p276-00在制备防治噪声性听力损失的药物中的应用

摘要

本发明公开了Riviciclib hydrochloride(p276‑00)在制备防治噪声性听力损失的药物中的应用，涉及医药领域，用于解决现有用于预防和治疗噪声性听力损失的药物稀少的问题。通过运用噪声性听力损失的动物模型实验方法，检测噪声暴露后小鼠的听力和内毛细胞功能等，发现Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对噪声暴露时的内毛细胞突触数量和功能具有良好的保护效果，直观地验证了Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对噪声性听力损失的防治作用，能够用于制备防治噪声性听力损失的药物，具有良好的研究和应用前景。

权利要求

1.p276‑00在制备防治噪声性听力损失的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的p276‑00单独使用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的p276‑00以药物组合物的形式使用。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为p276‑00和药物辅料制成的药物制剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂的剂型包括固体剂型和液体剂型。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的固体剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、膜剂、胶剂、膏剂或粉剂。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的液体剂型包括注射液、合剂、口服液、糖浆剂、酒剂、溶胶剂或乳剂。

说明书

p276‑00在制备防治噪声性听力损失的药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及Riviciclib hydrochloride(p276‑00)的新用途，更具体地，涉及Riviciclib hydrochloride(p276‑00)在制备防治噪声性听力损失的药物
中的应用。

背景技术

[0002] 噪声性聋是最常见的获得性感音神经性听力损失之一，目前全球约12％以上人口有噪声性听力损失的风险。随着生活中交通噪声和娱乐噪声等暴露越来越普遍，噪声暴露
后内毛细胞与传入神经之间带状突触损伤往往起病隐匿，其不仅会加速老年性聋的发生，
还会增加痴呆的发生风险，已成为严重的潜在健康威胁，造成了严重的社会问题和经济负
担。噪声暴露诱导的内毛细胞带状突触损伤是噪声性聋早期的病理表现，这为防治噪声性
听力损失提供了一个重要突破口，此外，内毛细胞带状突触损伤也是老年性聋和药物性聋
常见的病理改变，因此，对带状突触损伤进行有效干预可能成为治疗和预防听力损失的重
要手段。

[0003] 目前，临床上尚无有效的药物来预防和治疗噪声性内毛细胞带状突触损伤。在基础科学研究中仅仅报道谷氨酸拮抗剂、神经营养因子、钙通道阻滞剂、抗氧化剂、抗炎药物
及血管扩张剂等对噪声性听力损失的防治作用，但效果不佳且均不能防止噪声引起的内毛
细胞带状突触损伤。

[0004] 内毛细胞是一感觉神经细胞，负责将声波的机械信号转换电信号。内毛细胞带状突触具有编码声音信息和感知声源定位的作用，也是感音神经性聋最常见的病变部位。因
此带状突触损伤后可出现言语编码能力降低甚至听觉阈值升高。细胞周期是细胞生命活动
的基本过程，细胞的增生、分裂、变性、坏死、凋亡等都发生在它所处的细胞周期的某一时
相。因此，细胞周期与疾病的发生发展存在密切联系。以往观点认为，成熟的神经细胞是终
末分化不再增殖的细胞。目前越来越多的研究发现，在病理情况下可引起终末分化的神经
细胞周期非正常激活，神经细胞将走向死亡而不是增殖。虽然在不同的神经系统疾病中有
多种细胞周期机制的参与，但神经细胞异常进入细胞周期而导致神经细胞损伤是许多获得
性和神经退行性疾病的共同病理机制之一。

[0005] Riviciclib hydrochloride(p276‑00)是一种CDK1，4，9抑制剂，是目前做完三期临床试验的细胞周期抑制药物。然而，经查阅国内外相关文献，仅见Riviciclib 
hydrochloride(p276‑00)抑制肿瘤的研究报道，而未见有关 Riviciclib hydrochloride
(p276‑00)对保护噪声性听力损失作用方面的研究报道。

发明内容

[0006] 本发明针对现有用于预防和治疗噪声性听力损失的药物稀少的问题，目的在于提供Riviciclib hydrochloride(p276‑00)在制备防治噪声性听力损失的药物中的应用。

[0007] 优选地，所述的Riviciclib hydrochloride(p276‑00)单独使用。

[0008] 优选地，所述的Riviciclib hydrochloride(p276‑00)以药物组合物的形式使用。

[0009] 优选地，所述的药物为Riviciclib hydrochloride(p276‑00)和药物辅料制成的药物制剂。

[0010] 进一步地，所述药物制剂的剂型包括固体剂型和液体剂型。

[0011] 所述的固体剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、膜剂、胶剂、膏剂或粉剂。

[0012] 所述的液体剂型包括注射液、合剂、口服液、糖浆剂、酒剂、溶胶剂、乳剂或滴眼剂。

[0013] 相对于现有技术，本发明的有益效果是：

[0014] 本发明运用噪声性听力损失动物模型，发现Riviciclib hydrochloride (p276‑00)对噪声暴露时的内毛细胞突触的数量和功能具有良好的保护效果，直观地验证了
Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对噪声性突触损伤的防治作用，能够用于制备防治
噪声性听力损失的药物。

