应的试纸条荧光成像结果。
[0052] 图15为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法基于Orf1ab基因检测新型冠状病毒核酸标准物质的灵敏度结果图。
[0053] 图16为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法基于Orf1ab基因检测新型冠状病毒核酸标准物质的标准曲线。
[0054] 图17为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法基于N基因检测新型冠状病毒核酸标准物质的灵敏度结果图。
[0055] 图18为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法基于N基因检测新型冠状病毒核酸标准物质的标准曲线。
[0056] 图19为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法基于Orf1ab基因检测的特异性测试结果图。
[0057] 图20为本发明新型冠状病毒荧光定量检测方法基于N基因检测的特异性测试结果图。
具体实施方式
[0058] 下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出，以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
[0059] 实施例1：荧光免疫层析定量检测试纸条的制备
[0060] 荧光免疫层析定量检测试纸条，其组成包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，底板上用硝酸纤维膜粘贴，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端连接结合垫；结合
垫上搭接样品垫，硝酸纤维膜上设有一条包被有一种抗A抗体的控制线(C线)，同时还设有
一条与所述质控线平行的包被有抗B抗体的检测线(T线)；结合垫为固定有标记链霉亲和素
的荧光微球的玻璃纤维膜；试纸条还包含一个卡壳，卡壳上设置有加样窗口和信号读取窗
口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与检测线、质控线对应。
垫上搭接样品垫，硝酸纤维膜上设有一条包被有一种抗A抗体的控制线(C线)，同时还设有
一条与所述质控线平行的包被有抗B抗体的检测线(T线)；结合垫为固定有标记链霉亲和素
的荧光微球的玻璃纤维膜；试纸条还包含一个卡壳，卡壳上设置有加样窗口和信号读取窗
口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与检测线、质控线对应。
[0061] 具体制备过程如下：
[0062] (1)选用亲水的玻璃纤维制作样品垫和结合垫，将样品垫、结合垫浸泡在100mL缓冲液与效应物的混合溶液中，2min后取出，然后在70℃烘箱中干燥备用。将标记链霉亲和素
的荧光微球探针以5μL/cm的量，喷洒在结合垫上、干燥，制得固定有探针的结合垫以及经过
处理的样品垫。所述缓冲液为pH 9.0、浓度为0.002M的磷酸缓冲液，所述效应物为占处理液
总质量1wt％的分子量为400‑20000的PEG、1wt％的叠氮钠、0.05wt％的酪蛋白、0.05wt％的
胎牛血清蛋白、0.01wt％的海藻糖。
的荧光微球探针以5μL/cm的量，喷洒在结合垫上、干燥，制得固定有探针的结合垫以及经过
处理的样品垫。所述缓冲液为pH 9.0、浓度为0.002M的磷酸缓冲液，所述效应物为占处理液
总质量1wt％的分子量为400‑20000的PEG、1wt％的叠氮钠、0.05wt％的酪蛋白、0.05wt％的
胎牛血清蛋白、0.01wt％的海藻糖。
[0063] (2)选用跑水速度为90s的硝酸纤维膜，将硝酸纤维膜放置在湿度为25～65％的密闭箱中平衡1h，将48μg抗地高辛抗体用pH 6.5、浓度0.1M的Tris‑盐酸缓冲液稀释至2mg/
mL，0.48μg生物素用缓冲液稀释至20μg/mL，将上述两种抗体在硝酸纤维膜上划线，划线量
为0.8μL/cm，划线结束后，干燥备用，所述用于稀释羊抗鼠IgG抗体的缓冲液为pH 7.4、浓度
为0.005M的磷酸盐缓冲液。
mL，0.48μg生物素用缓冲液稀释至20μg/mL，将上述两种抗体在硝酸纤维膜上划线，划线量
为0.8μL/cm，划线结束后，干燥备用，所述用于稀释羊抗鼠IgG抗体的缓冲液为pH 7.4、浓度
为0.005M的磷酸盐缓冲液。
[0064] (3)在带有粘性的PVC底板中部粘贴步骤(2)中制备的硝酸纤维膜。所述硝酸纤维膜一端粘贴吸水纸，二者重叠宽度为2mm；所述硝酸纤维膜另一端接结合垫，二者交错层叠，
重叠宽度为4mm；样品垫覆盖在结合垫上，将底板固定，最后裁切成免疫层析试纸条。
重叠宽度为4mm；样品垫覆盖在结合垫上，将底板固定，最后裁切成免疫层析试纸条。
[0065] (4)将裁切好的免疫层析试纸条封装上卡壳，卡壳上设置有加样窗口和信号读取窗口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与质控线、检测线对应。
[0066] 实施例2：基于新型冠状病毒Orf1ab基因和N基因的等温扩增引物组的设计与筛选
[0067] 1.新型冠状病毒Orf1ab基因和N基因等温扩增引物的设计与筛选
[0068] 根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的新型冠状病毒全基因组序列和其他重要冠状病毒全基因组序列(NC045512_SARS‑CoV‑2，NC004718_SARS
CoV，MH734115_MERS CoV，KY862055_HCoV NL63，MK334046_HCoV‑NL63，KF923902_
HCoVOC43，KU131570_HCoV OC43，DQ339101_HCoV HKU1，AY597011_HCoV HKU1，AF304460_
HCoV 229E)，使用BLASTn、MAFFT、DNASTAR等分子生物学工具进行全基因组多序列比对分
析，获得新型冠状病毒Orf1ab基因和N基因特异性的保守区域。根据保守靶基因序列，利用
Primer Premier 5.0和在线工具NUPACK(http：//www.nupack.org/)进行等温扩增引物的
设计。所设计引物进一步通过BLASTn和Primer‑BLAST检索验证。
CoV，MH734115_MERS CoV，KY862055_HCoV NL63，MK334046_HCoV‑NL63，KF923902_
