一种筛查糖尿病的联合型代谢标志物的应用及其试剂盒转让专利
申请号 : CN201911218594.2
文献号 : CN112903885B
文献日 : 2022-05-06
发明人 : 许国旺 , 王利超 , 赵欣捷 , 刘心昱 , 路鑫
申请人 : 中国科学院大连化学物理研究所
摘要 :
权利要求 :
1.联合标志物在制备用于诊断糖尿病试剂盒中的用途,其中所述联合标志物包括半乳糖,1,5‑脱水山梨糖醇,N‑乙酰葡糖胺,2‑羟基丁酸;所述试剂盒包括:(1)标准品:半乳糖,1,5‑脱水山梨糖醇,N‑乙酰葡糖胺,2‑羟基丁酸,所述标准品分别用于血清中半乳糖,1,5‑脱水山梨糖醇,N‑乙酰葡糖胺,2‑羟基丁酸的定性和定量标准曲线;
(2)含内标的提取液:用于预处理来自受试者的空腹血清样本,为包含内标的甲醇溶液,其中内标的浓度为0.1‑0.5μg/mL马尿酸‑D5,1.0‑2.0μg/mL谷氨酰胺‑D5,0.1‑1.0μg/mL苯丙氨酸‑D5,0.1‑0.5μg/mL胆碱‑D4;
(3)洗脱液:用于洗脱色谱柱的洗脱液;
其中所述用于色谱柱的洗脱液是用于洗脱Merck ZIC‑cHilic色谱柱的洗脱液;
其中包括的洗脱液包括:
流动相A:含体积百分比0.01‑1.0%乙酸和5‑15mM乙酸铵的乙腈水溶液,其中乙腈和水的体积百分比为80:20‑95:5;和流动相B: 含体积百分比0.01‑1.0%乙酸的5‑15mM乙酸铵水溶液。
2.一种筛查糖尿病的试剂盒,所述试剂盒包括:(1)标准品:半乳糖,1,5‑脱水山梨糖醇,N‑乙酰葡糖胺,2‑羟基丁酸,所述标准品分别用于血清中半乳糖,1,5‑脱水山梨糖醇,N‑乙酰葡糖胺,2‑羟基丁酸的定性和定量标准曲线;
(2)含内标的提取液:用于预处理来自受试者的空腹血清样本,为包含内标的甲醇溶液,其中内标的浓度为0.1‑0.5μg/mL马尿酸‑D5,1.0‑2.0μg/mL谷氨酰胺‑D5,0.1‑1.0μg/mL苯丙氨酸‑D5,0.1‑0.5μg/mL胆碱‑D4;
(3)洗脱液:用于洗脱色谱柱的洗脱液;
其中所述用于色谱柱的洗脱液是用于洗脱Merck ZIC‑cHilic色谱柱的洗脱液;
其中包括的洗脱液包括:
流动相A:含体积百分比0.01‑1.0%乙酸和5‑15mM乙酸铵的乙腈水溶液,其中乙腈和水的体积百分比为80:20‑95:5;和流动相B: 含体积百分比0.01‑1.0%乙酸的5‑15mM乙酸铵水溶液。
说明书 :
一种筛查糖尿病的联合型代谢标志物的应用及其试剂盒
技术领域
人群中糖尿病患者的试剂盒。
背景技术
糖尿病患者最多的国家,若不能及时对其进行干预和治疗则会加大国家公共卫生健康系统
的负担。目前,空腹血糖和口服75g葡萄糖耐量(OGTT)测试是诊断糖尿病的金标准。但是由
于OGTT测试需要在2小时内每隔15‑30分钟进行一次血样的采集、检测,所以整个测试耗时
较长,过程繁琐,不适合于大基数人群中糖尿病患者的快速筛查和诊断。因此开发一种快
速、简便的临床诊断新方法对于提高患者生存质量和降低并发症、死亡率具有重要意义。
系。代谢组学作为一个新兴的工具,已经被广泛运用在不同的疾病研究中,如糖尿病,肝病,
肾病,心血管病等。由于单一代谢物受到外界的干扰和影响较大,所以从血清代谢物中筛选
多种代谢物组合成联合型标志物能够增加判断稳定性和准确率。
种联合型代谢标志物判别受试者中的糖尿病患者。目前尚无将这四种血清代谢物联合作为
糖尿病诊断的报道。
发明内容
述目的,本发明的技术方案如下:
