人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法

摘要

本发明公开了一种人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法，该方法包括如下步骤：针对病毒抗原进行噬菌体抗体库筛选，获得达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；原型IgG抗体亲和力成熟后，将优化后的抗体重链可变区嫁接到人源IgM抗体的恒定区上组成嵌合体重链，Kappa轻链可不变。表达、纯化以获得人源化IgM单克隆抗体标准物质原料；对人源化IgM单克隆抗体标准物质原料进行纯度表征，蛋白质活性表征和结构表征；在纯度充分表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，经均匀性、稳定性检验，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对人源化IgM单克隆抗体标准物质进行定值。

权利要求

1.一种人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）针对病毒抗原进行噬菌体抗体库筛选，获得达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；

所述抗体库包括正常人天然库、病人抗体库、合成的人源抗体库及免疫动物得到的抗体库，9

总库容量在10以上；

（2）将IgG抗体重链可变区嫁接到人源IgM重链恒定区框架上，Kappa 轻链不变，构建出与原IgG抗体配套的人源化IgM单克隆嵌合抗体；

（3）细胞悬浮培养，瞬时转染表达人源化IgM单克隆嵌合抗体，离心去除细胞收集上清液，采用Protein L亲和纯化、离子交换和分子筛分步进行分离纯化得到人源化IgM单克隆抗体的标准物质原料；

（4）对人源化IgM单克隆抗体进行纯度表征；

（5）对人源化IgM单克隆抗体进行蛋白质活性表征；

（6）对人源化IgM单克隆抗体进行结构表征，结构表征信息包括IgM单克隆抗体切去糖链后分子量测定、切去糖链还原后分子量测定、肽谱表征；

（7）对人源化IgM单抗蛋白N‑糖基化修饰的糖型和含量进行测定，包括寡糖链释放、标记、液质联用分析和数据处理四个步骤，分析得到各个糖型的相对含量丰度和分子量；根据各个糖型的相对含量丰度和分子量，计算得到人源IgM单抗蛋白单个糖基化位点的糖链加权平均分子量；

（8）基于（6）和（7）的测定结果计算人源化IgM单克隆抗体的完整分子量：根据人源化IgM重链和轻链分子量以及单个糖基化位点的糖链加权平均分子量，由以下公式计算得到人源化IgM单克隆抗体的完整分子量；

IgM亚单元的分子量（不含糖）： ；

IgM抗体的分子量（不含糖）： ；

IgM抗体的糖链分子量：  Da；

N蛋白人源化IgM单抗蛋白的完整分子量（含糖）： ；

其中：

——切去糖链还原后的IgM重链分子量，Da；

——切去糖链还原后的IgM轻链分子量，Da；

IgM亚单元含的链内二硫键对数；

IgM亚单元分子量，Da；

n——IgM抗体包含的IgM亚单元个数；

IgM抗体含的亚单元链间的二硫键对数；

IgM分子量，Da；

IgM抗体单个糖基化位点的糖链加权平均分子量，Da；

m——IgM亚单元含的糖基化位点数；

IgM抗体的糖链分子量；

IgM抗体的完整分子量；

（9）在纯度充分表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，经均匀性、稳定性检验后，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对该单克隆抗体进行标准物质定值。

2.根据权利要求1所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，先制备IgG原型抗体，针对病毒抗原筛选2种或2种以上达到亲和力阈值需求‑7

的IgG原型抗体， 所述原型抗体需针对抗原的不同表位；所述亲和力阈值Kd<10 。

3.根据权利要求2所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：在所述步骤（2）之前，根据需要对获得的IgG原型抗体进行体外亲和力成熟，提高亲和力；

所述步骤（2）中，将所述亲和力成熟后IgG抗体的重链可变区嫁接克隆到人源IgM抗体的重链恒定区上，Kappa 轻链不变。

4.根据权利要求3所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，细胞悬浮培养，瞬时转染表达人源IgM抗体，离心去除细胞收集上清液，采用Protein L亲和纯化，洗脱液采用pH3.0的醋酸盐缓冲液；收集到的蛋白调节pH到7.4，用疏水混合机制填料captoMMC进行离子交换纯化，采用低盐缓冲液线性梯度洗脱；洗脱后的目的蛋白超滤浓缩后继续用分子筛Superdex200按分子量分离纯化，获得纯化后的IgM蛋白。

