熊果酸衍生物在制备抗肾病变药物中的应用

摘要

本发明属于医药领域，公开了一类熊果酸衍生物或其药学上可成的盐及其在制备抗肾病变药物中的应用。本发明利用微生物转化技术，对熊果酸成功地进行了结构修饰，获得了多个具有母核结构修饰的新型熊果酸衍生物，通过体外TGF‑β1诱导的HK‑2细胞试验证实，这些化合物具有较好的保护HK‑2细胞损伤作用。可以作为预防或治疗肾病药物的活性成分，具有广泛的用途。

权利要求

1.下列任一结构式所示的熊果酸衍生物或其药学上可成的盐在制备抗肾病变药物中的应用，

所述肾病变选自慢性肾炎或肾硬化。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括活性成分和药学上可以接受的载体，所述活性成分选自结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ和式Ⅳ的熊果酸衍生物或其药学上可成的盐中的一种或几种，

说明书

熊果酸衍生物在制备抗肾病变药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及熊果酸衍生物在制备抗肾病变药物中的应用。

背景技术

[0002] 肾脏纤维化是各种原因的慢性肾脏疾病发展到后期的共同病理学表现，是造成CKD的主要原因。肾脏纤维化的病理特征主要表现为肾间质细胞外基质包括胶原纤维、纤维
粘连蛋白的大量堆积，伴随炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞凋亡、丢失，纤维细胞及肌成纤
维细胞增生，肾小管管周血管稀疏化改变，最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化，肾功
能丧失。在此病理生理过程中，肾细胞凋亡起着非常重要的作用。细胞凋亡异常主要包括间
质成纤维细胞的凋亡减少和肾小管上皮细胞的凋亡增加，分别对应着形态学上的肾间质纤
维化和肾小管扩张、萎缩。肾小管上皮细胞凋亡可能是纤维化肾脏萎缩的重要原因，故能够
调控肾细胞凋亡特别是抑制肾小管上皮细胞凋亡的药物，就极可能对肾纤维化具有实际的
治疗作用。

[0003] 熊果酸又名乌索酸，是一类结构比较特殊的五环三萜类成分，存在于多种中草药，如山茱萸、女贞子和五味子等。现代药理研究发现，熊果酸具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降糖、
抗肝纤维化等作用。此外，近年来亦有许多关于熊果酸神经保护作用的研究。在化学结构修
饰方面，熊果酸的化学合成衍生物在抗肿瘤方面的研究较为丰富，化学结构修饰的位点主
要为熊果酸3位的羟基和28位的羧基。但是，由于五环三萜类化合物结构的特殊性，母核缺
乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以获得母核上具有羟基、羰基等修饰的
衍生物。因此，具有母核结构修饰的熊果酸衍生物化学和药理研究尚不全面。目前，熊果酸
衍生物的抗肾纤维化活性研究报道较少。

[0004] 微生物转化是利用生物体自身特异性的酶体系进行的酶催化反应，因此反应的类型多，并具有高度立体及区域选择性，成为了有机合成中的一个重要工具。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的是提供熊果酸衍生物在制备抗肾病变药物中的应用，具体提供了熊果酸衍生物或其药学上可成的盐在制备抗肾病变药物中的应用，肾病变为与肾
纤维化有关的疾病，如慢性肾炎、肾硬化或肾癌，这些熊果酸衍生物对TGF‑β1诱导的HK‑2细
胞具有良好的保护作用，具有较好的抗肾纤维化活性。本发明中，熊果酸衍生物为结构式为
式Ⅰ‑式Ⅳ的化合物：

[0006]

[0007] 本发明还提供了上述熊果酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：

[0008] 1)发酵培养微生物，向培养基中加入熊果酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为卷霉(Circinella)属的菌株；优选采用蝇卷霉Circinella muscae 
CGMCC 3.2695。

[0009] 2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物；

[0010] 3)将所述转化粗提物用反相高效液相色谱纯化，得到产物。

[0011] 上述方法步骤1)中培养基中熊果酸的浓度为2‑5000μg/mL。

[0012] 上述方法步骤2)中萃取溶剂为常规机型有机溶剂，优选乙酸乙酯。

[0013] 上述方法步骤3)优选反相高效液相色谱制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS‑A，10.0I.D×250mm，乙腈‑水(45:55，V/V)，流速2.5mL/min，检测波长203nm。