定量标准曲线;
甲醇/乙腈溶液。
5‑15mM乙酸铵水溶液。(2)标准品预处理方法:
液,离心后吸取200‑400μL上清于1.5mL Eppendorf管中进行冷冻干燥,然后用体积百分比
为1:4‑2:1的乙腈/水复溶。
14000rpm,离心时间为5‑15min去除蛋白。离心之后吸取200‑400μL上清于1.5mL Eppendorf
管中进行冷冻干燥。然后用体积百分比为1:4‑2:1的乙腈/水复溶。
谱柱为Merck ZIC‑cHilic色谱柱。
150.1‑131.1,苯丙氨酸‑D5为169.1‑108.1,马尿酸‑D5为183.1‑82.0;正离子质谱模式下检
测的离子对:N‑乙酰葡糖胺为222.1‑137.9,胆碱‑D4为108.1‑60.2。
酸‑D5为1,5‑脱水山梨糖醇的内标,胆碱‑D4为N‑乙酰葡糖胺的内标,马尿酸‑D5为2‑羟基丁
酸的内标。采用内标定量法得到各个代谢物的定量标准曲线。实际血样样本根据标准品的
保留时间,特征离子鉴定出样本其中的半乳糖,1,5‑脱水山梨糖醇,N‑乙酰葡糖胺,2‑羟基
丁酸,并提取其洗脱峰强度,经内标校正后代入到定量标准曲线中计算得到血清样本中各
代谢物的定量浓度。
可用于辅助判断受试者人群中的糖尿病。本发明确定的该联合标志物的对受试者人群中是
否有糖尿病的最佳截点值(cut‑off值)设为0.553。对于受试者人群,P值高于等于该截点值
则判断可能为糖尿病,低于该截点值则表明暂无糖尿病。也可以根据实验者的实验结果通
过二元逻辑回归得到新的方程,并定义该实验室的最佳截点值。截点值的确认依据为根据
联合标志物变量P1值作受试者工作曲线(ROC曲线)。ROC曲线的纵坐标为敏感度,横坐标为
(1‑特异性),计算得到曲线上敏感度与特异性之和最大的点,该点对应的P1值即为最佳截
点值。该点对应的敏感度和特异性即为组合标志物对疾病判别的敏感度和特异性。
在有糖尿病人群中增高,该变量值可用于辅助判断受试者人群中的糖尿病。本发明确定的
该联合标志物的对受试者人群中是否有糖尿病的最佳截点值(cut‑off值)设为0.743。对于
受试者人群,P2值高于等于该截点值的则判断可能为糖尿病,而低于该截点值则表明目前
暂无糖尿病。也可以根据实验者的实验结果通过二元逻辑回归得到新的方程,并定义该实
验室的最佳截点值。截点值的确认依据为根据联合标志物变量P2值作受试者工作曲线(ROC
曲线)。ROC曲线的纵坐标为敏感度,横坐标为(1‑特异性),计算得到曲线上敏感度与特异性
之和最大的点,该点对应的P2值即为最佳截点值。该点对应的敏感度和特异性即为组合标
志物对疾病判别的敏感度和特异性。
的AUC=0.916,敏感度为0.842,特异性为0.877。第二组验证集样本的组合代谢标志物的
AUC=0.883,敏感度为0.923,特异性为0.710。组合代谢物标志物结合空腹血糖的AUC=
0.931,敏感度为0.855,特异性为0.871。
标志物变量P1,再基于确定的截点值,判断所述受试者是否患有糖尿病。也可将代谢标志物
定量浓度与空腹血糖结合,基于二元逻辑回归计算代谢标志物和空腹血糖联合标志物变量
P2,在基于确定的截点值,判断所述受试者是否患有糖尿病。
与之结合将进一步提升诊断效果。
附图说明:
差)。*表示两组间进行非参数比较具有显著性差异,即p<0.05。
差)。*表示两组间进行非参数比较具有显著性差异,即p<0.05。
具体实施方式
定量标准曲线;
