一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种抑制伪狂犬病毒侵染的BanLec重组蛋白，通过体外原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的BanLec重组蛋白。以IPEC‑J2为细胞模型，检测了该重组蛋白对伪狂犬病毒感染细胞是否有抑制活性。通过CPE观测和病毒滴度测定发现该蛋白可以抑制伪狂犬病毒感染引起的细胞病变和死亡，并能显著抑制病毒侵染宿主细胞，蛋白用量在100μg/mL的条件下，对伪狂犬病毒的抑制率可达99.10％，该重组蛋白在伪狂犬病毒防治生物制剂中有潜在的应用前景。

权利要求

1.BanLec重组蛋白或编码BanLec重组蛋白的核酸分子或包含核酸分子的表达载体或包含表达载体的宿主细胞在制备治疗伪狂犬病药物中的应用，所述BanLec重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)是疱疹病毒科的一种双链DNA囊膜病毒，能感染猪、牛、羊等多种家畜和野生动物，引发以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症
状的伪狂犬病。PRV具有典型的疱疹病毒粒子结构，直径一般200nm左右，在电子显微镜下观
察呈圆形或者椭圆形。成熟的病毒粒子由外到内主要包括囊膜、蛋白质皮层、核衣壳和双链
线状基因组DNA，其中囊膜含有11个功能多样的糖蛋白包括gB、gC、gD等。

[0003] 猪是PRV的自然宿主和贮存宿主，受PRV感染后，成年猪出现呼吸道症状并可建立终身性潜伏感染，仔猪出现脑脊髓炎，病死率可达100％，怀孕母猪流产、死胎。2011年PRV强
变异毒株在我国出现，不仅给生猪养殖行业造成巨大经济损失，还出现多起感染人的病例，
PRV已成为公共卫生和健康养殖领域共同面临的一个重要威胁，抗PRV蛋白抑制剂的开发对
于PRV的有效防控具有重要意义。

[0004] 香蕉凝集素(BanLec)，是一种从成熟的香蕉果实里分离出来的二聚体的蛋白，分子量约30kDa。它采用的是β‑三棱镜(β‑prism)折叠模式，包含三个希腊钥匙转角基序，希腊
钥匙基序1和2都含有一个可以结合高甘露糖的GXXXD基序。BanLec被报道能够结合在某些
富含甘露糖的病毒上(比如HIV、HCV、Influenza virus)从而阻断病毒侵染细胞的进程。但
目前尚未报道它是否抑制伪狂犬病毒的侵染和增殖。然而，BanLec同时也具有分裂素的活
性，能够激活细胞的增殖，从而产生一定的副作用。

发明内容

[0005] 本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种BanLec重组蛋白，该蛋白保留了抗病毒的活性，能够抑制伪狂犬病毒感染，但去除了刺激
细胞增殖的副作用。

[0006] 本发明提出一种BanLec重组蛋白，所述重组蛋白包括BanLec蛋白的氨基酸序列，并且包括在第84位氨基酸处的突变，第84位氨基酸由组氨酸突变为苏氨酸。

[0007] 在本发明的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白的C末端添了亮氨酸和谷氨酸。

[0008] 在本发明的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白的C末端还添加了蛋白标签。

[0009] 在本发明的一些优选实施方式中，所述蛋白标签为HIS6标签。

[0010] 在本发明的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白具有：

[0011] (I)：如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：MNGAIKVGAWGGNGGSAFDMGPAYRIISVKIFSGDVVDGVDVTFTYYGKTETRHYGGSGGTPHEIVLQEGEYLVGMAGEVANYTGAVVLGKLGFSTNKKAYGPFGNTGGT
PFSLPIAAGKISGFFGRGGKFLDAIGVYLEPLEHHHHHH；

[0012] (II)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；

[0013] (III)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；

[0014] (IV)：与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(III)序列至少有80％同源性的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。