5.根据权利要求4所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，纯度表征方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效凝胶排阻色谱法；单克隆抗体的标准物质原料的纯度需≥95%；如果纯度<95%，则继续按照步骤（4）所述方法对IgM单克隆抗体进行纯化，将纯度提高到95%以上；

所述步骤（5）中，活性表征方法包括酶联免疫吸附法、表面等离子共振效价测定法、生物膜层干涉法。

6.根据权利要求5所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中，质谱分析测定得到还原后IgM单克隆抗体轻链分子量、切去糖链还原后IgM单克隆抗体重链分子量，并确认与理论分子量是否一致；

进行单抗的肽谱分析，将单抗经酶切处理后经质谱仪进行检测，通过软件进行数据库搜索对MS图谱进行处理后得到肽图序列覆盖率；

通过胰蛋白酶、糜蛋白酶的多种酶切方式或者多次质谱分析提高肽谱的序列覆盖率；

肽图的序列覆盖率需达到90%以上。

7.根据权利要求6所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（7）中，采用肽‑N‑糖苷酶F释放寡糖链，采用商品化试剂标记寡糖链，定性、定量分析得到各个糖型的相对含量丰度和分子量，计算得到人源IgM单抗蛋白单个糖基化位点的糖链加权平均分子量。

8.根据权利要求7所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（9）中，对人源化IgM单克隆抗体标准物质进行均匀性检验，采用同位素稀释质谱法进行测定，通过统计学方法分析确定标准物质是否均匀；对人源化IgM单克隆抗体标准物质进行稳定性检验，稳定性检验包括短期稳定性和长期稳定性，短期稳定性为模拟运输条件下为期一周的稳定性考察，长期稳定性为‑70℃储存条件下6个月及以上的稳定性；

以亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对人源化IgM单克隆抗体标准物质进行定值，定值中使用的分子量由步骤（8）得到。

说明书

人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及IgM抗体检测标准物质技术领域，特别是涉及一种人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法。

背景技术

[0002] 免疫学检测是临床检测的重要方法之一，它是一种特异性的诊断方法，广泛用于临床检测、确诊和流行病学调查，可用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗
原(如：血清学检测)。免疫学检测方法是利用抗原抗体之间的特异性和可逆空间结合来检
测目标物。按检测目标物不同，免疫检测方法主要可分为病毒抗原检测和血清IgM/IgG抗体
检测；按检测原理不同，可以分为胶体金法、免疫层析法、酶联免疫吸附法、化学发光法等。
免疫学检测作为医院诊疗工作的重要组成部分，为临床诊断和治疗用药等提供依据，免疫
学检测的质量对临床诊断结果和治疗效果有最直接的影响。

[0003] IgM是分子量最大的免疫球蛋白，主要分布于血清中。IgM是最原始的抗体。在个体发育中，机体最先合成的抗体也是IgM，其后才相继出现IgG与IgA。在感染的早期，IgM起着
先锋免疫的作用。临床上通过检测IgM型抗体，可作为某些传染病早期诊断的指标之一。

[0004] 标准物质(ReferenceMaterial，RM)是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备、评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。标准物质是实现检测结
果准确、一致、可比的主要工具，也是保证量值有效传递的计量实物标准。随着国家对体外
诊断试剂监督管理力度的加大和对检测技术要求的不断提高，对标准物质的需求和依赖也
越来越强烈。血清IgM抗体检测也需要标准物质对检测方法和试剂盒进行质量控制和评价。