[0014] 本发明通过实验证实，本发明所述熊果酸衍生物具有良好的抗肾纤维化活性，可以作为抗肾病变药物的活性成分。这些抗肾病变药物的活性成分可以是选自结构式为式Ⅰ、
式Ⅱ、式Ⅲ和式Ⅳ的化合物中的一种或几种。

[0015] 在以上述化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩
解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制
备。

[0016] 本发明利用微生物转化技术，对熊果酸成功地进行了结构修饰，获得了一类新的熊果酸衍生物，通过体外细胞试验证实，这些熊果酸衍生物对TGF‑β1诱导的HK‑2细胞具有
良好的保护作用，可以作为制备预防或治疗肾病药物的活性成分，具有广泛的用途。

附图说明

[0017] 图1为本发明所述熊果酸衍生物的HPLC液相色谱图。

具体实施方式

[0018] 实施例1、结构式为式Ⅰ‑式Ⅳ的化合物的制备

[0019] 本发明采用微生物转化方法，以熊果酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。卷霉(Circinella)属的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中
心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。

[0020] 以蝇卷霉Circinella muscae CGMCC 3.2695为例，制备结构式为式Ⅰ‑式Ⅵ的化合物的过程如下：

[0021] 1)发酵、转化以及萃取

[0022] 将蝇卷霉Circinella muscae CGMCC 3.2695接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺
盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)
中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入25mg熊果酸(0.2mL，125mg/mLDMSO溶液)，共用500mg底
物。相同条件下继续转化5天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3
次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.83g。

[0023] 2)反相高效液相色谱纯化

[0024] 合并组分用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS A‑5μm，10.0×250mm，乙腈‑水(45:55，V/V)，流速2.5mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式Ⅰ‑式
13
Ⅳ的化合物4个转化产物，色谱图如图1所示，其 C‑NMR数据如表1所示。

[0025] 表1.化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的碳谱数据(氘代吡啶)

[0026]

[0027]

[0028] 以上结果表明，所得化合物结构正确。

[0029] 实施例2本发明化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ和化合物Ⅳ对TGF‑β1诱导HK‑2细胞的保护作用。

[0030] 1)实验材料

[0031] CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio‑TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；流式细胞仪(Thermo)、RPM I 1640培养基(Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基
亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)、TGF‑β1、HK‑2细胞。

[0032] 测试样品：实施例1所合成得到的化合物Ⅰ–Ⅳ，纯度在95％以上，各化合物均以DMSO溶解后稀释。

[0033] 2)实验方法

[0034] 采用采用流式细胞仪测定细胞凋亡率(三次独立实验，mean±SD)：取对数生长期5
的HK‑2细胞，用含10％小牛血清的RPM I 1640培养液调整细胞浓度为5×10/mL，接种于96
孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组
只加入RPM I 1640全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养
箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，继续培养24h后，采用流式细胞仪测定细胞凋亡率
(三次独立实验，mean±SD)。

[0035] 3)实验结果

[0036] 流式细胞仪测定细胞凋亡率，结果如表2所示。

[0037] 表2.测试样品对TGF‑β1诱导HK‑2细胞凋亡率的影响

[0038]分组 凋亡率(％)
空白对照组 2.6±0.7
TGF‑β1(10ng/mL)组 58.4±3.5
TGF‑β1+10mg/L化合物Ⅰ组 25.5±2.7
TGF‑β1+20mg/L化合物Ⅰ组 19.7±1.6
TGF‑β1+40mg/L化合物Ⅰ组 5.4±1.3
TGF‑β1+10mg/L化合物Ⅱ组 34.2±1.8
TGF‑β1+20mg/L化合物Ⅱ组 20.2±1.4
TGF‑β1+40mg/L化合物Ⅱ组 14.8±1.1
TGF‑β1+10mg/L化合物Ⅲ组 41.4±1.8
TGF‑β1+20mg/L化合物Ⅲ组 22.1±1.6
TGF‑β1+40mg/L化合物Ⅲ组 12.4±1.2
TGF‑β1+10mg/L化合物Ⅳ组 30.1±1.4
TGF‑β1+20mg/L化合物Ⅳ组 22.5±1.9
TGF‑β1+40mg/L化合物Ⅳ组 13.3±1.2

[0039] 结果表明，本发明的化合物Ⅰ–Ⅳ对TGF‑β1诱导HK‑2细胞凋亡具有良好的保护作用，可以作为肾病变药物的活性成分。

[0040] 本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有
各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围
由所附的权利要求书及其等效物界定。