HCoVOC43，KU131570_HCoV OC43，DQ339101_HCoV HKU1，AY597011_HCoV HKU1，AF304460_
HCoV 229E)，使用BLASTn、MAFFT、DNASTAR等分子生物学工具进行全基因组多序列比对分
析，获得新型冠状病毒Orf1ab基因和N基因特异性的保守区域。根据保守靶基因序列，利用
Primer Premier 5.0和在线工具NUPACK(http：//www.nupack.org/)进行等温扩增引物的
设计。所设计引物进一步通过BLASTn和Primer‑BLAST检索验证。
[0069] 针对新型冠状病毒Orf1ab基因和N基因，分别设计了6组上下游引物进行筛选实验，序列如下：
[0070] 表1靶向Orf1ab和N基因等温扩增备选引物信息
[0071]
[0072]
[0073] 等温扩增反应体系及程序为：以新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)核酸标准物质5 5
(Orf1ab基因浓度为9×10拷贝/μL、N基因浓度为7×10拷贝/μL)为模板，20μL反应体系包
括：2μL的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～
10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、1 μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和5.5μL无酶水。
将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管
混匀后离心，将平行样品分别置于恒温环境61℃、63℃和65℃反应65min。等温扩增反应结
束后使用荧光定量分析仪进行分析。
(Orf1ab基因浓度为9×10拷贝/μL、N基因浓度为7×10拷贝/μL)为模板，20μL反应体系包
括：2μL的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～
10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、1 μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和5.5μL无酶水。
将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管
混匀后离心，将平行样品分别置于恒温环境61℃、63℃和65℃反应65min。等温扩增反应结
束后使用荧光定量分析仪进行分析。
[0074] 如图2所示，基于Orf1ab基因序列设计的6对备选引物中，除了第二对引物(Orf1ab‑2)未实现扩增外，其他5对引物均能实现扩增，且阴性对照均无扩增。其中，第六对
引物(Orf1ab‑6)的扩增产物荧光信号值相对较高。因此，选择Orf1ab‑6引物对作为Orf1ab
基因的优选扩增引物。同时，Orf1ab‑6引物(14887‑14933nt)位于编码病毒RNA依赖性的RNA
聚合酶(RdRP)上。因此，Orf1ab‑6引物同时也是RdRP基因的扩增引物。
引物(Orf1ab‑6)的扩增产物荧光信号值相对较高。因此，选择Orf1ab‑6引物对作为Orf1ab
基因的优选扩增引物。同时，Orf1ab‑6引物(14887‑14933nt)位于编码病毒RNA依赖性的RNA
聚合酶(RdRP)上。因此，Orf1ab‑6引物同时也是RdRP基因的扩增引物。
[0075] 如图3所示，基于N基因序列设计的6对备选引物中，第一对(N‑1)和第四对(N‑4)的所有阴性对照均出现了非特异性扩增，因此首先排除。在其他四对引物中，除了第五对引物
(N‑5)没有实现扩增外，另外3对引物均能实现扩增。其中，第六对引物(N‑6)在反应温度为
61℃时，阴性对照出现非特异性扩增。相较第二对引物(N‑2)和N‑6引物对63℃和65℃时的
扩增产物荧光值，第三对引物(N‑3)的扩增产物荧光信号值相对较高。因此，选择N‑3引物对
作为N基因的优选扩增引物。
(N‑5)没有实现扩增外，另外3对引物均能实现扩增。其中，第六对引物(N‑6)在反应温度为
61℃时，阴性对照出现非特异性扩增。相较第二对引物(N‑2)和N‑6引物对63℃和65℃时的
扩增产物荧光值，第三对引物(N‑3)的扩增产物荧光信号值相对较高。因此，选择N‑3引物对
作为N基因的优选扩增引物。
[0076] 2.新型冠状病毒Orfiab(RdRP)基因和N基因等温扩增引物组的设计与筛选
[0077] 为了提高RT‑SEA的反应效率、缩短反应时间，本实验拟通过在下游引物方向增加一条反向引物作为逆转录引物从而加速RT‑SEA的反应过程。基于引物设计原则，在上述优
选引物对的基础上，使用Primer Premier 5.0引物设计软件在Orf1ab(RdRP)和N基因下游
引物方向不同的位置设计增加反向引物(En‑primer‑R)，通过Thermo Scientific提供的在
线工具Multiple Primer Analyzer评估增强引物与优选引物序列之间的交叉反应性及可
能的二级结构，并使用NUPACK(http：//www.nupack.org/)和Primer‑BLAST评估验证引物的
二级结构稳定性及特异性。
选引物对的基础上，使用Primer Premier 5.0引物设计软件在Orf1ab(RdRP)和N基因下游
引物方向不同的位置设计增加反向引物(En‑primer‑R)，通过Thermo Scientific提供的在
线工具Multiple Primer Analyzer评估增强引物与优选引物序列之间的交叉反应性及可
能的二级结构，并使用NUPACK(http：//www.nupack.org/)和Primer‑BLAST评估验证引物的
二级结构稳定性及特异性。
[0078] 针对新型冠状病毒Orf1ab(RdRP)基因和N基因的特征，在上述优选引物对的基础上分别设计添加了2条反向引物进行引物组筛选实验，序列如下：
[0079] 表2 Orf1ab(RdRP)和N基因等温扩增备选引物组信息
[0080]
[0081]
[0082] 等温扩增反应体系及程序为：以新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)核酸标准物质为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二
醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、1μL En‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合
酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时
设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品分别置于恒温环境61℃、
63℃和65℃反应65min。等温扩增反应结束后使用荧光定量分析仪进行分析。
醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、1μL En‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合
酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时
设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品分别置于恒温环境61℃、
63℃和65℃反应65min。等温扩增反应结束后使用荧光定量分析仪进行分析。
[0083] 如图4所示，基于Orf1ab基因优选引物对设计的两条备选增加反向引物中，添加引物1(En‑Orf1ab‑R1)后扩增产物在61℃时荧光值最高，但与不添加该条引物时的荧光值无
明显差别(5000左右)，可见En‑Orf1ab‑R1无明显的提高反应效率的作用。添加引物2(En‑
Orf1ab‑R2)后扩增产物在61℃时荧光信号值可到22000左右，可见En‑Orf1ab‑R2能明显地
提高反应的效率。因此，本发明选择En‑Orf1ab‑R2作为Orf1ab基因扩增优选的增加反向引
物。
明显差别(5000左右)，可见En‑Orf1ab‑R1无明显的提高反应效率的作用。添加引物2(En‑
Orf1ab‑R2)后扩增产物在61℃时荧光信号值可到22000左右，可见En‑Orf1ab‑R2能明显地
提高反应的效率。因此，本发明选择En‑Orf1ab‑R2作为Orf1ab基因扩增优选的增加反向引
物。
[0084] 如图5所示，基于N基因优选引物对设计的两条备选增加反向引物中，添加引物1(En‑N‑R1)后扩增产物在61℃～65℃时荧光值大幅升高。但在反应温度为61℃和63℃时，阴
性对照也出现了非特异性扩增且荧光值较高。65℃时，阴性对照非特异性扩增消失。添加引
物2(En‑N‑R2)后扩增产物在61℃时荧光信号值可到35000左右，明显高于不添加该条引物
时的扩增产物荧光值，可见En‑N‑R2能明显地提高反应的效率。虽然En‑N‑R1在反应温度为
65℃时，阴性对照无非特异性扩增，但其荧光值相较于En‑N‑R2(61～63℃)的荧光值并无明
显优势。同时，考虑到后续Orf1ab和N基因方法优化反应条件以便使用同一设备、同一条件
进行扩增的需要，因此，本发明选择En‑N‑R2作为N基因扩增优选的增加反向引物。
性对照也出现了非特异性扩增且荧光值较高。65℃时，阴性对照非特异性扩增消失。添加引
物2(En‑N‑R2)后扩增产物在61℃时荧光信号值可到35000左右，明显高于不添加该条引物
时的扩增产物荧光值，可见En‑N‑R2能明显地提高反应的效率。虽然En‑N‑R1在反应温度为
65℃时，阴性对照无非特异性扩增，但其荧光值相较于En‑N‑R2(61～63℃)的荧光值并无明
显优势。同时，考虑到后续Orf1ab和N基因方法优化反应条件以便使用同一设备、同一条件
进行扩增的需要，因此，本发明选择En‑N‑R2作为N基因扩增优选的增加反向引物。
[0085] 综上，本发明优化得到新型冠状病毒Orf1ab(RdRP)和N基因扩增引物组，如表3所示。优选的引物组序列与临床症状相似的11种人类致病性病毒(流感病毒A/B/C、腺病毒、副
流感病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒A/B、人鼻病毒、人博卡病毒、人肠道病毒等)基因组
经BLASTn和Primer‑BLAST等分子生物学工具分析验证(图6)。
流感病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒A/B、人鼻病毒、人博卡病毒、人肠道病毒等)基因组
经BLASTn和Primer‑BLAST等分子生物学工具分析验证(图6)。
[0086] 表3基于新型冠状病毒Orf1ab(RdRP)和N基因的等温扩增检测引物
[0087]
[0088]
[0089] 所述的等温扩增方法所得Orf1ab(RdRP)基因扩增片段序列(加粗所标示部分为限制性内切酶MseI(T^TAA/AAT^T)的酶切位点)如下：
[0090] 所述的等温扩增方法所得N基因扩增片段序列(加粗所标示部分为限制性内切酶BsaAI(YAC^GTR/RTG^CAY)的酶切位点)如下：
[0091] 实施例3：基于等温扩增的新型冠状病毒Orf1ab(RdRP)基因荧光定量检测方法的建立
[0092] 使用实施例2中设计的新型冠状病毒Orf1ab(RdRP)基因特异性扩增引物对新型冠5
状病毒(SARS‑CoV‑2)核酸标准物质(9×10拷贝/μL)(购自中国计量科学研究院)和阴性对
照(生理盐水)进行等温扩增方法测试，以获得最佳反应温度及反应时间，具体方法如下：
状病毒(SARS‑CoV‑2)核酸标准物质(9×10拷贝/μL)(购自中国计量科学研究院)和阴性对
照(生理盐水)进行等温扩增方法测试，以获得最佳反应温度及反应时间，具体方法如下：
[0093] 1、反应温度的确定
[0094] 以新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)核酸标准物质(9×105拷贝/μL)为模板，在实施例2获得的Orf1ab(RdRP)基因特异性引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：2μ
L的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～
10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑Orflab‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA
聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，
同时设置阴性对照(生理盐水)。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品分别置
于恒温环境59℃、60℃、61℃、62℃、63℃和64℃反应55～60min。
