一种以N-氧化吡啶衍生物为识别基团的近红外荧光探针化合物及其制备和应用

摘要

本发明公开了一种以N‑氧化吡啶衍生物为识别基团的近红外荧光探针化合物及其制备和应用。所述制备方法具体为：首先将吡啶类杂环化合物氧化成N‑氧化吡啶‑2‑甲醛衍生物，将其作为识别基团。最后，在有机溶剂中将罗丹明B酰肼与N‑氧化吡啶衍生物反应，得到N‑氧化吡啶‑罗丹明B类近红外荧光探针；本发明的N‑氧化吡啶‑罗丹明B类近红外荧光探针能高灵敏、高选择性地检测二价钯离子，可以实现环境中二价钯离子的比色和荧光双模式检测，也可以用于细胞内二价钯离子的快速检测。此外，所应用的N‑氧化吡啶衍生物为一类起始原料易得、易制备的新识别基团，与其它常见染料结合后，在检测其它重金属离子方面有着广泛的应用前景。

权利要求

1.一种以N‑氧化吡啶为识别基团的近红外荧光探针化合物，其特征在于，所述化合物具有如下结构通式I：

结构通式I中，R1、R2、R3和R4各自独立选自氢原子。

2.根据权利要求1所述的以N‑氧化吡啶为识别基团的近红外荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，包括以下方法：将罗丹明B酰肼类染料加入到有机溶剂中，完全溶解后再加入N‑氧化吡啶‑2‑甲醛类化合物，回流反应，冷却，减压除去溶剂，然后萃取，硅胶柱层析后，得到N‑氧化吡啶‑罗丹明B类衍生物的近红外荧光探针；

。

3.根据权利要求2所述的以N‑氧化吡啶为识别基团的近红外荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，所述回流反应是指在78‑80℃回流反应12‑24h；有机溶剂为无水乙醇。

4.根据权利要求1所述的以N‑氧化吡啶为识别基团的近红外荧光探针化合物在制备识别检测二价钯离子试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述化合物通过比色法或近红外荧光法来识别检测溶液中的二价钯离子。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述化合物用于制备生物样品标记试剂中的应用。

说明书

一种以N‑氧化吡啶衍生物为识别基团的近红外荧光探针化合

物及其制备和应用

技术领域

[0001] 本发明属于一种离子检测类荧光探针化合物及其制备方法和应用，特别涉及一种新识别基团的制备与应用，属有机合成及分析化学技术领域。

背景技术

[0002] 钯金属被称为现代工业的“维他命”，是航天、航空、航海、兵器和核能等高科技，以及汽车制造业领域不可缺少的原材料。二价钯离子被广泛地应用于电镀、工业催化、精细化
工品和药物分子的制备中。燃料电池、储氢材料、牙冠材料、医疗器械等也会产生大量的二
价钯离子。随着二价钯离子需求量的不断增加，由此引发了严重的环境污染问题。动植物吸
收二价钯离子后，通过食物链的生物富集作用后，最终进入生物链顶端的人类，严重危害人
类健康。人体摄入一定量的二价钯离子后，它会与人体中的蛋白质、DNA和RNA等生物大分子
结合，干扰人体的正常代谢，容易引起皮肤癌、哮喘、肝癌等疾病。鉴于钯离子的危害性，欧
洲药品监督中心规定药品中的二价钯含量要低于ppm数量级。因此对自然环境和生物体内
二价钯离子检测尤为重要。

[0003] 目前常用的检测二价钯离子的传统方法有电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子发射光谱法、原子吸收光谱法、电化学法等。上述方法具有较高的灵敏度和选择性，但
是存在样品前处理复杂、所需仪器昂贵、操作繁琐、不适宜进行现场快速检测和连续在线分
析等不足。相对于传统的检测方法，用于检测二价钯离子的配位型有机小分子荧光探针，不
仅所需设备简单易携带、成本低，而且灵敏度高、选择性好、还可以连续在线监测。已报道的
配位型荧光探针主要集中在识别基团的研究，常见的识别基团有冠醚、二(吡啶‑2‑甲基)
胺、2‑羟基苯甲醛、噻吩、吡咯烷等。识别空腔构建时，以识别基团为主，还涉及荧光染料和
连接臂中的部分片段。识别空腔构建好以后，何种金属离子被识别具有不确定性，大量筛选
以后才能确认，具有意外性。以二(吡啶‑2‑甲基)胺识别基团为例，连接不同的荧光染料后，
可以识别不同的重金属离子(J.Am.Chem.Soc.2005,127,10107‑10111；J.Am.Chem.Soc.,
2007,129,1500‑1501)。因此，制备及应用新的识别基团对于对自然环境和生物体内重金属
离子检测具有广泛的应用前景。