[0005] 然而对于人源的临床标准物质，很多标准物质原料需要从病人血液中提取，这极大限制了临床类标准物质的研制。如果病人难找到、或者血液中含量很低，就需要考虑采用
重组蛋白技术体外表达和纯化。针对于难获取原料的血清IgM抗体标准物质的研发，如果不
应用重组蛋白技术设计、制备，很难想象有足量一致的、人源提取的血清来源IgM抗体标准
物质及时分配、应用于全世界，尤其是应用于像新冠这种突发流行病危机。这也是现有的临
床诊断抗体标准物质数目只寥寥数种的原因，一是需要从病人血液提取，原料来源受限；二
是针对提取的多克隆抗体的表征、定值难度太大，需要建立可应用于它们的基准定值方法。

[0006] 具体来说，以急性传染病为例，检测试剂研发周期一般比较短，短时间难以开发研发和生产的标准化流程，难免出现性能高低不一、品质良莠不齐的问题。试剂盒性能评价和
质量控制也非常急迫。标准物质作为准确量值的载体，是评价试剂质量的“砝码”，并可以用
于检测方法开发与验证，对试剂盒研发和评价进行质量控制和评价等。

[0007] 现阶段，试剂公司多直接采用阳性血清作为IgM检测研发的质控品。阳性血清是混合的病人灭活血清，未经过提取纯化，纯度非常低且多克隆来源(因为除了血清基质和抗
(病毒)抗原的抗体，还含有极高丰度的不抗(病毒)抗原的本底抗体存在)。它作为质控品的
缺陷是具有生物安全风险和批次来源差异，无法精确复制，也无法精确表征，更不用说在其
基础上研制纯度、稳定性、均匀性和定值精确性要求极高的标准物质。很多厂家、研发机构
无法及时获得阳性血清，在研发过程中只能依靠企业自行研制的物质部分替代质控品的功
能，因此研制无生物安全风险、可精确复制、可准确表征与定量的病毒IgM抗体标准物质十
分必要。

[0008] 综上所述，病人血清尤其是未知病毒引发的急性传染病血清中的IgM属于多克隆抗体，无法获取IgM原料应用于标准物质制备。利用IgM单克隆抗体安全、易生产、可复制、能
准确表征、可应用基准方法准确定值的特点，可设计、研制病毒IgM单克隆抗体标准物质，用
于如传染病中血清抗体的免疫检测方法开发、检测试剂盒质量控制与评价，实验室质量控
制，突破目前临床疾病中血清抗体标准物质研制和应用的瓶颈限制。

[0009] 然而由于IgM抗体为多聚体，含有多个亚基，分子量超过1000KDa，每个亚基的重链都含有多个糖基化位点，结构复杂、分子量大。现阶段没有针对结构如此复杂，分子量最大
的免疫球蛋白的标准物质制备方法。因此建立一种人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备
方法十分必要。

发明内容

[0010] 本发明的目的是提供一种人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法。本发明制得的单克隆抗体标准物质可以模拟病人血清中抗病毒的多克隆抗体，与抗体检测试剂盒中
的抗原和二抗反应，从而评价抗体检测试剂盒和方法的性能和可靠性，为突发的急性传染
病血清抗体的检测提供质量控制。该方法具有良好的实用性、准确性、可靠性和溯源性。

[0011] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

[0012] 一种人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，包括如下步骤：

[0013] (1)针对病毒抗原进行噬菌体抗体库筛选，获得达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；所述抗体库包括正常人天然库、病人抗体库、合成的人源抗体库及免疫动物得到的抗体
9
库，总库容量在10以上；

[0014] (2)将IgG抗体重链可变区嫁接到人源IgM重链恒定区框架上，Kappa轻链可不变，构建出与原IgG抗体配套的人源化IgM单克隆嵌合抗体；

[0015] (3)细胞悬浮培养，瞬时转染表达人源化IgM抗体，离心去除细胞收集上清液，采用Protein L亲和纯化、离子交换和分子筛分步进行分离纯化得到人源化IgM单克隆抗体的标
准物质原料；

