利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法转让专利
申请号 : CN202011171884.9
文献号 : CN112931102B
文献日 : 2022-04-12
发明人 : 柏斌 , 姚栋萍 , 吴俊 , 罗秋红 , 庄文 , 肖贵
申请人 : 湖南杂交水稻研究中心
摘要 :
权利要求 :
1.一种利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法,其特征在于,所述利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法包括:筛选不同品种不同播期变异系数大,且在灌浆期高温和适温两种温度条件下方差显著的稻米淀粉理化指标作为关键指标;
以关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析,得到彼此独立的淀粉综合理化指标;
通过SPSS软件求出各品种淀粉综合理化指标的综合得分及隶属函数值求出耐高温综合评价值来定性评价不同品种的耐高温水平;
以关键淀粉理化指标胁迫指数为自变量,以耐高温综合评价值为因变量,做回归方程,定量评价各品种的高温耐受性;
通过定性和定量评价是否统一来综合评价不同水稻品种的高温耐受性 ,如统一,即可判定一组水稻品种高温耐受性的强弱顺序 ,如定性和定量结果不统一,即需要进一步的判定,即将不一致的水稻品种单独列为一组,再进行定量定性评价;
所述稻米淀粉理化指标的测定方法,包括:(1)加工品质的测定:测产样品收获后,在室温条件环境内、阴凉通风处储藏3个月以平衡水分后,称量140g净稻谷使用稻谷砻谷机加工糙米并称重,计算糙米率;然后每份取100g糙米用精米机加工成精米并称重,计算精米率;利用图像分析软件SC‑E分析得到整精米率;
(2)外观品质的测定:垩白度采取改良的扫描法测定,通过扫描仪得到整精米的扫描图像;然后用图像分析软件SC‑E分析整精米的扫描图像,识别垩白粒的数量和面积;统计计算其垩白度、粒长、粒宽、长宽比的指标;
(3)淀粉的提取及直链淀粉含量测定;
(4)热力学特性的测定:精确称取淀粉10mg于氧化铝坩埚中,加入30μL无菌水,密封氧化铝坩埚,室温平衡24h后,使用差示扫描量热仪对样品进行糊化特性测试;设置仪器以10℃/min的速度,由30℃升温至95℃,扫描热量变化;
(5)粘度特性的测定;
(6)淀粉颗粒形貌和粒径大小分布的观察:用导电双面胶将淀粉粉末固定在金属样品平台,真空镀膜然后置于扫描电镜,以10Kv电子束观察收集具有代表性的淀粉颗粒形貌照片;称取样品100‑200mg于干净EP管中,加入1ml 75%酒精,涡旋混匀后超声混匀;将混匀后的样品加入到Mastersizer 3000进行粒度分布测定,每样测定三次,收集数据;
(7)晶体结构的测定:利用X‑射线衍射测定分析淀粉的晶体结构,将不同品种的淀粉样品平铺到样品池上,然后置于XRD测试平台上;其中,测定条件:钨灯λ=0 .15406nm,功率
1600W40kV×30mA,扫描速率4°/min,扫描范围4‑35°;使用软件Jade5 .0计算测定样品的相对结晶度;
(8)水溶性指数和膨胀力的测定;
(9)数据统计分析:所得测定结果采用其平均值±标准偏差的形式,采用SPSS 24 .0统计软件对所得结果进行方差分析,主成分分析和构建回归方程,差异显著性分析采用Ducan法,P<0 .05表示差异显著;
步骤(3)中,所述淀粉的提取及直链淀粉含量测定方法,包括:a .淀粉的提取将干燥的精米在含有0 .14%的亚硫酸氢钠溶液水中浸泡过夜固液比