发明内容

[0004] 基于背景技术中的问题，本发明的目的之一在于提供一种可以实现环境中二价钯离子的比色和荧光双模式检测，也可以用于细胞内二价钯离子检测的近红外荧光探针；目
的之二是提供一种以N‑氧化吡啶为识别基团构建近红外荧光探针的方法。

[0005] 本发明的技术方案是一种N‑氧化吡啶‑罗丹明B类衍生物，具有如下结构通式：

[0006]

[0007] 进一步，上述结构通式(I)中，R1、R2、R3和R4各自独立选自氢原子、C1‑3烷基、卤原子、甲氧基、乙氧基、乙酸酯基、硝基、氰基、芳基、C1‑3烷基取代的苯基中的一种。

[0008] 本发明还提供了一种基于N‑氧化吡啶‑罗丹明B类衍生物的制备方法，步骤如下：

[0009] (1)N‑氧化吡啶‑2‑甲醛类化合物的制备

[0010] 将N‑氧化吡啶‑2‑甲醇类化合物溶于吡啶中，搅拌的情况下加入1‑3倍摩尔当量的二氧化硒，加热到90‑110℃回流搅拌，反应2‑5h，停止反应，过滤，滤饼用少量二氯甲烷洗
涤，滤液浓缩后得到N‑氧化吡啶‑2‑甲醛类化合物粗品，常规有机溶剂重结晶后得到纯品。

[0011] (2)罗丹明B酰肼类染料的制备

[0012] 将罗丹明B溶于有机溶剂中，预热10‑30分钟，加入水合肼，78‑80℃回流反应5‑12h，冷却，40‑60℃蒸去有机溶剂。然后加入1mol/L盐酸pH值调节至3‑6后得到红色溶液，再
加入1mol/L氢氧化钠溶液，将溶液的pH值调节至8‑10之间，出现大量沉淀，过滤，去离子水
洗涤滤饼，真空干燥后得到罗丹明B酰肼类染料。

[0013] 步骤(2)中溶剂优选为：无水乙醇溶剂；加入5‑20倍摩尔当量的水合肼。

[0014] (3)近红外荧光探针的制备

[0015]

[0016] 将罗丹明B酰肼类染料加入到有机溶剂中，完全溶解后再加入N‑氧化吡啶甲醛类化合物，得混合物，将混合物在78‑80℃回流反应12‑24h，冷却，减压除去溶剂，然后用乙酸
乙酯萃取，45‑55℃蒸去乙酸乙酯，硅胶柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，得到N‑氧化
吡啶‑罗丹明B类衍生物的近红外荧光探针。

[0017] 步骤(3)中N‑氧化吡啶甲醛衍生物与罗丹明B酰肼染料的摩尔比为1：1；溶剂优选：无水乙醇溶剂。步骤(3)的回流反应优选高纯氮气或高纯氩气保护下进行回流。

[0018] 本发明中所使用的各种原料均可市售获得，或者以市售的原料为起始物通过本领域技术人员公知的制备方法获得。

[0019] 本发明制备得到的N‑氧化吡啶‑罗丹明B类衍生物的近红外荧光探针化合物在识别检测二价钯离子中的应用。

[0020] 进一步，近红外荧光探针化合物可以通过比色法或近红外荧光法来识别检测溶液中的二价钯离子，在环境污染检测方面起到积极的作用。

[0021] 进一步，近红外荧光探针化合物可通过红外荧光法用于细胞内二价钯离子的快速检测，因此该化合物可用于制备生物样品标记试剂中的应用，具体为制备Hepg2细胞标记试
剂中的应用。

[0022] 尽管研究者发现现有技术中存在N‑氧化吡啶‑2‑甲醛肟衍生物能与钯(Ⅱ)、铂(Ⅳ)等金属离子形成配合物，但是只证实了N‑氧化吡啶衍生物中的氧原子有较好的配位能
力。而本发明通过N‑氧化吡啶衍生物和罗丹明B酰肼所构建的半开放式环状结构，具有一定
的空间孔径，通过多官能团的协同调控，合成得到的探针化合物只适合特定大小的二价钯
离子结合，但仍具有不确定性，因此需要完成大量工作后，通过实验数据来证实。

