一种检测猪眼肌面积的SNP标记及其应用

摘要

本发明公开了一种与猪眼肌面积相关的SNP标记及其检测方法和用途，其中，所述SNP标记位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242处，具有T/G多态性；该SNP标记的基因型为GG的猪相较于基因型为TT和TG的猪具有较大的眼肌面积。本发明所提供的与猪眼肌面积相关的SNP标记的确定，可以辅助选择眼肌面积大的猪优势品种，缩短了育种周期，提高了育种效率和育种精度。

权利要求

1.一种鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积大小的方法，其特征在于，所述方法包括检测国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242个核苷酸位点的基因型的步骤，所述第134,993,242个核苷酸位点的基因型为GG的猪的眼肌面积大于基因型为TT或TG的猪的眼肌面积；

所述猪的品种为杜洛克猪、长白猪和大白猪。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，位于所述国际猪基因组10.2版本参考序列

4号染色体上的第134,993,242个核苷酸位点具有T/G多态性。

说明书

一种检测猪眼肌面积的SNP标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测猪眼肌面积的SNP标记、方法和用途。

背景技术

[0002] 我国是世界上猪肉生产和猪肉消费的第一大国，近些年来，随着猪肉总量和人民生活水平的提高，对高品质的猪肉需求也越来越高。眼肌也叫背最长肌，是猪全身最鲜嫩的肉，是高品质猪肉的代表。眼肌面积是指猪背最长肌的横断面面积，是评定猪生长性能和胴体产肉能力的主要指标，眼肌面积的增加可以提高胴体瘦肉率，降低背膘厚，提高饲料利用率。

[0003] 眼肌面积是一个数量性状，现有技术中的研究表明，影响数量性状的既有数目众多的微效基因的共同作用，又有效应较大的主效基因的主导作用。微效多基因在基因组中的分布也并不是随机的，通常是具有相同或相关功能的基因聚集在彼此相近的染色体区域，形成紧密连锁的基因簇，即数量性状基因座(Quantiative trait locus，QTL)。

[0004] 目前，关于生长性状主基因和QTL检测方面的研究报道很多，也取得了一些进展。在所研究的候选基因中，以生长激素(Growth hormone，GH)基因，类胰岛素生长因子‑1(Insulin‑like growth factor‑1，IGF‑1)基因和PIT1基因等的研究较多。很多学者发现，外源生长激素可提高猪的日增重、瘦肉率和饲料转化率，并降低背膘厚，但对不同品种而言，GH的效应有所不同。Cassas‑Carrillo等将GH基因和IGF‑1基因作为猪生长性状和胴体性状的候选基因，对不同基因型与生长性状和胴体性状的关系进行了分析，结果表明GH和IGF1的不同基因型与性状显著相关。此外，Yu等通过候选基因分析法发现，PIT1基因是与猪出生重和背膘厚相关的主基因，且该基因被定位于Andersson等发现的第13号染色体上与生长速度有关的QTL中。但是，候选基因法不能检测位置功能的基因，QTL定位置信区间比较大且会受到不同家系群体的影响，同样不能满足需求。

[0005] 随着猪基因组测序和高密度SNP的开发，使得全基因组关联分析(GWAS)能够对众多重要性状的候选基因进行鉴定。全基因组关联分析(Genome‑Wide Association Study，GWAS)是指在数百或数千个个体的大群体中，对全基因组范围内单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型，进而将基因型与记录的表型值进行群体水平的统计学分析，基于得到的统计量和P值，筛选出最有可能影响该性状的SNPs标记。其最早由Risch和Merikangas等人提出，他们认为该方法的检测效率要比连锁分析更高，检测力更强。同时，可以在大群体中对数量经济性状和复杂疾病的真正致因突变及候选基因进行定位。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP具有分布广，密度高，多态性丰富，和易于高通量自动化检测等优点，因而常作为全基因组关联分析的标记。

[0006] 然而，目前仍缺少功能明确、效应显著且可直接用于育种的与猪眼肌面积相关的SNP标记，因此，有必要深入地研究和探索猪眼肌面积这一性状的调控机理和遗传机制，提供与猪眼肌面积相关的SNP分子标记，以利用其选育高品质猪肉的猪种，实现我国猪育种理论和技术水平的提升。

发明内容

[0007] 为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，发现了与猪眼肌面积相关的SNP标记，其位于猪参考基因组Sscrofa10.2的Chr4：134,993,242处，具有T/G多态性，可以通过鉴定该SNP标记的基因型来筛选眼肌面积大的猪品系，所得猪个体品质更高的猪品系具有重要的经济效益与社会价值，从而完成了本发明。