1:5‑1:10;加入用足量的0 .14%的亚硫酸氢钠,用均浆机将精米研磨;将精米浆液过200目的尼龙网,将精米过滤后的浆液收集到离心瓶内;尼龙网用超纯水冲洗两次,将滤液与精米过滤后的浆液混合;3000r/min离心20min,倒掉上清;用超纯水再次悬浮淀粉后,3000r/min离心20min,倒掉上清;重复上一步3次;将淀粉晾干,结块后取出,放在55度烘箱快速烘干;
将淀粉块用粉碎机粉碎,过200目筛子;干燥器保存;
b .直链淀粉含量的测定通过在720nm处测定与碘反应的淀粉样品的吸光值来测定其中直链淀粉的含量;其中以土豆直链淀粉和玉米支链淀粉含量作为标准样品制作标准曲线,直链淀粉含量根据标准曲线获得;
步骤(5)中,所述粘度特性的测定方法为:取一定量的米粉或淀粉样品于快速粘度仪专用的圆筒形铝盒,加入25mL ddH2O,配成以干基计、浓度为6%的米粉或淀粉乳;
最初以960rpm的速度搅拌10s,然后减小到160rpm的速度旋转至测定结束;
其中,测定条件如下:50℃下保持1min,然后以12℃/min升温到95℃,在95℃保持2min,再以12℃/min速度降温到50℃,在50℃保持2min;
步骤(8)中,所述水溶性指数和膨胀力的测定方法为:称取淀粉100mg至于一玻璃试管内,向试管内加入10ml的超纯水,充分悬浮震荡,95℃水浴30分钟,每隔5分钟,充分震荡一次;
试管冷却到室温之后,3000g离心20分钟,上清液倒入一次性培养皿中,剩下的固体胶状物,称量重量,记为Ws;
培养皿中的上清液置于100℃烘箱内,烘干至恒重,记为W1;膨胀力用SP表示,单位为g/g,水溶性指数用WSI表示;
计算公式如下:
WSI=W1/0 .1×100%;
SP=Ws/[0 .1×(100%‑WSI)]。
说明书 :
利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法
技术领域
背景技术
了更高的要求,育种家也将育种目标由过去单纯提高产量转移到在保证水稻产量稳步增长
的基础上提高稻米品质,培育具有优良品质的水稻品种成为了中国水稻育种工作的重要目
标。
高1.8℃‑4.5℃,温度的持续升高已经成为影响全球粮食作物生产的主要因素,威胁着世界
粮食的产量安全和品质安全。全球气候变暖导致水稻生长季温度升高,尤其水稻生长过程
中的开花期和灌浆结实期对温度最为敏感,灌浆期遭受过高的温度将严重影响稻米品质。
在全球气候变暖的高温条件下如何进一步改良稻米品质,培育优质并且耐高温的水稻品种
以满足人们日益增长的对稻米品质的要求是本发明面临的重大挑战。
即直链淀粉和支链淀粉,其中直链淀粉一直被公认为评价稻米品质的重要指标。据实验,在
一定范围之内,直链淀粉含量越高,米饭质地越硬,相反,直链淀粉含量越低,米饭质地越
软。但是也有些品种的直链淀粉含量相似,但米饭质地却相差甚远,这主要是因为,米饭的
质地在受直链淀粉的影响的同时,也与支链淀粉的链长分布密切相关。不同质地的稻米,其
淀粉的链长分布也不同,一般淀粉的长链(来自直链淀粉、支链淀粉或者中间型淀粉)越长、
越多,米饭质地越硬,米饭表现越干。
化特性、结晶度、黏度特性、膨胀力和水溶性指数。影响淀粉结晶度的因素主要是直链淀粉、
直链淀粉短侧链与长侧链之间的比例。稻米淀粉具有热力学特性,主要是指淀粉在糊化过
程中发生的热力学变化的特性,其一般利用差示扫描热量仪(DSC)来测定,测定的指标通常
为淀粉的糊化温度(起始温度、峰值温度、终止温度)和糊化焓,峰的面积则为糊化所需要的