[0023] 本发明的有益成果：本发明以罗丹明B为荧光基团，肼为连接基团，N‑氧化吡啶衍生物为识别片段制备了一种基于N‑氧化吡啶衍生物的二价钯离子近红外荧光探针化合物。
该方法合成步骤简单，原料易得，便于制备；所制备的近红外荧光探针化合物对二价钯离子
具有专一性的识别，灵敏度高，对其它金属离子的抗干扰能力强，而且可以比色检测含二价
钯离子的溶液，可广泛用于生物化学、环境科学、医学等领域的二价钯离子检测，具有广泛
的应用前景。N‑氧化吡啶衍生物作为荧光探针中的识别片段不在常见识别片段范畴内，该
识别片段对于以组合化学为理论依据，开发其它可用于金属离子检测的配位型新荧光探针
有着非常好的应用价值。
附图说明:

[0024] 图1为实施例3中近红外荧光探针化合物加入二价钯离子前后的紫外吸收光谱图；

[0025] 图2为实施例3中近红外荧光探针化合物在乙醇溶液中二价钯离子的荧光光谱响应图，其中横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度，图中每条曲线分别代表二价钯
离子浓度与荧光光谱的关系；

[0026] 图3为实施例3中近红外荧光探针化合物在乙醇溶液中对不同的金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；

[0027] 图4为实施例3中近红外荧光探针化合物在Hepg2细胞成像中的应用；其中图A为探针与Hepg2细胞作用后的暗场图；图B为探针与Hepg2细胞作用后的明场图；图C为探针与
2+ 2+
Hepg2细胞作用后，再加入Pd 后的暗场图；图D为探针与Hepg2细胞作用后，再加入Pd 后的
明场图。

[0028] 图5为实施例3中近红外荧光探针化合物加入二价钯离子前后的质谱图及反应机理；

[0029] 图6为实施例3中近红外荧光探针化合物的1H‑NMR谱图；

[0030] 图7为实施例3中近红外荧光探针的13C‑NMR谱图。

具体实施方式

[0031] 为了更好地理解本发明的实质，下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。但是下面所总结的实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则。

[0032] 实施例中所采用的试剂均为市售分析纯或化学纯。

[0033] 实施例1

[0034] 将N‑氧化吡啶甲醇(3.0g，24.0mmol)溶于10mL吡啶溶液中，搅拌的情况下分批加入二氧化硒(3.20g，28.8mmol)，然后加热到90℃回流搅拌3h，停止反应，抽滤，滤饼用少量
二氯甲烷洗涤，滤液浓缩后得到N‑氧化吡啶甲醛粗品，石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂
(60mL，V/V＝5:1)重结晶后，得到纯品，(2.30g，产率77.8％)。

[0035] 实施例2

[0036] 向100mL单口圆底烧瓶中，依次加入罗丹明B(2.9g，6.0mmol)，无水乙醇(50mL)和85％水合肼(10mL)，78℃混合回流反应12小时，溶液由深紫色变成亮黄色，最后变成透明澄
清溶液，待反应完毕，冷却，减压除去溶剂得到粘稠固体。向上述固体中逐滴加入10mL浓盐
酸(1mol/L)得到红色澄清溶液，再逐渐滴加1mol/L氢氧化钠水溶液，将溶液的pH值调至9，
出现大量沉淀，过滤，去离子水洗涤滤饼，真空干燥后得到罗丹明B酰肼类染料(2.10g，产率
76.6％)。

[0037] 实施例3

[0038] 将罗丹明B酰肼类染料(0.92g,2.0mmol)加入到20mL乙醇中，完全溶解后再加入N‑氧化吡啶甲醛(0.246g,2.0mmol)，氮气保护下将混合物在80℃回流反应12h，冷却，减压除
去溶剂，然后用乙酸乙酯萃取，45‑55℃蒸去乙酸乙酯，硅胶柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲
烷/甲醇(V/V＝30:1)，得到黄色固体(0.629g，收率为56％)，即为N‑氧化吡啶‑罗丹明B类近
+ 1
红外荧光探针(RhBF)。如图5、图6和图7所示，ESI质谱:m/z[M+H]562.2799.H NMR(500MHz,
CD3Cl)δ(ppm):1.15(t,12H,J＝7.0Hz),3.32(q,8H,J＝7.0Hz),6.23‑6.25(m,2H),6.46‑
6.49(m,4H),7.06‑7.13(m,3H),7.46‑7.54(m,2H),7.86(dd,1H,J＝7.0Hz,J＝2.0Hz),
13
7.99‑8.02(m,2H),9.12(s,1H)；C NMR(125MHz,CD3Cl)δ(ppm):12.6,44.3,66.3,98.1,
105.3,107.8,123.4,123.6,124.1,124.8,125.3,127.8,128.4,128.5,133.9,138.0,
139.4,145.9,149.0,152.0,153.3,165.2.