[0016] (4)对人源化IgM单克隆抗体进行纯度表征；

[0017] (5)对人源化IgM单克隆抗体进行蛋白质活性表征；

[0018] (6)对人源化IgM单克隆抗体进行结构表征，结构表征信息包括IgM单克隆抗体切去糖链后分子量测定、切去糖链还原后分子量测定、肽谱表征；

[0019] (7)对人源化IgM单抗蛋白N‑糖基化修饰的糖型和含量进行测定，包括寡糖链释放、标记、液质联用分析和数据处理四个步骤，分析得到各个糖型的相对含量丰度和分子
量。根据各个糖型的相对含量丰度和分子量，计算得到人源化IgM单抗蛋白单个糖基化位点
的糖链加权平均分子量；

[0020] (8)人源化IgM单克隆抗体的完整分子量计算基于(6)和(7)的测定，根据IgM重链和轻链分子量，以及单个糖基化位点的糖链加权平均分子量，计算得到人源化IgM单克隆抗
体的完整分子量；

[0021] (9)在纯度充分表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，经均匀性、稳定性检验后，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对该单克隆抗体进行标准物质定值。

[0022] 其中，所述步骤(1)中，需要先制备IgG原型抗体，针对病毒抗原筛选2种或2种以上达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体，所述原型抗体需针对抗原的不同表位；所述亲和力阈
‑7
值Kd<10 。

[0023] 所述步骤(2)之前，根据需要可对获得的IgG原型抗体进行体外亲和力成熟，提高亲和力；

[0024] 所述步骤(2)中，将上述亲和力成熟后IgG抗体的重链可变区嫁接克隆到人源IgM抗体的重链恒定区上，Kappa轻链可不变。

[0025] 所述步骤(3)中，细胞悬浮培养，瞬时转染表达人源化IgM抗体，离心去除细胞收集上清液，采用Protein L亲和纯化，洗脱液采用pH3.0的醋酸盐缓冲液；收集到的蛋白调节pH
到7.4，用疏水混合机制填料captoMMC进行离子交换纯化，采用低盐缓冲液线性梯度洗脱；
洗脱后的目的蛋白超滤浓缩后继续用分子筛Superdex200按分子量分离纯化，获得纯化后
的IgM蛋白。

[0026] 所述步骤(4)中，纯度表征方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效凝胶排阻色谱法；单克隆抗体的标准物质原料的纯度需≥95％；如果纯度<95％，则继续按照步骤(4)所述方
法对IgM单克隆抗体进行纯化，将纯度提高到95％以上。

[0027] 所述步骤(5)中，活性表征方法包括酶联免疫吸附法、表面等离子共振效价测定法、生物膜层干涉法。

[0028] 所述步骤(6)中，质谱分析测定得到还原后IgM单克隆抗体轻链分子量、切去糖链还原后IgM单克隆抗体重链分子量，并确认与理论分子量是否一致。

[0029] 进行单抗的肽谱分析，将单抗经酶切处理后经质谱仪进行检测，通过软件进行数据库搜索对MS图谱进行处理后得到肽图序列覆盖率；

[0030] 通过胰蛋白酶、糜蛋白酶的多种酶切方式或者多次质谱分析提高肽谱的序列覆盖率；肽图的序列覆盖率需达到90％以上。

[0031] 所述步骤(7)中，采用肽‑N‑糖苷酶F(PNGase F)释放寡糖链，可采用商品化试剂标记寡糖链，定性、定量分析得到各个糖型的相对含量丰度和分子量，计算得到人源化IgM单
抗蛋白单个糖基化位点的糖链加权平均分子量。

[0032] 所述步骤(8)中，人源化IgM单克隆抗体的完整分子量计算基于(7)和(8)的测定，根据IgM重链和轻链分子量，以及单个糖基化位点的糖链加权平均分子量，由以下公式计算
得到人源化IgM单克隆抗体的完整分子量。