焓变(J/g)。糊化特性是淀粉蒸煮食味品质的重要指标,反应了稻米在蒸煮时的难易程度。
稻米淀粉具有黏度特性,是决定稻米蒸煮食味品质的重要指标之一,一般采用快速粘度分
析仪(RVA)测定淀粉的黏度特性。RVA谱是指米粉浆或者淀粉匀浆在加热、高温和冷却的过
程中黏度随着温度变化而形成的曲线,其特征值在稻米食味品质评价中具有重要的应用价
值,主要包含峰值粘度(PV)、谷值粘度(HPV)、冷胶黏度(CPV)、崩解值(BD)和消减值(SB)。通
常,蒸煮食味品质好的品种PV高,CPV低,SB低、BD值高。另外RVA谱值与稻米品质的其它指
标,如AAC、GC存在显著的相关性,通常将RVA谱指标与AAC和GC结合在一起作为筛选品质优
良稻米的重要筛选依据,根据BD 和SB的值可以用来评价AAC含量相似的多个品种的品质优
劣。
的垩白部分和非垩白部分的淀粉颗粒形状和排列方式不同,导致垩白部分的淀粉粒一般为
球形或者近似球形、排列疏松、淀粉粒间隙较大,而非垩白部分的淀粉颗粒多呈多面体、排
列紧密、淀粉粒间间隙较小。
℃将不利于水稻的生长。Wakamatsu等报道水稻抽穗后20 天内的日均温高于27℃将增加稻
米的垩白。灌浆结实期高温可以导致稻米淀粉结构疏松,颗粒间空隙变大,导致垩白增加、
透明度降低、长宽比变小整精米率下降,蛋白质含量增加,耐热品种的受影响程度小于热敏
感品种。另外,灌浆期高温使稻米淀粉的RVA谱特征值最终粘度、消碱值和糊化温度升高,崩
解值降低,峰值时间延长。高的灌浆温度可以使稻米的糊化温度、糊化焓升高,晶体结构改
变,并且进一步实验发现这种变化可能与直链淀粉含量的变化密切相关。Jiang等指出高温
主要影响淀粉的积累和构成,而不会影响淀粉颗粒的数量。直链淀粉含量是影响稻米品质
的最主要的因素,目前关于高温对直链淀粉含量的影响,有三种观点:1)认为高温使稻米直
链淀粉含量降低;2)高温导致直链淀粉含量升高;3)高温对直链淀粉的影响因品种而异,灌
浆期高温使带有高直链淀粉含量的品种直链淀粉含量增加和带有低直链淀粉含量的品种
直链淀粉含量降低。
论。徐富贤等分析齐穗后不同时段高温对稻米品质的影响发现水稻齐穗后的前20天是稻米
品质对温度最敏感的阶段。程方民等实验指出水稻抽穗后的前20天里是温度对直链淀粉含
量影响的关键阶段。朱碧岩等指出温度对稻米淀粉糊化温度影响的关键阶段在于水稻抽穗
后的前20天内。而 Ambardekar和Lanning等通过选用多个不同类型的品种在具有不同纬度
的地点进行多年种植,得出了不同的观点,提出蜡质化时期(R7)与强势粒成熟期(R8) 这两
个属于灌浆中后期的阶段是高温对稻米品质指标影响最为关键的阶段。另外,白天高温与
夜间高温对稻米品质的影响也不相同。
境下进行的实验较少。(2)从实验内容方面来看,多数实验主要集中在加工、外观等指标上,
通过这些指标来说明高温对品质的影响,而对影响稻米品质最重要的指标‑淀粉理化性质
的实验较少。(3)从实验深度来讲,过度强调外观等形态指标,忽略了蒸煮食味指标特别是
淀粉理化性质和形态结构方面的深入探究。
温耐受性的评价,一般都是从结实率角度来解析,而从稻米品质角度评价的研究相对较少。
境,可以准确有效的反应不同水稻品种的高温耐受程度。同时进行温室控温实验,可以帮助
探索不同水稻品种耐高温能力的内在机理。2、从稻米品质角度,特别是稻米淀粉理化特性
方面解析高温对不同水稻品种的影响,并对不同水稻品种的高温耐受程度进行评价。3、在
研究加工和外观指标的基础上,着重研究稻米淀粉理化指标受高温影响的程度。
发明内容
为关键指标。
评价值。
进一步的判定,即将不一致的水稻品种单独列为一组,再进行定量定性评价。