L的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～
10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑Orflab‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA
聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，
同时设置阴性对照(生理盐水)。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品分别置
于恒温环境59℃、60℃、61℃、62℃、63℃和64℃反应55～60min。
[0095] 待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数值。
[0096] 从图7可以看出，反应温度在59℃、60℃、61℃、62℃、63℃和64℃时，均能获得较高的荧光值。因此，选择60℃～61℃均可为理想的反应温度。
[0097] 2、反应时间的确定
[0098] 以新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质(9×105拷贝/μL)为模板，在实施例2获得的Orf1ab(RdRP)基因特异性引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：2μ
L的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～
10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑Orf1ab‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA
聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，
同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品置于恒温环境60℃
～61℃反应65min，每隔5分钟测试一次样品的荧光值。
L的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～
10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑Orf1ab‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA
聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，
同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将平行样品置于恒温环境60℃
～61℃反应65min，每隔5分钟测试一次样品的荧光值。
[0099] 待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数值。
[0100] 从图8和表4可以看出，当反应体系中添加En‑Orf1ab‑R增强引物时，随着反应时间的延长，扩增产物的荧光值逐渐增高。从0min到50min，扩增产物的荧光值迅速增高，50～
55min时已获得较高的荧光值，但在反应时间大于60min后，荧光值曲线斜率趋于平缓。而当
反应体系中不加En‑Orf1ab‑R增强引物时，则从60min开始检测到荧光信号。因此，在添加
En‑Orf1ab‑R增强引物的条件下选择50～55min作为理想的反应时间。
55min时已获得较高的荧光值，但在反应时间大于60min后，荧光值曲线斜率趋于平缓。而当
反应体系中不加En‑Orf1ab‑R增强引物时，则从60min开始检测到荧光信号。因此，在添加
En‑Orf1ab‑R增强引物的条件下选择50～55min作为理想的反应时间。
[0101] 表4使用优选引物组的扩增效率结果
[0102]
[0103] 3、酶切验证等温扩增方法
[0104] 本发明等温扩增产物中含有一个MseI(T^TAA/AAT^T)酶切位点，可对新型冠状病毒Orf1ab(RdRP)基因扩增产物进行酶切鉴定。
[0105] 第一步，以新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质(9×105拷贝/μL)为模板，在实施例2获得的Orf1ab(RdRP)基因特异性引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系
包括：2μL的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1
～10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑Orflab‑R(1～20μM)、1μL Bst
DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)
中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，置于恒温环境60℃～61℃反
应60min。
包括：2μL的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1
～10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑Orflab‑R(1～20μM)、1μL Bst
DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)
中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，置于恒温环境60℃～61℃反
应60min。
[0106] 第二步，取5μL等温扩增产物，加入1.5μLMseI、2μL反应缓冲液及11.5μL ddH2O，混匀后瞬时离心，在37℃条件下反应1h，取5μL产物使用3.0％琼脂糖凝胶电泳观察结果。从图
9中可以看出，等温扩增产物经3％浓度的琼脂糖凝胶电泳显示出典型的梯状条带，无弥散
现象。经过酶切反应后，产物主要为两个不同大小的条带，可见扩增产物序列准确。
9中可以看出，等温扩增产物经3％浓度的琼脂糖凝胶电泳显示出典型的梯状条带，无弥散
现象。经过酶切反应后，产物主要为两个不同大小的条带，可见扩增产物序列准确。
[0107] 4.基于等温扩增技术的荧光定量试纸条检测方法的建立