[0015] 本发明还提出一种核酸分子，所述核酸分子编码上述氨基酸。

[0016] 本发明还提出一种表达载体，所述表达载体包含上述核酸分子。

[0017] 本发明还提出一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体。

[0018] 本发明还提出一种菌株，所述菌株包含上述表达载体。

[0019] 本发明还提出上述BanLec重组蛋白或核酸分子或表达载体或宿主细胞或菌株在制备抑制疱疹病毒感染药物中的应用。

[0020] 本发明还提出上述BanLec重组蛋白或核酸分子或表达载体或宿主细胞或菌株在制备治疗伪狂犬病毒药物中的应用。

[0021] 本发明还提出一种药物，所述药物含有上述BanLec重组蛋白。

[0022] 在本发明的一些实施方式中，所述药物还包含药学可接受的载体和/或辅料。

[0023] 在本发明的一些实施方式中，所述药物的形式为注射剂、胶囊或贴剂。

[0024] 在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。

[0025] 在本发明的一些实施方式中，所述药物为疫苗。

[0026] 本发明的有益效果是：

[0027] 本发明公开了一种重组BanLec重组蛋白，该蛋白保留了抗病毒的活性，但去除了刺激细胞增殖的副作用，并在C端带有组氨酸标签，为该蛋白的检测和纯化提供了便利条
件。通过体外原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的BanLec重组蛋白。

[0028] 本发明还以IPEC‑J2为细胞模型，检测了该重组蛋白对伪狂犬病毒感染细胞是否有抑制活性，通过CPE观测和病毒滴度测定发现该蛋白可以抑制伪狂犬病毒感染引起的细
胞病变和死亡，并能显著抑制病毒侵染宿主细胞，蛋白用量在100μg/mL的条件下，对伪狂犬
病毒的抑制率可达99.10％，所述蛋白可用于阻断伪狂犬病毒对宿主细胞的侵染，可明显缓
解伪狂犬病毒感染引发的细胞病变，可能通过结合伪狂犬病毒gH等蛋白表面的甘露糖分子
来阻断病毒感染细胞，该重组蛋白在伪狂犬病毒防治生物制剂中有潜在的应用前景，并可
拓展至抑制疱疹病毒对细胞的侵染。

附图说明

[0029] 图1为本发明实施例1中的BanLecH84T表达分析。

[0030] 图2为本发明实施例1中的BanLecH84T亲和层析纯化结果图。

[0031] 图3为本发明实施例2中的BanLecH84T和PRV处理对细胞的影响。

[0032] 图4为BanLecH84T抑制伪狂犬病毒的复制；其中A图为BanLecH84T对PRV的滴度检测，B图为BanLecH84T对PRV的抑制率。

具体实施方式

[0033] 以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施
例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前
提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

[0034] 实施例1

[0035] 1.重组质粒BanLecH84T‑pET 24b的构建及转化

[0036] 通过酶切位点Nde I和Xho I将BanLecH84T编码区连入含C端HIS标签的载体pET24b获得重组表达质粒。将1μl重组质粒BanLecH84T‑pET 24b加到装有100μl Rosetta 
Blue pLys S E.coli cells感受态的1.5ml EP管中，冰浴30min，42℃90s，再次放置在冰上
3min，向管中加入0.5ml 2YT液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢
复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。取出EP管，2500rpm离心5min，去除上
清，轻轻吹打悬菌。将取上述菌液涂布于含卡那霉素的筛选平板上,然后正面向上放置
0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。

[0037] 2.BanLecH84T蛋白的表达

[0038] 设置不同诱导条件对进行BanLecH84T蛋白试表达，蛋白序列如SEQ ID NO.1所示：MNGAIKVGAWGGNGGSAFDMGPAYRIISVKIFSGDVVDGVDVTFTYYGKTETRHYGGSGGTPHEIVLQEGEYLVGM
AGEVANYTGAVVLGKLGFSTNKKAYGPFGNTGGTPFSLPIAAGKISGFFGRGGKFLDAIGVYLEPLEHHHHHH。挑
取转化子单菌落接种于适量含卡那霉素的2YT液体培养基中。待OD600达到0.8时加入终浓
度为0mM、1mM、0.1mM的IPTG，分别于37℃诱导5h，16℃诱导16h。收集细菌后，以适量PBS重悬
菌体，超声裂解，分别取上清和沉淀加入SDS上样缓冲液制备电泳样品，并以15％分离胶浓
度的SDS‑PAGE电泳分析，结果见图1。从图1中的电泳结果表明，在BanLecH84T 1mM IPTG，37
℃诱导5h，可以得到较多的可溶蛋白，BanLecH84T以可溶蛋白形式在大肠杆菌中表达，最适
诱导表达条件为1mM IPTG，37℃诱导表达5h，于是接下来采用这个条件来大量表达目的蛋
白。