附图说明

[0015] 图1为对照组和P50组噪声暴露前和噪声暴露后第1天、第14天小鼠听力ABR检测结果；其中：

[0016] A‑C为对照组噪声暴露前后听力阈值变化及ABR I波波幅变化示意图；

[0017] D‑F为P50组噪声暴露前后听力阈值变化及ABR I波波幅变化示意图；

[0018] G，K为对照组噪声暴露后第14天在8.0kHz和16.0kHz的ABR I波波幅大小变化；

[0019] H，L为实验组噪声暴露后第14天在8.0kHz和16.0kHz的ABR I波波幅大小变化；

[0020] J，M为噪声暴露前和噪声暴露后第14天对照组与实验组ABR I波波幅相对变化值(PND14/Pre)的比较。

[0021] 图2为P10、P30组噪声暴露前后小鼠听力ABR检测结果，其中：

[0022] A为P10组小鼠噪声暴露前后听力阈值的变化；

[0023] B为P10组噪声暴露后第14天在16.0kHz的ABR I波波幅大小变化；

[0024] C为P30组小鼠噪声暴露前后听力阈值的变化；

[0025] D为P30组噪声暴露后第14天在16.0kHz的ABR I波波幅大小变化。

[0026] 图3为噪声暴露后第14天对照组和P50组小鼠内毛细胞突触数量的变化。

[0027] 图4为膜片钳记录毛细胞的钙电流和膜电容图，其中：

[0028] A为记录到的P50组与对照组的钙电流示意图；

[0029] B为P50组与对照组小鼠的内毛细胞的最大钙电流(Imax)；

[0030] C为去极化至‑14mv，时程为200ms记录到的钙电流与膜电容变化示意图；

[0031] D为给予不同去极化时间时P50组与对照组小鼠的ΔCm对比；

[0032] E为P50组与对照组小鼠在给予不同去极化时间时的QCa对比。

具体实施方式

[0033] 以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

[0034] 我们经过研究发现，噪声暴露后基因表达变化主要富集在“细胞周期信号通路”上，通过qPCR验证发现噪声暴露后CDK1，Cyclin B表达上调。因此，推断噪声性听力损失与
CDK1的活化相关。

[0035] Riviciclib hydrochloride(p276‑00)是一种CDK1，4，9抑制剂，因此本发明提供了一种Riviciclib hydrochloride(p276‑00)的新用途，即Riviciclib hydrochloride
(p276‑00)在制备防治噪声性听力损失的药物中的应用。

[0036] 本发明所述的Riviciclib hydrochloride(p276‑00)在制备防治噪声性听力损失的药物时，可单独使用；也可以药物组合物的形式使用；也可以和药物辅料制成的药物制
剂，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、膜剂、胶剂、膏剂、粉剂、注射液、合剂、口服液、糖浆
剂、酒剂、溶胶剂、乳剂或滴眼剂等多种形式。

[0037] 本发明通过小鼠噪声性隐性听力损失小鼠模型实验，评价Riviciclibhydrochloride(p276‑00)对噪声性突触损伤的影响，结果发现Riviciclib hydrochloride
(p276‑00)对噪声暴露时的内毛细胞突触的数量和功能具有良好的保护效果，直观地验证
了Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对噪声性听力损失的防治作用。

[0038] 下面对本发明的实验过程及实验结果进行详细说明，从而详细阐述 Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对噪声性听力损失的防治作用，能够用于制备防治噪声性听力损
失的药物。

[0039] (一)实验材料

[0040] 1.试剂

[0041] Riviciclib hydrochloride(p276‑00)溶液：精密称取适量Riviciclibhydrochloride(p276‑00)，加超纯水溶解，配成质量浓度为100mg/ml、300 mg/ml和500mg/
ml的储备液，‑80℃贮存备用。

[0042] 2.动物

[0043] 选取4周龄的CBA/caJ雄性小鼠(上海)若干，排除中耳及内耳疾病，并进行ABR听阈检测，筛选ABR听阈正常小鼠作为实验对象。实验动物饲养维持在室温24℃，给与充足的水
和食物，黑白周期为12小时，环境噪声小于40dB SPL。所有实验操作均得到上海交通大学医
学院动物伦理委员会的批准。