100g糙米用精米机加工成精米并称重,计算精米率。利用图像分析软件SC‑E分析得到整精
米率。
计算其垩白度、粒长、粒宽、长宽比等指标。
以10℃/min的速度,由30℃升温至95℃,扫描热量变化。
貌照片。称取样品100‑200mg于干净EP管中,加入1ml 75%酒精,涡旋混匀后超声混匀。将混
匀后的样品加入到Mastersizer 3000进行粒度分布测定,每样测定三次,收集数据。
1600W40kV×30mA,扫描速率4°/min,扫描范围4‑35°。使用软件Jade5.0计算测定样品的相
对结晶度。
用Ducan法,P<0.05表示差异显著。并且利用SAS软件对稻米淀粉理化指标进行Pearson相关
性分析。
将精米过滤后的浆液收集到离心瓶内;尼龙网用超纯水冲洗两次,将滤液与精米过滤后的
浆液混合;3000r/min离心20min,倒掉上清;用超纯水再次悬浮淀粉后,3000r/min离心
20min,倒掉上清;重复上一步3次;将淀粉晾干,结块后取出,放在55度烘箱快速烘干;将淀
粉块用粉碎机粉碎,过 200目筛子;干燥器保存。
量根据标准曲线获得。
160rpm的速度旋转至测定结束。测定条件如下:50℃下保持1min,然后以12℃/min升温到95
℃,在95℃保持2min,再以12℃/min速度降温到50℃,在50℃保持2min。
清液倒入一次性培养皿中,剩下的固体胶状物,称量重量,记为Ws。培养皿中的上清液置于
100℃烘箱内,烘干至恒重,记为W1。膨胀力用SP表示,水溶性指数用WSI表示。计算公式如
下:WSI=W1/0.1×100%; SP=Ws/[0.1×(100%‑WSI)](g/g)。
系数大,且在灌浆期高温和适温两种温度条件下方差显著的稻米淀粉理化指标作为关键指
标,得到直链淀粉含量、糊化焓、崩解值、消减值和垩白度为对高温敏感的稻米淀粉的关键
理化指标,以关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析,最后利用隶
属函数值求出耐高温综合评价值,实验得到六个不同品种的耐高温综合评价值,并结合回
归方程,定性定量评价这六个水稻品种高温耐受程度强弱顺序。
种高温耐受程度评价标准,为筛选和选育具有优良品质的耐高温水稻品种提供参考。
育种家选育优质高产耐高温水稻品种具有重要意义。同时采用分期播种方式和温室控温实
验相结合,可获得更加真实可靠、应用价值高的数据。
附图说明
本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的
附图。
具体实施方式
限定本发明。
价值。
进一步的判定,即将不一致的水稻品种单独列为一组,再进行定量定性评价。
稻品种灌浆期高温耐受强度方法仅仅是一个具体实施例而已。
年和2019年分别分三个播期和十个播种期播种,筛选不同品种不同播期变异系数大,且在
灌浆期高温和适温两种温度条件下方差显著的稻米淀粉理化指标作为关键指标,得到直链
淀粉含量、糊化焓、崩解值、消减值和垩白度为对高温敏感的稻米淀粉的关键理化指标,以
关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析,最后利用隶属函数值求出
耐高温综合评价值来定性评价不同品种的耐高温水平,实验得到六个不同品种的耐高温综
合评价值。
导致稻米的蒸煮食味品质变劣。但是不同的稻米淀粉理化指标对灌浆期高温的响应差异和
不同水稻品种对灌浆期高温的耐受性以及灌浆期高温对稻米淀粉的影响机理还不明确。因
此,本项目在前期实验的基础上,以在生产上常用的高产或优质水稻品种为材料,以分期播