[0008] 具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

[0009] 第一方面，提供一种与猪眼肌面积相关的SNP标记，其中，所述SNP标记位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242处，具有T/G多态性。

[0010] 其中，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP标记的基因型为GG的猪，相较于基因型为TT和TG的猪具有较大的眼肌面积。

[0011] 第二方面，提供一种第一方面所述的SNP标记的获取方法，其中，所述方法包括以下步骤：

[0012] 步骤1，提取猪的基因组DNA；

[0013] 步骤2，对猪全基因组内的SNP进行基因型检测；

[0014] 步骤3，获取猪的眼肌面积表型数据，并与步骤2中的基因型数据进行关联分析。

[0015] 第三方面，提供一种用于检测第一方面所述SNP标记的引物对，其中，所述引物对为P1和P2，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

[0016] 第四方面，提供一种检测第一方面所述SNP标记的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

[0017] 步骤i，扩增含有SNP标记的目的片段；

[0018] 步骤ii，对扩增产物进行测序，检测SNP标记。

[0019] 第五方面，提供一种鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积的方法，其中，所述方法包括检测猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的基因型的步骤。

[0020] 第六方面，提供一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获得的SNP标记在鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积方面的应用。

[0021] 第七方面，提供一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获得的SNP标记在筛选大眼肌面积猪群体方面的应用，其中，所述应用包括以下步骤：

[0022] 步骤I，提取待测猪的基因组DNA；

[0023] 步骤II，检测待测猪国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点的基因型；

[0024] 步骤III，根据基因型筛选大眼肌面积猪群体。

[0025] 第八方面，提供一种猪眼肌面积性状的遗传改良方法，其中，所述方法包括确定种猪的第一方面所述的SNP标记，并根据SNP标记做出继代选择的步骤。

[0026] 其中，种猪的继代选择国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点的基因型为GG的个体，淘汰该SNP位点基因型为TT和TG的个体。

[0027] 本发明所具有的有益效果包括：

[0028] (1)本发明所提供的与猪眼肌面积相关的SNP，可以增加优良猪种的选育速度，加快猪分子育种的步伐；

[0029] (2)本发明所提供的与猪眼肌面积相关的SNP，可以从一定程度上为高瘦肉率和大眼肌面积的猪育种提供切实可行的方案，提高猪生产企业的经济效益，同时可以正向利益驱动SNP分型芯片市场的发展与繁荣；

[0030] (3)本发明所提供的与猪眼肌面积相关的SNP，可以通过鉴定该SNP标记的基因型来筛选眼肌面积大的猪品系，所得猪个体品质更高的猪品系具有重要的经济效益与社会价值。

具体实施方式

[0031] 下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

[0032] 在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

[0033] 本发明针对目前猪育种标记少的缺陷，采用全基因组关联分析的方法挖掘与猪眼肌面积性状相关的SNP位点。

[0034] 本发明的第一方面，提供了一种与猪眼肌面积相关的SNP标记，所述SNP标记位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处。

[0035] 其中，所述SNP标记记为WU_10.2_4_134993242，其在Ensembl上对应的SNP位点号为rs319704174，位于ENSSSCG00000006890和ENSSSCG00000006891基因之间。

[0036] 在本发明中，所述猪眼肌面积优选为猪达100kg体重的活体眼肌面积。

[0037] 根据本发明一种优选的实施方式，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点位于核苷酸片段SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第151bp处，其差异导致眼肌面积的不同。

[0038] 在进一步优选的实施方式中，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP标记具有T/G多态性。

[0039] 其中，所述SNP位点对应的三种基因型分别为TT、TG和GG，TT基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基均为T，TG基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基为T和G，GG基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基均为G。

[0040] 在更进一步优选的实施方式中，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点的基因型为GG的猪，相较于基因型为TT和TG的猪有更大的眼肌面积。

[0041] 本发明的第二方面，提供了一种第一方面所述SNP标记的获取方法，所述方法包括以下步骤：

[0042] 步骤1，提取猪的基因组DNA。

[0043] 在本发明中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪群体中每个个体的基因组DNA，优选采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。

[0044] 优选地，对提取的猪基因组DNA进行浓度测定和质量检测，其中，所述DNA的A260/A280比值在1.8～2.0，A260/A230比值在1.7～1.9判定为纯度合格；将浓度高于300ng/μL判定为浓度合格。

[0045] 步骤2，对猪全基因组内的SNP进行基因型检测。

[0046] 本发明人研究发现，SNP分型技术的实施可以从一定程度上排除表型选择中饲养环境、饲料、疾病等因素对猪优良基因的误淘和误选，增强目标性状选择准确性。采用高密度SNP芯片进行基因分型，相对于传统的基因分型方法(如PCR、RFLP等)，可以在很短的时间周期内对大量的SNP进行基因分型，并能极大地降低成本。