[0039] 取400μl菌液加到50ml含卡那霉素和2YT培养基的三角瓶中，200rpm 37℃培养5h。接种20ml于2L含有Amp抗性(100μg/ml)的LB大瓶中，200rpm 37℃培养至OD600＝0.6～0.8，
加入IPTG至终浓度为1mM，37℃振荡培养5h后收菌提取蛋白。

[0040] 收菌(以下步骤均在低温下进行)：6000rpm，15min离心，去除上清，将沉淀(大肠杆菌)用50ml左右的分子筛缓冲液(20mM Tris,50mM NaCl，pH8.0)悬浮，收集于小瓶中，冰上
超声裂解(超声6S，间隔12S，120次，300W)。15000rpm，20min离心，去除沉淀，将上清用0.22μ
m的滤器过滤除菌，倒入干净的小瓶中放冰上备用。

[0041] 3.BanLecH84T的纯化

[0042] 处理后的上清液在4℃通过蠕动泵以1～2ml/min的速度流入5ml His Trap预装柱中，从而使得带His标签的nectin4 V结构域蛋白和His‑Beads结合。利用快速蛋白液相色谱
(AKTA)来进行蛋白质分离纯化。A泵中流过的是分子筛凝胶层析缓冲液，即20mM Tris，50mM 
NaCl，pH8.0；B泵中流过的是20mM Tris，50mM NaCl，400mM咪唑，pH8.0。通过B泵中液体与A
泵中液体的百分比来调节流过His Trap预装柱的液体中相应咪唑的浓度，从而形成一个咪
唑洗脱梯度，依次为20mM、40mM、100mM、200mM、400mM。不同梯度下洗脱的蛋白经过5％的
SDS‑PAGE检测，从而鉴定出目的蛋白是在哪个咪唑梯度下洗脱下来。以3kD截留的超滤管将
目的蛋白洗脱液浓缩，然后利用HiTrap Desalting 5ml柱去除咪唑，收集含目的蛋白的洗
脱峰，以SDS‑PAGE凝胶电泳检测蛋白质，结果见图2。从图2可以看出100mM的咪唑能洗脱部
分目的蛋白，400mM咪唑洗脱下来的蛋白纯度很高，没有杂蛋白。

[0043] 实施例2

[0044] 1.BanLecH84T和PRV对细胞形态的影响

[0045] 将IPEC‑J2接种至12孔细胞培养板中(37℃、5％CO2)中，培养至单层，每孔2х105个，设置对照组和3个不同处理组，对照组不加BanLecH84T和PRV，3个处理组分别加入PRV、
BanLecH84T(100μg/ml)、PRV+BanLecH84T(100μg/ml)，每组3个重复，针对不同浓度的
BanLecH84T(1,10，100μg/ml)设置多块12孔板。细胞接种PRV(100μL/well，MOI＝0.1)后孵
育2h后移除上清液，换成细胞培养基，在处理12h、24h、36h、48h后等不同时间点在显微镜下
观察各孔中细胞病变程度，拍照记录细胞形态，48h后的细胞形态结果见图3，可以看出，PRV
感染细胞引起一系列病变包括细胞变圆、脱落漂浮等，加入BanLecH84T可以抑制PRV引起的
细胞病变，用BanLecH84T直接处理细胞不会引起细胞病变。

[0046] 2.BanLecH84T抑制伪狂犬病毒的复制实验

[0047] 将IPEC‑J2接种至12孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养，24h后在病毒对照组中只加PRV‑LC病毒，在处理组中加入1ml PRV与BanLecH84T混合液，4℃培养1h，分别弃去病毒
液、混合液，PBS清洗三遍，加入含2％FBS DMEM F12培养基继续培养。细胞对照组为无血清
培养基培养1h，后换成2％DMEM F12培养基。每个组分别设3个生物学重复，每个孔体系皆为
1ml。分别12h、24h、48h收集细胞样品，提取核酸，以荧光定量PCR测定PRV的gD基因表达量，
对比实验组和对照组gD基因拷贝数，测定病毒对照组和BanLecH84T处理组的PRV滴度，结果
见图4中A图；计算BanLecH84T对PRV抑制率，结果见图4中B图，可以看出BanLecH84T可显著
降低PRV感染细胞IPEC‑J2 24h和48h的滴度，在培养24h后BanLecH84T对PRV的抑制率为
97.70％，在培养48h后BanLecH84T对PRV的抑制率为99.10％，BanLecH84T对PRV有很好的抑
制作用。

[0048] 上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作
出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。