种与温室控温相结合的方式,挖掘与水稻耐高温相关的淀粉理化指标,实验灌浆期昼夜高
温和不同时段高温对稻米淀粉理化特性的影响规律,建立不同水稻品种耐高温程度评价方
法,系统解析灌浆期高温对稻米淀粉理化特性的影响机理,为筛选和选育具有优良品质的
耐高温水稻品种提供参考。重点开展以下几方面内容:
处理后的实验材料的稻米淀粉理化指标进行测定。
温对稻米淀粉理化特性的影响,挖掘灌浆期不同时段高温对稻米淀粉理化特性影响的差
异,确定对稻米淀粉理化特性影响更大的灌浆时段。
布、淀粉粒结构、晶体特性、热力学特性和粘度特性等理化特性指标,同时结合温室控温实
验,分析不同稻米淀粉理化指标对高温的响应差异,筛选受高温影响程度大的淀粉理化指
标作为关键指标。以关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析,最后
利用隶属函数值求出耐高温综合评价值来定性评价不同品种的耐高温水平。同时以关键淀
粉生理指标胁迫指数为自变量,以耐高温综合评价值为因变量,做回归方程,定量评价各品
种的高温耐受性。
产或优质水稻品种进行耐高温评价,并将其作为选育品种过程中的一个重要鉴定标准,促
进高效选育高产、优质和抗逆境胁迫兼顾的超级稻新品种。
100g糙米用精米机加工成精米并称重,计算精米率。利用图像分析软件SC‑E分析得到整精
米率。
描图像,识别垩白粒的数量和面积。统计计算其垩白度、粒长、粒宽、长宽比等指标。
浆机将精米研磨;将精米浆液过200目的尼龙网,将精米过滤后的浆液收集到离心瓶内;尼
龙网用超纯水冲洗两次,将滤液与精米过滤后的浆液混合;3000r/min离心20min,倒掉上
清;用超纯水再次悬浮淀粉后,3000r/min 离心20min,倒掉上清;重复上一步3次;将淀粉晾
干,结块后取出,放在55度烘箱快速烘干;将淀粉块用粉碎机粉碎,过200目筛子;干燥器保
存。(2)直链淀粉含量的测定本实验通过在720nm处测定与碘反应的淀粉样品的吸光值来测
定其中直链淀粉的含量。其中以土豆直链淀粉和玉米支链淀粉含量作为标准样品制作标准
曲线,直链淀粉含量根据标准曲线获得。
℃/min的速度,由30℃升温至95℃,扫描热量变化。
10s,然后减小到160rpm的速度旋转至测定结束。测定条件如下:50℃下保持1min,然后以12
℃/min升温到95℃,在95℃保持2min,再以 12℃/min速度降温到50℃,在50℃保持2min。
片。称取样品100‑200mg于干净EP管中,加入1ml 75%酒精,涡旋混匀后超声混匀。将混匀后
的样品加入到Mastersizer 3000进行粒度分布测定,每样测定三次,收集数据。
λ=0.15406nm,功率1600W(40kV×30mA),扫描速率4°/min,扫描范围4‑35°。使用软件
Jade5.0计算测定样品的相对结晶度。
温之后,3000g离心20分钟,上清液倒入一次性培养皿中,剩下的固体胶状物,称量重量,记
为Ws。培养皿中的上清液置于100℃烘箱内,烘干至恒重,记为W1。膨胀力用SP表示,水溶性
指数用WSI表示。计算公式如下: WSI=W1/0.1×100%;SP=Ws/[0.1×(100%‑WSI)](g/
g)。
法,P<0.05表示差异显著。并且利用SAS软件对稻米淀粉理化指标进行Pearson相关性分析。
完成。
育种家选育优质高产耐高温水稻品种具有重要意义。同时采用分期播种方式和温室控温实
验相结合,可获得更加真实可靠、应用价值高的数据。
蒸煮食味品质变劣。并于2020年利用人工气候室控温条件,得到灌浆期昼夜高温和灌浆期
