一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用

摘要

本发明公开了一种培养骨髓间充质干细胞专用培养基及其应用。该培养基还包括基质金属蛋白酶2(MMP2)。实验证实，含MMP2培养基处理的BMSC其表型不变，但是生长速度明显增加。因此，这种含MMP2的培养基可用于骨髓来源MSC的培养，使其在临床治疗及美容等方面发挥更有效的作用。

权利要求

1.一种培养骨髓间充质干细胞的专用培养基，其特征在于，以DMEM‑F12为基础培养基, 还包括MMP2 20‑50 μg/L，nutridoma 0.2‑1mg/ml，青链霉素双抗100单位/ml，丙酮酸5‑

20mg/L，L‑谷氨酰胺3‑6mg/ml。

说明书

一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用。

背景技术

[0002] 间充质干细胞(MSC)目前被广泛应用于临床组织修复、自身免疫病治疗以及美容等行业。在机体内，MSC存在于骨髓、胎盘、脐带、羊膜、脂肪等组织中，尤以骨髓中数量较多、分化能力最强。不同来源的间充质干细胞虽然在分子标志物表达方面有相似性，但是在生长及功能方面存在明显的器官特异性。这表明间充质干细胞生存的微环境对间充质干细胞的生长和功能有着至关重要的影响。因此，需要一种BMSC专用培养基。

发明内容

[0003] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种培养BMSC专用培养基及其应用，含有MMP2的培养基培养得到的间充质干细胞生长速度快，所得间充质干细胞适合用于制备临床治疗或美容类产品。

[0004] 本发明在体外培养骨髓间充质干细胞(BMSC)时发现，其生长速度明显低于脂肪等来源的间充质干细胞。因此，我们通过质谱分析BMSC及脂肪MSC培养上清中的蛋白成分，来寻找可促进BMSC生长的关键因子。质谱结果显示，脂肪MSC上清中基质金属蛋白酶2(MMP2)的含量明显高于BMSC。我们用添加MMP2的培养基来培养BMSC时发现，BMSC的生长速度明显增加，且不改变间充质干细胞表型。但是当MMP2含量大于200ug/L时，细胞增殖受限。

[0005] 一种培养BMSC专用培养基,包括基础培养基，还包括MMP2，所述MMP2的浓度为20‑50μg/L。

[0006] 作为本发明的一种优选，所述基础培养基为DMEM‑F12基础培养基。

[0007] 作为本发明的进一步优选，所述的专用培养基中还包括nutridoma 0.2‑1mg/ml，青链霉素双抗100单位/ml，丙酮酸5‑20mg/L，L‑谷氨酰胺3‑6mg/ml。

[0008] 上述专用培养基在制备药物或美容产品中的应用。

[0009] 作为本发明的一种优选，使用所述的专用培养基培养骨髓间充质干细胞，所得骨髓间充质干细胞作为所述的药物或美容产品的有效成分。

[0010] 一种治疗药物，其活性成分为上述培养得到的间充质干细胞，浓度为1×105‑1×7
10个/ml。

[0011] 一种抗衰老美容产品，其活性成分为上述培养得到的间充质干细胞，浓度为1×5 7
10‑1×10个/ml。

[0012] 有益效果：

[0013] 与现有技术相比，将特定浓度MMP2加入培养来源于骨髓的MSC的培养基后，MSC的生长速度加快。另外，用本发明的MSC制成的临床治疗药物或美容产品上的效果明显。

附图说明

[0014] 图1为蛋白质谱分析脂肪来源MSC(A‑MSC)与骨髓来源MSC(B‑MSC)培养上清中蛋白表达情况；

[0015] 图2为含MMP2培养基培养BMSC后，其表面标志物的表达分析；

[0016] 图3为含MMP2培养基培养BMSC后，MSC增殖能力的改变。

具体实施方式

[0017] 实施例1蛋白质谱分析脂肪来源MSC(A‑MSC)与骨髓来源MSC(B‑MSC)培养上清中蛋白表达情况。

[0018] 1、材料和方法

[0019] 1.1主要试剂

[0020] DMEM‑F12基础培养基、nutridoma、青链霉素双抗、丙酮酸、L‑谷氨酰胺、Hank’s平衡盐溶液、胰酶；所用的试剂均为常规试剂。

[0021] 1.2主要仪器

[0022] Thermo Scientific质谱分析

[0023] 1.3主要方法

[0024] 1.3.1骨髓MSC以脂肪MSC培养

[0025] 于南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞中心获取P3代的骨髓MSC以及脂肪MSC。用含nutridoma 0.5mg/ml，青链霉素双抗100单位/ml，丙酮酸15mg/L，L‑谷氨酰胺5mg/ml DMEM‑F12培养基培养。