[0108] 以新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质(9×105拷贝/μL)为模板，在实施例2获得的Orf1ab(RdRP)基因特异性引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：2μ
L的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～
10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑Orf1ab‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA
聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，
同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，置于恒温环境60℃～61℃反应
50～55min。
L的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～
10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑Orf1ab‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA
聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，
同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，置于恒温环境60℃～61℃反应
50～55min。
[0109] 待等温扩增反应结束后，向反应管中直接加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数
值。
值。
[0110] 结果如图10和表5所示，基于Orf1ab(RdRP)基因检测的荧光定量检测方法结果稳定，有利于实际应用。
[0111] 表5基于新型冠状病毒Orf1ab(RdRP)基因检测阳性质控和阴性质控测试结果对比
[0112]
[0113] 注：CV表示变异系数。
[0114] 实施例4：基于等温扩增的检测新型冠状病毒N基因的荧光定量检测方法的建立使用实施例2中设计的新型冠状病毒N基因特异性扩增引物对新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)核
5
酸标准物质(7×10拷贝/μL)(购自中国计量科学研究院)和阴性对照(生理盐水)进行等温
扩增方法测试，以获得最佳反应温度及反应时间，具体方法如下：
5
酸标准物质(7×10拷贝/μL)(购自中国计量科学研究院)和阴性对照(生理盐水)进行等温
扩增方法测试，以获得最佳反应温度及反应时间，具体方法如下：
[0115] 1、反应温度的确定
[0116] 以新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质(7×105拷贝/μL)为模板，在实施例2获得的N基因特异性引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：2μL的10×等温
扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物N‑F和
N‑R(10μM)各2μL、1μL En‑N‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL
无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系
的反应管混匀后离心，将平行样品分别置于恒温环境59℃、60℃、61℃、62℃、63℃和64℃反
应55‑60min。
扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物N‑F和
N‑R(10μM)各2μL、1μL En‑N‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL
无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系
的反应管混匀后离心，将平行样品分别置于恒温环境59℃、60℃、61℃、62℃、63℃和64℃反
应55‑60min。
[0117] 待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数值。
[0118] 从图11可以看出，反应温度在59℃、60℃、61℃、62℃、63℃和64℃时，均能获得较高的荧光值，其中60℃～61℃温度范围内测量结果相对稳定，荧光值波动不大，因此选择60
℃～61℃均可为理想的反应温度。
℃～61℃均可为理想的反应温度。
[0119] 2、反应时间的确定
[0120] 以新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质(7×105拷贝/μL)为模板，在实施例2获得的N基因特异性引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：2μL的10×等温
扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物N‑F和
N‑R(10μM)各2μL、1μL En‑N‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL
无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系
的反应管混匀后离心，将平行样品置于恒温环境60℃～61℃反应65min，每隔5分钟测试一
次样品的荧光值。
扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物N‑F和
N‑R(10μM)各2μL、1μL En‑N‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL
无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系
的反应管混匀后离心，将平行样品置于恒温环境60℃～61℃反应65min，每隔5分钟测试一
次样品的荧光值。
[0121] 待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1 M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数值。