mL,0.5μg/mL,0.2μg/mL,0.1μg/mL,50ng/mL,20ng/mL,10ng/mL,5ng/mL,2ng/mL,1ng/mL,
0.5ng/mL,0.2ng/mL,0.1ng/mL;混标溶液加入200μL提取液,离心后吸取200μL上清于1.5mL
Eppendorf管中进行冷冻干燥,然后用体积百分比为1:1的乙腈/水复溶。
15min去除蛋白。离心之后吸取200μL上清于1.5mL Eppendorf管中进行冷冻干燥。然后用体
积百分比为1:1的乙腈/水复溶。
ZIC‑cHilic色谱柱。
131.1,苯丙氨酸‑D5169.1‑108.1,马尿酸‑D5183.1‑82.0;正离子质谱模式下检测的离子
对:N‑乙酰葡糖胺为222.1‑137.9,胆碱‑D4为108.1‑60.2。
酸‑D5为1,5‑脱水山梨糖醇的内标,胆碱‑D4为N‑乙酰葡糖胺的内标,马尿酸‑D5为2‑羟基丁
酸的内标。采用内标定量法得到各个代谢物的定量标准曲线。实际血样样本根据标准品的
保留时间,特征离子鉴定出样本其中的半乳糖,1,5‑脱水山梨糖醇,N‑乙酰葡糖胺,2‑羟基
丁酸,并提取其洗脱峰强度,经内标校正后代入到定量标准曲线中计算得到血清样本中各
代谢物的定量浓度。
例)的空腹血清样本,置于‑80℃冰箱保存备检。
氨酸‑D5,0.31μg/mL胆碱‑D4),涡旋30s混合均匀,沉淀蛋白。采用离心机过滤(转速为
14000rpm,时间为15min)的方式去除蛋白。离心之后吸取200μL上清于1.5mL Eppendorf管
中进行冷冻干燥。然后用50μL乙腈:水=1:1(v/v)复溶。
50mm,3.5μm,进样体积为1μL。流动相:A相为0.02%(v/v)乙酸的10mM乙酸铵95%(v/v)乙腈
水溶液,B相为0.02%(v/v)乙酸的10mM乙酸铵水溶液;洗脱梯度为:0~6.0min,从95%A(v/
v)梯度线性减少至45%A(v/v),6.0~7.0min,保持45%A(v/v),7.0~7.1min,从45%A(v/
v)线性增加至95%A(v/v),7.1~11min,维持95%A(v/v)的梯度平衡系统;
速为50(in arbitrary units),靶向扫描时间为0.8s,离子对检测窗口为1min。
糖尿病前期和糖尿病)的血清中半乳糖,N‑乙酰葡糖胺,2‑羟基丁酸含量显著上升,而血清
中1,5‑脱水山梨糖醇的含量显著下降。
可用于辅助判断受试者人群中的糖尿病患者。
大时,可获得当前最佳截点值,即0.553。敏感度为0.923,特异性为0.708。
在有糖尿病人群中增高,该变量值可用于辅助判断受试者人群中的糖尿病。
大时,可获得当前最佳截点值,即0.743。敏感度为0.842,特异性为0.877。该结果表明代谢
标志物可与空腹血糖互补,增加诊断的特异性。
例)的空腹血清样本,置于‑80℃冰箱保存备检。
胺,2‑羟基丁酸的定量浓度(μg/mL)和空腹血糖的浓度(mmol/L)分别代入对应的回归方程,
其结果如图4和表1所示,其AUC、灵敏度及特异性均较高,组间判别效果较好。且测试集中该
组合标志物和空腹血糖具有很好的互补性,联合使用时有助于提高诊断糖尿病的能力。
合标志物变量P值,再基于确定的截点值,判断所述受试者是否患有糖尿病。所述试剂盒可
实现高灵敏度,高通量快速检测本发明涉及的四种代谢标志物,具有检测成本低,重复性好
等特点。本发明可应用于辅助快速筛查受试人群中糖尿病患者以及和传统的临床指标空腹
血糖互补,具有较好的应用前景。