不同时段高温对稻米淀粉理化特性的影响,全面解析灌浆期高温对稻米淀粉理化特性影响
的机理和明确耐高温水稻品种的淀粉形态和理化特征。同时结合分期播种和温室控温实
验,筛选与耐高温关联密切的淀粉理化指标作为关键理化指标,并利用关键淀粉理化指标
建立不同水稻品种耐高温评价标准。
化特性和精细结构分析,稻米的消化特性分析等技术。另外,本项目借助于湖南杂交水稻实
验中心杂交水稻国家重点实验室和水稻国家工程实验室等国家级科研平台,湖南杂交水稻
实验中心具有设备齐全的稻米及制品质量检测平台,拥有良好的实验条件,实验设施较为
齐全,有利于本发明的开展和最终顺利完成。
发表,另一篇正在投稿),CSCD核心期刊2篇,参与省级课题4 项。
下的加工品质、外观品质、直链淀粉含量、糊化特性做了测定和分析。具体实验结果如下:
三播期为适温(CT)水平。由于18Q006第一播期和第三播期的始穗后40天平均日均温都高于
27℃,所以都视为HT(表和图未提供)。在2019年分期播种中,除19Q006,筛选到第一播期、第
六播期灌浆期都为高温,分别定义为HT1、HT2;第十播期为适温播期,定义为CT(表1和图3)。
而19Q006,以第六和第七播期分别为HT1和HT2,第十播期为CT。
直链淀粉含量升高,还有实验认为高温对直链淀粉含量的影响因品种而异,其使含高直链
淀粉的品种直链淀粉含量升高,含低直链淀粉的品种直链淀粉含量降低。本人认为这中实
验结论的不一致可能是由于所选用的实验材料不一致的缘故。
性变化。而对于19Q001,短支链淀粉含量(DP6‑10)显著下降,支链淀粉含量(DP 11‑20)显著
增加,在超过DP21的支链淀粉含量就不再明显变化。因此,随着灌浆期温度的增加,短支链
淀粉含量显著下降,中等支链淀粉含量显著增加,这可能与糊化温度的升高有关。
化温度反映了稻米蒸煮的难易程度,升高的糊化温度使蒸煮精米时需要更高的蒸煮温度和
使蒸煮时间变长。除此之外,高温使糊化焓升高,这说明在蒸煮精米使需要更多的热量。糊
化焓与直链淀粉含量负相关,所以糊化焓的升高,可能与直链淀粉含量的降低有关。
淀粉含量(AAC)、垩白度(CHA)、糊化焓(△H)、崩解值(BD)和消减值(SB)对高温环境更为敏
感,被作为关键淀粉理化指标(如表3、表4)。
温紧密关联的淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析,HT1/CT和HT2/CT
两个实验组各得到三个主成分,每一个主成分看作一个综合指标,累计贡献率都达到95%
以上,见表5。各主成分值、隶属函数值(Ux)和高温综合评价值(D值)见表6。利用五个关键淀
粉理化指标的高温胁迫指数为自变量,以耐高温综合评价值为因变量,做回归方程,得到各
品种的高温耐受程度预测值(FV),见表6。综合以上得到,各品种的高温耐受程度,从强到弱
顺序为:黄华占、Y两优957、泰优390、天优华占、中早39和Y 两优1号。
有良好的实验条件,实验设施较为齐全,有利于本课题的开展和最终顺利完成。
计(UV‑1601PC),快速粘度分析仪(RVA Super 4),快速水分测定仪(HR83‑P),马尔文激光粒
度(Mastersizer3000),移液枪,恒温水浴锅,电子显微镜(Philips XL‑3),酶标仪,37℃恒
温箱,HOBO温光记录仪等。同时利用湖南省作物种质创新与资源利用国家重点实验室培育
基地的差示扫描量热(Q2000)、X射线衍射仪(D8 Advance)等本实验所需仪器,互相补充,充
分满足了该实验的分析测试仪器需求。
作的任何修改、等同替换和改进等,都应涵盖在本发明的保护范围之内。