[0122] 从图12和表6可以看出，当反应体系中添加En‑N‑R增强引物时，随着反应时间的延长，扩增产物的荧光值逐渐增高。从0min到50min，扩增产物的荧光值迅速增高，50～55min
时已获得较高的荧光值，但在反应时间大于60min后，荧光值曲线斜率趋于平缓。而当反应
体系中不加En‑N‑R增强引物时，则从60min开始检测到荧光信号。因此，在添加En‑N‑R增强
引物的条件下选择50～55min作为理想的反应时间。
时已获得较高的荧光值，但在反应时间大于60min后，荧光值曲线斜率趋于平缓。而当反应
体系中不加En‑N‑R增强引物时，则从60min开始检测到荧光信号。因此，在添加En‑N‑R增强
引物的条件下选择50～55min作为理想的反应时间。
[0123] 表6使用优选引物组的扩增效率结果
[0124]
[0125] 3、酶切验证等温扩增方法
[0126] 本发明等温扩增产物中含有一个BsaAI(YAC^GTR/RTG^CAY)酶切位点，可对新型冠状病毒N基因扩增产物进行酶切鉴定。
[0127] 第一步，以新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质(7×105拷贝/μL)为模板，在实施例2获得的N基因特异性引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：2μL的
10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引
物N‑F和N‑R(10μM)各2μL、1μL En‑N‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板
和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反
应体系的反应管混匀后离心，置于恒温环境60℃～61℃反应60min。
10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引
物N‑F和N‑R(10μM)各2μL、1μL En‑N‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板
和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反
应体系的反应管混匀后离心，置于恒温环境60℃～61℃反应60min。
[0128] 第二步，取5μL等温扩增产物，加入1.5μL BsaAI、2μL反应缓冲液及11.5μL ddH2O，混匀后瞬时离心，在37℃条件下反应1h，取5μL产物使用3.0％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
[0129] 从图13中可以看出，等温扩增产物经3％浓度的琼脂糖凝胶电泳显示出典型的梯状条带，无弥散现象。经过酶切反应后，产物主要为两个大小不等的条带，可见扩增产物序
列准确。
列准确。
[0130] 4、基于等温扩增技术的荧光定量试纸条检测方法的建立
[0131] 以新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质(7×105拷贝/μL)为模板，在实施例2获得的N基因特异性引物的引导下进行等温扩增，其中，20μL反应体系包括：2μL的10×等温
扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物N‑F和
N‑R(10μM)各2μL、1μL En‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无
酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的
反应管混匀后离心，置于恒温环境60℃～61℃反应50～55min。
扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物N‑F和
N‑R(10μM)各2μL、1μL En‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无
酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的
反应管混匀后离心，置于恒温环境60℃～61℃反应50～55min。
[0132] 待等温扩增反应结束后，向反应管中直接加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数
值。
值。
[0133] 结果如图14和表7所示，基于N基因检测的荧光定量检测方法结果稳定，有利于实际应用。
[0134] 表7基于新型冠状病毒N基因检测阳性质控和阴性质控测试结果对比
[0135]
[0136] 注：CV表示变异系数。
[0137] 实施例5：快速检测新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒基于Orf1ab基因的灵敏度测试
[0138] 本实施例测试本发明荧光定量检测试剂盒检测新型冠状病毒的灵敏度。将新型冠5 0
状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质从9×10拷贝/μL进行10倍梯度稀释至9×10拷贝/μL。
反应体系和程序如下所示：
状病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质从9×10拷贝/μL进行10倍梯度稀释至9×10拷贝/μL。
反应体系和程序如下所示：
[0139] 20μL等温扩增反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物Orf1ab‑F和Orf1ab‑R(10μM)各2μL、1μL En‑
Orflab‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系
配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阳性对照(新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控
品)和阴性对照(生理盐水)。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境60