[0047] 在本发明中，优选利用美国纽勤(Neogen)公司的Neogen_POR80K芯片进行基因型检测，更优选利用分型软件GenCall Version7.0.0进行。

[0048] 其中，在基因型检测的过程中，清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(Minimum Allele Frequency，MAF)小于1％的个体。

[0049] 步骤3，获取猪的眼肌面积表型数据，并与步骤2中的基因型数据进行关联分析。

[0050] 在本发明中，优选在猪个体体重处于85～105kg范围时测定其眼肌面积，采用B超扫描测定猪倒数第1～2肋骨间背最长肌的横断面面积，以平方厘米为单位，然后河北省地方标准(DB 13/T 2065‑2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正。

[0051] 优选地，按照如下校正公式转换成达100kg体重的活体眼肌面积：

[0052] 校正眼肌面积(cm2)＝实际眼肌面积(cm2)+{[100‑实际体重(kg)]×实际眼肌面积2
(cm)}/[实际体重(kg)+70]。

[0053] 根据本发明一种优选的实施方式，采用R语言包GAPIT将所述分型SNP位点与眼肌面积的表型数据进行全基因组关联分析。

[0054] 其中，所述R语言包GAPIT的统计模型为压缩混合线性模型，GAPIT的设计目的是在大数据集上准确地执行GWAS和基因组预测。混合线性模型(MLM)包括固定和随机效应，将个体纳入随机效应使得MLM能够整合个体之间的亲缘关系。

[0055] 在进一步优选的实施方式中，所述统计分析模型为：

[0056] y＝Xβ+Zμ+e

[0057] 其中，y是观察到的表型的值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(Q矩阵)和截距；μ是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值；X和Z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。

[0058] 通过上述关联分析，能够得到与猪眼肌面积相关的SNP标记。

[0059] 本发明的第三方面，提供了一种用于检测第一方面所述SNP标记的引物对，所述引物对为P1和P2，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

[0060] 本发明的第四方面，提供了一种检测第一方面所述SNP标记的方法，所述方法包括以下步骤：

[0061] 步骤i，扩增含有SNP标记的目的片段。

[0062] 其中，所述扩增优选以猪的基因组DNA为模板，采用第三方面所述的引物对P1和P2进行，所述目的片段优选为SEQ ID NO.1所示核苷酸片段。

[0063] 所述扩增为现有技术中常见的PCR扩增，优选地，所述扩增的体系包括：10×PCR Buffer(15mM MgCl2)、MgCl2(25mM)、dNTP mix10(25mM)、引物混合物(1μM)、HotstarTaq(5U/μl)和水(HPLC grade)。

[0064] 反应条件为：95℃300s；95℃4s，55℃30s，72℃30s，35个循环；16℃∞。

[0065] 步骤ii，对扩增产物进行测序，检测SNP标记。

[0066] 所述PCR扩增产物进行测序，得到的核苷酸序列与NCBI数据库中的猪基因组序列进行比对，得到对应的SNP位点的突变。

[0067] 本发明的第五方面，提供了一种第三方面所述引物对在鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积或在猪繁殖育种中的应用。

[0068] 优选地，所述猪繁殖育种为猪分子标记辅助育种。

[0069] 本发明的第六方面，提供了一种鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积的方法，所述方法包括检测猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的基因型的步骤。

[0070] 其中，若待测猪的国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点的基因型为GG，则该待测猪具有较大的眼肌面积，若待测猪的国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点的基因型为TT或TG，则该待测猪具有较小的眼肌面积。

[0071] 本发明的第七方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获得的SNP标记在鉴定或辅助鉴定猪眼肌面积方面的应用。

[0072] 本发明的第八方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第二方面所述方法获得的SNP标记在筛选大眼肌面积猪群体方面的应用，所述应用包括以下步骤：

[0073] 步骤I，提取待测猪的基因组DNA。

[0074] 步骤II，检测待测猪国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点的基因型。

[0075] 其中，所述SNP位点的基因型可以通过测序获得，或者采用现有技术中常用的方法获得，如Sequenom MassARRAY技术。

[0076] 步骤III，根据基因型筛选大眼肌面积猪群体。

[0077] 本发明的第九方面，提供了一种猪眼肌面积性状的遗传改良方法，所述方法包括确定种猪的上述SNP标记，并根据SNP标记做出相应选择的步骤。

[0078] 具体地，种猪的继代选择国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点的基因型为GG的个体，淘汰该SNP位点基因型为TT和TG的个体，以逐代提高该位点的纯合基因型GG的频率，从而提高眼肌产量。