[0039] 应用实施例

[0040] 图1为实施例3制备得到的为N‑氧化吡啶‑罗丹明B类近红外荧光探针化合物(RhBF)加入二价钯离子前后的紫外吸收光谱图；测试时近红外荧光探针的浓度为10μM，溶
剂为乙醇与水的混合溶剂(体积比为1：1)，缓冲溶液为25mMPBS(pH＝7.4)，二价钯离子的浓
度为50μM。

[0041] 从图1中可知：近红外荧光探针的溶液在560nm处有一个非常弱的吸收带，一旦加入二价钯离子后，在560nm处则出现一个很强的吸收峰。吸光度的明显变化，证实了所构建
的空腔与二价钯离子配位后，罗丹明B中的内酯环结构出现了开环反应。同时，溶液的颜色
从无色变成了紫红色，可以用来可视化(裸眼)检测二价钯离子。

[0042] 图2为实施例3制备得到的为N‑氧化吡啶‑罗丹明B类近红外荧光探针化合物(RhBF)在乙醇溶液中二价钯离子的荧光光谱响应图；测试时近红外荧光探针的浓度为10μ
M,溶剂为乙醇与水的混合溶剂(体积比为1：1)，缓冲溶液为25mM PBS(pH＝7.4)，二价钯离
子的浓度为0μM，1μM，2μM，4μM，6μM，8μM，9μM，10μM。采用荧光光谱仪分别记录592处的荧光
强度值以及曲线的变化趋势。

[0043] 从图2可知：随着二价钯离子的浓度增加，近红外荧光探针在592nm处的荧光强度逐渐增强，且与二价钯离子浓度在1‑10μM范围内线性相关，拟合的相关系数为0.9936，检测
限为0.5μM。

[0044] 图3为实施例3制备得到的为N‑氧化吡啶‑罗丹明B类近红外荧光探针化合物(RhBF)在乙醇溶液中对不同的金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；

[0045] 具体的操作步骤为：测试时近红外荧光探针的浓度为10μM,溶剂为乙醇与水的混合溶剂(体积比为1：1)，缓冲溶液为25mMPBS(pH＝7.4)。向上述溶液中分别加入摩尔浓度为
2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ 2+ + 2+ + + 3+ 3+
100μM的Hg ,Ni ,pb ,Cu ,Cr ,Fe ,Cd ,Ag ,Co ,Na ,K ,Rh ,Ru 等金属离子的溶液，
荧光光谱仪分别记录592处的荧光强度值。

[0046] 得到的结论为：跟空白溶液的荧光强度(F0)相比较，除了二价汞离子的荧光强度增加了2倍，上述其它离子没有明显的荧光强度变化。虽然加入高浓度的二价汞离子后，荧
光强度增加了2倍，但是跟加入二价钯离子后的荧光强度相比较，变化不明显。数据表明所
制备的近红外荧光探针化合物对二价钯离子具有专一性的识别。

[0047] 图4为实施例3制备得到的为N‑氧化吡啶‑罗丹明B类近红外荧光探针化合物(RhBF)在Hepg2细胞成像中的应用。

[0048] 具体的操作为：首先，将Hepg2细胞于24孔培养板中培养24小时，培养条件是在37℃，含有5％CO2的饱和水蒸气培养箱中，将培养好的细胞中每孔先加入5μm荧光探针，之后
在培养箱继续培养0.5小时，使探针有足够的时间进入细胞。PBS缓冲液清洗三遍，加入新鲜
培养液，荧光显微成像时发现探针在活细胞中几乎没有荧光，在上述培养液中再加入5μ
2+
MPd ，培养箱中培养0.5小时，PBS缓冲液清洗三遍，于荧光显微镜下成像，激发波长为
510nm。

[0049] 得到的结论为：荧光显微成像发现在活Hepg2细胞中探针本身几乎没有荧光(图A2+
为暗场，图B为明场)，而随着在含有探针的活Hepg2细胞中加入5μM Pd ，37℃下培养0.5小
时后成像后，细胞的荧光迅速显著增强(图C为暗场、图D为明场)。基于此，该探针可以实现
细胞内二价钯离子的检测。

[0050] 图5为实施例3中近红外荧光探针化合物加入二价钯离子前后的质谱图及反应机理；从图5可知：近红外荧光探针与二价钯离子的配位比1：1。此外，通过分析加入硫化钠溶
液后的荧光光谱图，我们提出了近红外荧光探针与二价钯离子反应的机理图。

[0051] 除了实施例3 化合物能取得上述效果，其它权利要求1限定的N‑氧化吡啶‑罗丹明B类近红外荧光探针化合物结构也能取得选择性识别二价钯离子的作
用效果。