[0033] IgM亚单元的分子量(不含糖)：(MW重+MW轻)×2s链内×2＝MW亚单元(不含糖)Da；

[0034] IgM抗体的分子量(不含糖)：MW亚单元(不含糖)×n‑s链间×2＝MWIgM(不含糖)Da；

[0035] IgM抗体的糖链分子量：(MW糖链加权平均分子量‑18)×m×n＝MWIgM糖链Da；

[0036] N蛋白人源化IgM单抗蛋白的完整分子量(含糖)：MWIgM(不含糖)+MWIgM糖链＝

[0037] MWIgM完整Da；

[0038] 其中：

[0039] MW重——切去糖链还原后的IgM重链分子量(Da)；

[0040] MW轻——切去糖链还原后的IgM轻链分子量(Da)；

[0041] s链内——IgM亚单元含的链内二硫键对数；

[0042] MW亚单元(不含糖)——不含糖链的IgM亚单元分子量(Da)

[0043] n——IgM抗体包含的IgM亚单元个数；

[0044] s链间——IgM抗体含的亚单元链间的二硫键对数；

[0045] MWIgM(不含糖)——不含糖链的IgM分子量(Da)；

[0046] MW糖链加权平均分子量——IgM抗体单个糖基化位点的糖链加权平均分子量(Da)；

[0047] m——IgM亚单元含的糖基化位点数；

[0048] MWIgM糖链——IgM抗体的糖链分子量；

[0049] MWIgM完整——IgM抗体的完整分子量。

[0050] 所述步骤(9)中，对人源化IgM单克隆抗体标准物质进行均匀性检验，采用同位素稀释质谱法进行测定，通过统计学方法分析确定标准物质是否均匀；对人源化IgM单克隆抗
体标准物质进行稳定性检验，稳定性检验包括短期稳定性和长期稳定性，短期稳定性为模
拟运输条件下为期一周的稳定性考察，长期稳定性为‑70℃储存条件下6个月及以上的稳定
性；

[0051] 以亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对人源化IgM单克隆抗体标准
物质进行定值，定值中使用的分子量由步骤(8)得到。

[0052] 同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

[0053] (1)目前，现有技术中并没有针对IgM抗体标准物质的制备方法，也没有可用的IgM抗体标准物质，本发明创新的建立了IgM抗体标准物质的制备方法，可用于今后IgM抗体标
准物质的研制。

[0054] (2)本发明建立的用于传染病血清抗体检测的IgM抗体标准物质制备方法是完全创新的方法，开创了血清IgM抗体检测用抗体标准物质研制的新思路，主要包括IgM抗体标
准物质原料的设计、制备和抗体蛋白的表征、定值两个方面。

[0055] 导致现有的临床诊断抗体标准物质数目只有寥寥数种的两大瓶颈：一是需要从病人血液提取，原料来源受限；二是针对提取的多克隆抗体的表征、定值难度太大，需要建立
可应用于它们的基准定值方法。以往对于人源的临床标准物质，很多需要从病人血液中提
取。如果病人难找到、或者血液中含量很低，就需要考虑采用重组蛋白技术体外表达和纯
化。针对于难获取原料的血清IgM抗体标准物质的研发，如果不应用重组蛋白技术设计、制
备，很难想象有足量一致的、人源提取的血清来源IgM抗体标准物质及时分配、应用于全球，
尤其是应用于像新冠这种突发流行病危机。

[0056] (3)本发明建立的方法所研制的人源化IgM抗体标准物质可以模拟人血清中抗病毒的IgM多克隆抗体，与现有阳性血清作为检测质控品相比，克服了传染病阳性血清的传染
性风险缺点，以及阳性血清中IgM多克隆抗体无法精确表征、定量、复制的缺点。

[0057] 现阶段，试剂公司多直接采用阳性血清作为IgM检测研发的质控品。阳性血清是混合的病人灭活血清，只经过灭活处理，未经过提取纯化，纯度很低且多克隆来源(除了血清
基质和抗(病毒)抗原的抗体，还含有极高丰度的不抗(病毒)抗原的本底抗体存在)。它作为
质控品的缺陷是具有生物安全风险和批次来源差异，无法精确复制；同时，由于成分高度复
杂，在人类现有技术水平无法准确表征和定量，阳性血清也不能适用于基准方法定值，无法
实现量值溯源。标准物质要求纯度高、稳定性好，因此，阳性血清不宜作为标准物质原料，而
研制无生物安全风险、可精确复制、可准确表征与定量的(病毒)抗原IgM单克隆抗体标准物
质能有效解决这个问题。