[0044] (二)实验方法

[0045] 1.动物分组及处理

[0046] 实验动物随机分为4组，包括：

[0047] 对照组，对照组小鼠腹腔注射与实验组小鼠同等容积的生理盐水。

[0048] 实验组，又分为P10组，P30组和P50组，其中：P10组，给药剂量为 10mg/g；P30组，给药剂量为30mg/g；P50组，给药剂量为50mg/g。采用腹腔给药的方式，在噪声暴露前2～3小时
各组进行腹腔注射给药，噪声暴露后第1天至第6天，每天给药一次。

[0049] 2.实验动物噪声暴露

[0050] 将所有实验小鼠置于铁网笼子不同的间隔中，小鼠可在笼子间隔中自由活动。将扬声器至于笼子正上方顶端。噪声信号由实时信号处理器(TDT系统)产生。在每次噪声暴露
前都要对扬声器的声音进行校准，校准时声级计的探头是置于笼内进行的，声音在笼子内
各部位的声强变化<1dB。噪声暴露时采用频率为2‑20kHz，声强为103dB SPL的噪声进行暴
露，暴露时间为2 小时。

[0051] (三)检测

[0052] 1.听力脑干反应(Auditory brainstem response，ABR)

[0053] 噪声暴露前和噪声暴露后1天、14天分别测量基础值和噪声暴露后听力阈值的变化情况。具体方法：选取各组的实验小鼠并称重，腹腔注射5％水合氯醛进行麻醉。当小鼠呼
吸缓慢平稳、角膜反射和耳廓疼痛反射消失并无打嗝现象则表明麻醉适度。将麻醉后的小
鼠至于恒温垫上，设置温度为37℃，并根据小鼠肛温进行调节，以确保ABR测量的准确性并
防止小鼠麻醉后因体温下降而引起死亡。ABR测试的给声方式为开放声场，扬声器位于小鼠
正前方，距离双耳连线中点10cm处。将记录电极置于小鼠颅顶正中皮下，参考电极置于乳突
区皮下，接地电极置于上肢肩部皮下。ABR TDT系统刺激声频率为4.0、5.6、8.0、11.3、16.0、
22.6和32.0kHz的短纯音，刺激速率为 10次/s，刺激持续时间为5ms，上升和下降时间均为
1ms，重复速率21次 /s，滤波带宽100～3000Hz，叠加次数为400；给声强度从90dB SPL开始，
按5dB SPL递减，直至各个波形消失前定义为听力阈值。在接近阈值时，一般要重复检测两
次以上比较波形是否一致。各指标均由测试仪器所附软件实时显示、记录、计算和存储。

[0054] 2.耳蜗基底膜免疫荧光染色计数内毛细胞带状突触数量

[0055] 处死实验小鼠并快速取出耳蜗，用4％多聚甲醛充分固定。解剖基底膜，去除盖膜和前庭膜，进行内毛细胞带状突触相关蛋白(Ribbon，GluA2)免疫荧光染色。采用Zeiss LSM 
880激光共聚焦对标本进行层扫(Z‑step 0.38μm)，并计数每个内毛细胞中带状突触的数
量。

[0056] 3.膜片钳检测内毛细胞带状突触功能

[0057] (1)拉制玻璃电极

[0058] 用垂直拉制仪，拉制电阻为5～6MΩ的玻璃电极。加热石蜡至融化，在显微镜下将蜡涂抹于玻璃电极尖端，并检查尖端的完整性。

[0059] (2)配置膜片钳记录所用细胞外液和细胞内液

[0060] 细胞外液(mM)：NaCl 130，KCl 2.8，CaCl2 10，MgCl2 1，HEPES 10，和D‑glucose 10。用NaOH调节pH值至7.40，用D‑glucose调节细胞外液渗透压至300mOsm。

[0061] 细胞内液(mM)：Cs‑methanesulfonate 135，CsCl 10，TEACl 10，HEPES 10，EGTA2，Mg‑ATP 3和Na‑GTP 0.5。用CsOH调节pH 值至7.20，用CsCl 调节细胞内液渗透压至
290mOsm。将配置好的细胞内液用0.22μm的微孔滤器过滤并分装300μl/EP，放置在‑20℃冰
箱中保存。

[0062] (3)膜片钳记录方法

[0063] 过量麻醉处死小鼠后，迅速解剖耳蜗基底膜并将其转移至含有细胞外液的膜片钳记录槽中。在膜片钳系统的正置显微镜(60X)下找到目的细胞并提升物镜。将细胞内液注入
到玻璃电极中，用电极夹持臂夹持玻璃电极，并在电极入水前给予正压。在显微镜的指引
下，推进电极至目的细胞处，待正压将细胞吹出凹陷时，撤掉正压并给予一定的负压，使细
胞与玻璃电极达到高阻封接(>1GΩ)。给予一个较大的负压，吸破细胞膜形成Whole‑cell模
式。