[0026] 1.3.2蛋白质谱分析

[0027] 同样的细胞接种密度，培养48h后，获取培养上清，1500rpm离心10min，去除沉淀后，上清进行蛋白质谱分析。

[0028] 2、结果

[0029] 对上述处理进行分析，结果如图1所示，脂肪MSC上清中的MMP2含量是BMSC上清中MMP2含量的2.9倍。

[0030] 实施例2含MMP2的MSC培养基不影响BMSC表面标志物的表达。

[0031] 1、材料，试剂，设备

[0032] 1.1主要试剂

[0033] 胰酶、流式抗体(anti‑CD11b、anti‑CD14、anti‑CD19、anti‑CD106、anti‑CD29、anti‑CD44、anti‑CD73、anti‑CD90)

[0034] BMSC培养基：DMEM‑F12基础培养基基础培养基(GIBCO，Cat#11330057)，还包括nutridoma(Roche)0.5mg/ml，青链霉素双抗100单位/ml，丙酮酸15mg/L，L‑谷氨酰胺5mg/ml，MMP220μg/L。

[0035] 对比组的培养基：除不含MMP2外，其余同上述BMSC培养基。

[0036] 1.2主要仪器

[0037] 流式细胞仪

[0038] 1.3主要方法

[0039] BMSC培养基培养BMSC后，胰酶消化，离心并PBS重悬间充质干细胞。把对比组培养基处理的间充质干细胞作为对照组分别分成9管，两组的每管细胞加入anti‑CD11b、anti‑CD14、anti‑CD19、anti‑CD106、anti‑CD29、anti‑CD44、anti‑CD73、anti‑CD90抗体及同型对照抗体，4℃下过夜避光孵育，随后进行流式检测各个标志分子的表达情况。

[0040] 2、结果

[0041] 流式分析了MSC表面标志CD11b、CD14、CD19、CD106、CD29、CD44、CD73、CD90的表达情况。结果显示，含MMP2的BMSC培养基培养BMSC后不会改变MSC表面标志物的表达(图2)。

[0042] 实施例3含MMP2的BMSC培养基促进BMSC增殖能力

[0043] 1、材料，试剂，设备

[0044] 1.1主要试剂

[0045] 胰酶(GIBCO，Cat#25200056)、DMEM‑F12基础培养基(GIBCO，Cat#11330057)、CCK8试剂盒(Dojindo，Cat#CK04)。

[0046] 1.2主要仪器

[0047] 显微镜、酶标仪

[0048] 1.3主要方法

[0049] 1.3.1细胞形态及密度观察

[0050] BMSC铺于48孔板(每孔10000个细胞)，分别加入MMP2(20μg/L)的培养基及不含MMP2的对照培养基。显微镜下观察拍照，培养24h后，再次进行拍照(图3A)。

[0051] 1.3.2细胞增殖活性

[0052] BMSC铺于96孔板(每孔10000个细胞)，分别用含MMP2(20μg/L)的培养基及不含MMP2的对照培养基培养48h后，加入CCK‑8试剂，450nm波长处检测读值，并统计分析(图3B)。另外，为了探寻最佳MMP2浓度，我们在培养基中添加不同浓度的MMP2(0ug/L、10ug/L、20ug/L、50ug/L、100ug/L、200ug/L)，培养48h，加入CCK‑8试剂，450nm波长处检测读值，并统计分析(图3C)。

[0053] 2、结果

[0054] 从图3中可以看出含MMP2(20‑50ug/ml)的培养基明显促进BMSC的增殖活力。当MMP2浓度达到200ug/L时，对BMSC生长有抑制生长的趋势。

[0055] 这些结果表明，MMP2可以作为培养骨髓来源MSC的培养基组分。而经含有MMP2的培养基培养后，BMSC的生长加快，可用于美容或药物中。