[0058] 本发明建立的方法所研制的人源化IgM抗体标准物质可以精确表征、定量和复制，可用于传染病血清抗体检测试剂盒的质量控制与评价，检测方法的验证与开发。

[0059] (4)本发明建立的方法可以用于一系列IgM抗体检测所需IgM抗体标准物质的研制，并且可以针对不同的抗原表位研制多个IgM单克隆抗体标准物质，形成多个表位的IgM
抗体标准物质库，更好的模拟血清中的多克隆抗体。

[0060] (5)本发明建立的IgM抗体蛋白质定值方法，标准物质具有量值溯源性，含量测定结果可以直接溯源到SI单位。

[0061] 下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法作进一步说明。

附图说明

[0062] 图1为N蛋白人源IgM单抗去糖还原后重链质谱分析和去卷积结果图；

[0063] 图2为N蛋白人源IgM单抗去糖还原后轻链质谱分析和去卷积结果图；

[0064] 图3为N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质定值结果的溯源性。

具体实施方式

[0065] 实施例1

[0066] 对于突然爆发的新型病毒引起的急性传染病，以2019‑2020年的新冠病毒大流行为例，展示2019‑nCoV新型冠状病毒N蛋白人源IgM单克隆抗体溶液标准物质的研制过程，具
体设计、实验过程如下：

[0067] 1、2019‑nCoV新型冠状病毒N蛋白人源IgM单克隆抗体的筛选、蛋白的表达

[0068] 根据NCBI GenBank中公布的新型冠状病毒N基因(28274‑29533位)序列为依据，表9
达N完整蛋白，利用N蛋白免疫动物后构建的噬菌体展示库(库容约为10)对N抗原进行抗体
‑7
筛选，获得具有一定亲和力的IgG原型抗体(亲和力阈值Kd<10 )。将IgG原型抗体进行亲和
力成熟，然后把优化后的IgG抗体可变区克隆到人源IgM抗体的恒定区上。HEK293F细胞悬浮
培养，瞬时转染表达IgM，培养后收集细胞上清液。

[0069] 2、2019‑nCoV新型冠状病毒N蛋白人源IgM单克隆抗体的纯化和纯度表征

[0070] 细胞上清液过纯化后得到N蛋白人源IgM单抗的标准物质原料，纯化步骤包括：细胞上清液8000rpm高速离心20min*2次，离心后上清液用0.45um膜过滤；调节pH到7.4后
proteinL亲和柱4℃上样，PBS柱上冲洗，使用pH3.0的醋酸盐buffer洗脱并收集目的蛋白；
收集到的蛋白迅速调节pH到7.4并10倍稀释后上样离子交换和疏水混合机制填料
captoMMC；低盐buffer洗涤后，用盐浓度梯度线性梯度洗脱；洗脱后的目的蛋白超滤浓缩；
继续用分子筛Superdex200按分子量分离纯化，舍弃单体和二聚体收集和天然状态一致的
IgM抗体。

[0071] 获得标准物质原料后，获得标准物质原料后，首先对获得N蛋白人源IgM抗体进行了SDS‑PAGE电泳纯度表征，电泳条件如下：取20μg N蛋白原料与等体积的1X电泳上样缓冲
液混合，在沸水浴中煮沸5min，每个泳道上样10μg N蛋白。采用伯乐公司Mini‑PROTEAN预制
胶进行分离，电泳电压120V，电泳时间45min。电泳完成后用考马斯亮蓝进行染色，染色完毕
后用甲醇‑乙酸溶液进行脱色并成像。

[0072] 对获得的N蛋白人源IgM单抗原料采用高效凝胶排阻色谱法进行了纯度表征，液相色谱条件如下：

[0073] 采用Wyatt WTC‑030S5高效液相尺寸排阻色谱柱(5μm，7.8mm×30cm)，柱温25℃，流动相为磷酸盐缓冲液(Corning康宁21‑040‑CV PBS缓冲液)，等度洗脱，流速为0.8ml/
min，操作仪器为Agilent1200，检测器包括：UV紫外检测器(检测波长280nm)、RI示差折光检
测器、MALS多角度光散射检测器，采集时间20min，样品稀释后浓度约为1mg/mL，进样量30μ
L，平行测定3次，以100mM柠檬酸缓冲液为空白对照。