[0064] 给予‑80mV到+30mV的去极化刺激并记录内毛细胞钙电流。得到数据后将不同电压下的钙电流减去其对应电压的漏电流即可算得I‑V曲线，I‑V 曲线中电流峰值即为最大钙
电流Imax。给予一去极化至‑14mV的刺激并记录不同去极化时间(50，100和200ms)内毛细胞
膜电容的改变(ΔCm)以及刺激过程中电荷的变化(QCa)。

[0065] (四)统计方法

[0066] 实验数据结果使用mean±SEM表示，应Prism和Igor进行统计学分析和作图。使用one‑way或two‑way ANOVA followed by Bonferroni post‑hoc test 或者使用unpaired 
Student’s t‑test(数据同时符合正态分布和方差齐，如果不符合则用Mann‑Whitney U 
test)。以P<0.05定义为差异有统计学意义。

[0067] (五)实验结果

[0068] 1.Riviciclib hydrochloride对噪声暴露后小鼠ABR的影响

[0069] 如图1所示，首先通过检测对照组和P50组小鼠噪声暴露前后ABR的变化，反映Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对噪声性突触损伤的功效。结果显示，对照组和P50
组小鼠噪声暴露后第1天听力阈值上移，在第14天时阈值恢复(图1的A，D)，但ABR I波波幅
变化图显示对照组ABR I波波幅未见明显恢复(图1的B，C)，这说明我们成功构建了噪声性
隐性听力损失动物模型(内毛细胞带状突触损伤动物模型)。

[0070] ABR I波波幅主要反映了耳蜗传入神经纤维的兴奋性的大小，因此，在听力阈值恢复后分别分析了实验小鼠噪声暴露后第14天在8.0kHz和16.0 kHz的ABR I波波幅大小。结
果发现，对照组小鼠的ABR I波波幅并未完全恢复，这表明噪声对内耳突触造成了损伤(图1
的G，K)；然而，P50组在噪声暴露后第14天时ABR I波波幅完全恢复，表明在噪声暴露时
Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对突触具有保护作用(图1的H，L)。

[0071] 如图2所示，进一步地通过P10组和P30组实验验证Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对突触的保护作用。结果显示，当给药剂量分别为 10mg/g和30mg/g时，实验小鼠
同样地在噪声暴露后第14天恢复听力阈值 (图2的A，C)；然而两组的ABR I波波幅均未完全
恢复，其中，当给药剂量为10mg/g剂量时未表现出对带状突触的保护作用，但当给药剂量为
30 mg/g时，已表现出一定的带状突触保护作用(图2的B，D)。

[0072] 2.Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对噪声暴露后小鼠内毛细胞突触数量的影响

[0073] 如图3所示，计数噪声暴露前、对照组和P50组噪声暴露后内毛细胞突触数量的变化。结果显示，对照组在噪声暴露后出现了内毛细胞带状突触数量下降的现象，而P50组的
内毛细胞带状突触数量与噪声暴露前无明显差异，表明Riviciclib hydrochloride(p276‑
00)对带状突触具有保护性作用。

[0074] 3.Riviciclib hydrochloride(p276‑00)对噪声暴露后小鼠内毛细胞钙电流和突触囊泡释放能力的影响

[0075] 如图4所示，本实验记录对照组和P50组噪声暴露后第14天的内毛细胞功能。我们使用‑80mV到+30mV的去极化刺激并记录内毛细胞钙电流(图 4的A)，结果显示，对照组噪声
暴露后第14天内毛细胞最大钙电流显著下降，然而，P50组内毛细胞最大钙电流未见明显下
降(图4的B)。

[0076] 进一步地，记录了内毛细胞的突触囊泡释放功能。内毛细胞去极化可触发突触通过胞吐作用释放神经递质。胞吐过程中囊泡与细胞膜的融合增加了细胞膜面积，从而使得
细胞膜电容增加。而刺激前后膜电容的增加量(ΔCm) 反映了递质的释放量。我们给予内毛
细胞一去极化至‑14mV的刺激，改变去极化时间(50，100和200ms)并记录内毛细胞膜电容的
改变(ΔCm)以及钙电荷的变化(QCa)(图4的C)，结果显示，噪声暴露后对照组的囊泡释放功
能和钙电荷显著下降，而P50组的囊泡释放功能和钙电荷与噪声暴露前无明显差异(图4的
D，E)，表明Riviciclib hydrochloride(p276‑00)保护了内毛细胞带状突触的功能。

[0077] 综上所述，Riviciclib hydrochloride(p276‑00)能有效保护噪声暴露时内毛细胞带状突触的数量与功能，能够用于制备防治噪声性听力损失的药物。

[0078] 尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的
多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。