[0079] 实施例

[0080] 以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

[0081] 实施例1

[0082] 1、试验动物

[0083] 本发明所应用的试验猪群体为河北美神原种猪场的1173头猪，其中，杜洛克公猪23头，杜洛克母猪177头，长白公猪15头，长白母猪363头，大白公猪2头，大白母猪593头。

[0084] 2、眼肌面积测定与校正

[0085] 在每头猪个体体重在85‑105kg范围内时测定个体的眼肌面积、体重，并记录测定日龄等数据。利用河北省地方标准(DB 13/T 2065‑2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正。同时，对试验猪群体的猪耳朵组织样进行采集，置于PBS缓冲液，低温保存。

[0086] 在测定体重时，同时测定活体眼肌面积。采用B超扫描测定倒数第1‑2肋骨间背最2
长肌的横断面面积，以平方厘米(cm)为单位。最后按如下校正公式转换成达100kg体重的活体眼肌面积：

[0087] 校正眼肌面积(cm2)＝实际眼肌面积(cm2)+{[100‑实际体重(kg)]×实际眼肌面积2
(cm)}/[实际体重(kg)+70]

[0088] 3、基因组DNA提取

[0089] 本试验采用北京百泰克生物技术有限公司的DP1902型号细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，从猪的耳组织中提取DNA，用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测，将检测合格的DNA放置于‑20℃长期保存。

[0090] 猪耳组织DNA的具体提取步骤如下：

[0091] (1)将猪耳组织剪碎后放入一个1.5ml离心管后，加入200μl组织裂解液TL，用大口径枪头吹打混匀；

[0092] (2)加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒轻摇充分混匀；

[0093] (3)将裂解的耳组织放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解；

[0094] (4)用一个1ml不带针头的一次性输液器抽打裂解物2‑3次；

[0095] (5)加入200μl结合液CB和100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇充分混匀；

[0096] (6)13000rpm离心5分钟，将上清液加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；

[0097] (7)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃废液；

[0098] (8)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液；

[0099] (9)加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液；

[0100] (10)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

[0101] (11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65‑70℃水浴中预热)，室温放置3‑5分钟，12000rpm离心1分钟；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟；洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量；

[0102] (12)DNA可以暂存于2‑8℃，如果要长时间存放，可以放置在‑20℃，为DNA分型做准备。

[0103] 上述步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时(如样品粘稠不易混匀)可以涡旋振荡15秒混匀。

[0104] 4、基因分型

[0105] 取基因组DNA，利用Neogen公司的Neogen_POR80K芯片进行猪基因型检测，采用分型软件GenCall Version7.0.0进行。

[0106] 在基因型检测的过程中，清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(Minimum Allele Frequency，MAF)小于1％的个体。

[0107] 其中，位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点在试验群体中的等位基因频率及基因型频率如表1所示。

[0108] 表1

[0109]

[0110] 5、猪眼肌面积数据和基因型数据的全基因组关联分析

[0111] 本研究进行全基因关联分析采用的分析软件包为R语言包GAPIT(系华盛顿大学张志武老师试验室研发)，此软件包的统计模型为压缩混合线性模型，如下所示：

[0112] y＝Xβ+Zμ+e

[0113] 其中y是观察到的表型的值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(Q矩阵)和截距；μ是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值；X和Z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。

[0114] 采用上述模型对所有分型SNP位点进行校正眼肌面积关联分析，然后采用Rstudio软件利用Kruskal‑Wallis方法对基因型数据和表型数据(眼肌面积)进行差异显著性检验，P‑value＜0.05表明差异极显著，结果显示：位于国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第134,993,242bp处的SNP位点与猪眼肌面积存在显著相关。该SNP位点不同基因型个体间的眼肌面积差异具体如表2所示。

[0115] 表2

[0116]

[0117] 由表2可知，所述WU_10.2_4_134993242位点的GG型个体眼肌面积极显著高于TT型和TG型个体(P<0.05)；由此可见，在猪群体中，继代选育GG型个体，可以培育眼肌面积较大的猪群体，进而达到提高猪的生产效率的目的，为育种生产活动带来较高的效益。

[0118] 在本发明中，利用SNP芯片检测猪WU_10.2_4_134993242位点的基因型，选育该位点GG型个体作为种猪，就可以筛选出高眼肌面积的长白猪，大白猪和杜洛克猪。本发明通过SNP分子标记对眼肌面积这一经济性状进行选择，可以增加优良猪种的选育速度，加快猪分子育种的步伐。

[0119] 以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。