℃～61℃反应50～55min。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH
8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析
仪读取数值。
Orflab‑R(1～20μM)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系
配制于微型反应管(200μL型)中，同时设置阳性对照(新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控
品)和阴性对照(生理盐水)。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境60
℃～61℃反应50～55min。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH
8.0～9.0，0.01～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析
仪读取数值。
[0140] 检测结果如图15所示，图中：特异性扩增曲线对应的核酸标准物质模板浓度分别5 4 3 2 1
为9×10拷贝/μL、9×10 拷贝/μL、9×10拷贝/μL、9×10拷贝/μL、9×10 拷贝/μL，而9×
0 1
10拷贝/μL和阴性对照则看不到明显的曲线。判定本试剂盒的检测灵敏度为9×10拷贝/μ
L，具有较高的灵敏度和应用价值。图16为梯度稀释的核酸标准物质样品对应荧光值所建立
的线性关系。
为9×10拷贝/μL、9×10 拷贝/μL、9×10拷贝/μL、9×10拷贝/μL、9×10 拷贝/μL，而9×
0 1
10拷贝/μL和阴性对照则看不到明显的曲线。判定本试剂盒的检测灵敏度为9×10拷贝/μ
L，具有较高的灵敏度和应用价值。图16为梯度稀释的核酸标准物质样品对应荧光值所建立
的线性关系。
[0141] 结果表明，本试剂盒的荧光定量检测方法最低检出限9×101拷贝/μL，结果表明本发明试剂盒具有较高的灵敏度和检测价值，并可实现快速定量检测。
[0142] 实施例6：快速检测新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒基于N基因的灵敏度测试
[0143] 本实施例测试本发明荧光定量检测方法检测新型冠状病毒的灵敏度。将新型冠状5 0
病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质从7×10拷贝/μL进行10倍梯度稀释至7×10拷贝/μL。反
应体系和程序如下所示：
病毒(SARS‑COV‑2)核酸标准物质从7×10拷贝/μL进行10倍梯度稀释至7×10拷贝/μL。反
应体系和程序如下所示：
[0144] 20μL等温扩增反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物N‑F和N‑R(10μM)各2μL、1μLEn‑N‑R (1～20μ
M)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应
管(200μL型)中，同时设置阳性对照(新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品)和阴性对照
(生理盐水)。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境60℃～61℃反应
50～55min。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01
～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数值。
M)、1μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应
管(200μL型)中，同时设置阳性对照(新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品)和阴性对照
(生理盐水)。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境60℃～61℃反应
50～55min。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01
～1M Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数值。
[0145] 检测结果如图17所示，图中：特异性扩增曲线对应的核酸标准物质模板浓度分别5 4 3 2 1
为7×10拷贝/μL、7×10 拷贝/μL、7×10拷贝/μL、7×10拷贝/μL、7×10 拷贝/μL，而7×
0 1
10拷贝/μL和阴性对照则看不到明显的曲线。判定本试剂盒的检测灵敏度为7×10拷贝/μ
L，具有较高的灵敏度和应用价值。图18为梯度稀释的核酸标准物质样品对应荧光值所建立
的线性关系。
为7×10拷贝/μL、7×10 拷贝/μL、7×10拷贝/μL、7×10拷贝/μL、7×10 拷贝/μL，而7×
0 1
10拷贝/μL和阴性对照则看不到明显的曲线。判定本试剂盒的检测灵敏度为7×10拷贝/μ
L，具有较高的灵敏度和应用价值。图18为梯度稀释的核酸标准物质样品对应荧光值所建立
的线性关系。
[0146] 结果表明，本试剂盒的荧光定量检测方法最低检出限为7×101拷贝/μL。本发明试剂盒具有较高的灵敏度和检测价值，并可实现快速定量检测。
[0147] 实施例7：快速检测新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒基于Orf1ab基因检测的特异性测试
[0148] 用实施例3确定的优化反应体系及反应条件进行等温扩增及荧光定量检测。取人冠状病毒(HCoV‑229E、HCoV‑OC43、HCoV‑NL63、HCoV‑HKU1)、中东呼吸综合征冠状病毒
(MERS‑CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS‑CoV)(假病毒标准参考物质)以及肺炎克
雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，按照实施例3确定的优化反应体系和反应条件进
行等温扩增，60℃～61℃反应50～55min。结果如图19和表8所示，仅新型冠状病毒核酸标准
物质显示出特异性扩增峰，荧光值均大于20000，而其他冠状病毒均无特异性扩增峰，荧光
值均小于11。
(MERS‑CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS‑CoV)(假病毒标准参考物质)以及肺炎克
雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，按照实施例3确定的优化反应体系和反应条件进
行等温扩增，60℃～61℃反应50～55min。结果如图19和表8所示，仅新型冠状病毒核酸标准
物质显示出特异性扩增峰，荧光值均大于20000，而其他冠状病毒均无特异性扩增峰，荧光
值均小于11。
[0149] 结果表明，本发明荧光定量检测方法基于Orf1ab基因的检测特异性好，具有较高的检测应用价值。
[0150] 表8基于新型冠状病毒Orf1ab(RdRP)基因的检测方法特异性评价试验测试结果
[0151]
[0152] 实施例8：快速检测新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒基于N基因检测的特异性测试
[0153] 用实施例4确定的优化反应体系及反应条件进行等温扩增及荧光定量检测。取人冠状病毒(HCoV‑229E、HCoV‑OC43、HCoV‑NL63、HCoV‑HKU1)、中东呼吸综合征冠状病毒
(MERS‑CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS‑CoV)(假病毒标准参考物质)以及肺炎克
雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。按照实施例4确定的优化反应体系和反应条件进
行等温扩增，60℃～61℃反应50～55min。结果如图20和表9所示，仅新型冠状病毒核酸标准
物质显示出特异性扩增峰，荧光值均大于30000，而其他冠状病毒均无特异性扩增峰，荧光
值均小于12。
(MERS‑CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS‑CoV)(假病毒标准参考物质)以及肺炎克
雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。按照实施例4确定的优化反应体系和反应条件进
行等温扩增，60℃～61℃反应50～55min。结果如图20和表9所示，仅新型冠状病毒核酸标准
物质显示出特异性扩增峰，荧光值均大于30000，而其他冠状病毒均无特异性扩增峰，荧光
值均小于12。
[0154] 结果表明，本发明荧光定量检测试剂盒基于N基因的方法特异性好，具有较高的检测应用价值。
[0155] 表9基于新型冠状病毒N基因的检测方法特异件评价试验测试结果
[0156]
[0157] 实施例9：临床样本验证测试
[0158] 用实施例3和4确定的优化反应体系及反应条件进行等温扩增及荧光定量检测。为了评估本发明方法在检测临床样品中SARS‑CoV‑2的应用性能，使用植绒无菌拭子从研究组
人员(经中大医院核酸检测为阴性)收集两份咽喉拭子样本，并将其保存于3mL病毒运输培
养基(VTM)(购自青岛海博生物技术有限公司)中，其中一份拭子样品中加入30μL SARS‑
7
CoV‑2假病毒标准参考物质(1×10拷贝/mL)作为模拟临床感染物。将棉签在VTM中旋转混
匀1分钟，于管壁上挤压拭子以充分转移病毒。使用病毒提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST
Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取拭子样品中的RNA。同时，使用空白VTM作为
核酸提取过程中的无模板对照。
人员(经中大医院核酸检测为阴性)收集两份咽喉拭子样本，并将其保存于3mL病毒运输培
养基(VTM)(购自青岛海博生物技术有限公司)中，其中一份拭子样品中加入30μL SARS‑
7
CoV‑2假病毒标准参考物质(1×10拷贝/mL)作为模拟临床感染物。将棉签在VTM中旋转混
匀1分钟，于管壁上挤压拭子以充分转移病毒。使用病毒提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST
Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取拭子样品中的RNA。同时，使用空白VTM作为
核酸提取过程中的无模板对照。
[0159] 20μL等温扩增反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液、3μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1.5μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、1μL En‑R(1～20μM)、1μL
Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL
型)中。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境60℃～61℃反应50～
55min。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M
Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数值。
Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、2μL模板和4.5μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管(200μL
型)中。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将样品置于恒温环境60℃～61℃反应50～
55min。待等温扩增反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(pH 8.0～9.0，0.01～1M
Tris溶液)，吹打混匀后滴入加样窗口。静置2min，通过荧光定量分析仪读取数值。
[0160] 结果如表10所示，模拟临床感染物样品的Orf1ab(RdRP)和N基因扩增产物荧光值均值分别为16997和24084，咽喉拭子样本和空白VTM的Orf1ab(RdRP)和N基因检测结果均分
别小于11和12。验证结果表明，本发明荧光定量检测试剂盒检测结果可靠，具有较高的检测
应用价值。
别小于11和12。验证结果表明，本发明荧光定量检测试剂盒检测结果可靠，具有较高的检测
应用价值。
[0161] 表10临床样本验证测试结果
[0162]