[0074] MALS多角度光散射检测器能够直接测量分子量分布，图中所示蛋白的分子量为1128.28kD，分子量计算偏差为±3.85％，确证了该IgM抗体为六聚体。

[0075] 对N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质的纯度进行了3次测定，根据面积归一法对六聚体IgM，以及单体和高聚体形式的比例进行了统计(如表1所示)，N蛋白人源IgM单抗溶液
标准物质的平均纯度为95.76％，相对标准偏差0.4％，单体和高聚体形式占4.24％。

[0076] 表1N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质SEC纯度表征结果

[0077]

[0078] 3、N蛋白人源IgM单抗的活性表征

[0079] 利用生物大分子相互作用分析仪Biacore评价N蛋白人源IgM单抗和N蛋白抗原的亲和力。用氨基耦联方法将N蛋白人源IgM单抗(20μg/μl，pH4.5醋酸钠溶液)固定在芯片上，
固定值约2000RU，3通道。流动相为新型冠状病毒N重组蛋白抗原梯度稀释，流速30μl/min，
进样30μl，解离120s，用Gly(pH 1.5)10μl再生。N抗原全长47.08kD，亲和力测试重复4次。结
果如表2所示，N蛋白人源IgM单抗和N蛋白抗原的亲和力约为1.7e‑8M。

[0080] 表2N蛋白人源IgM单抗和N蛋白抗原的亲和力评价结果

[0081]

[0082]

[0083] 4、IgM单抗的结构表征和分子量测定

[0084] N蛋白人源IgM单抗蛋白是由其中两个重链(μ)与两个轻链(L)共价配对的亚单元以六聚体(μ2L2)6的形式存在，IgM亚单元组装后，重链通过链间二硫键共价连接。亚单元内
部有17对二硫键，链间有12对二硫键。

[0085] 采用Waters Xevo G2‑XS Qtof质谱仪进行检测；分析软件为Waters UNIFI，用该软件对MS图谱去卷积处理后得到相应分子量信息。

[0086] 样品处理方法如下所示：

[0087] 对蛋白样品进行了还原切糖后分子量测定。去糖后还原分子量测定方法是取蛋白去糖后的样品50μg，加入DTT使之终浓度为20mM，56℃反应60min，加A液(0.1％甲酸+2％乙
腈)稀释至1mg/mL，进样0.1ug进行分析。

[0088] 仪器所使用的色谱条件如下：

[0089] 色谱柱：Waters BEH Protein C4色谱柱；1.7μm；ID 2.1mm；length 50mm。

[0090] 流动相：A液，0.1％甲酸水；B液，0.1％甲酸乙腈。

[0091] 流速：0.2mL/min。

[0092] 洗脱条件：

[0093]

[0094] 质谱条件为：数据采集时间为5分钟；MS Range：1000‑9000；

[0095] 数据分析采用Waters UNIFI软件对MS图谱去卷积处理得到分子量信息。

[0096] N蛋白人源IgM单抗样品切糖还原后，重链分子量质谱图和去卷积结果如图1所示，实测切糖后重链分子量与理论切糖重链分子量一致。图2显示了N蛋白人源IgM单抗还原后
轻链的质谱图和去卷积结果，轻链不含糖链，实测轻链分子量与理论分子量一致。

[0097] 对N蛋白人源IgM单抗蛋白N‑糖基化修饰的糖型和含量进行了测定。IgM单抗切糖后用Waters RapiFluor MS标记试剂对N‑糖标记后进行检测。采用Waters UPLC with FLR 
detector串联Waters Xevo G2‑XS Qtof质谱仪进行检测。分析软件为Waters UNIFI。

[0098] 仪器所使用的条件如下所示：

[0099] 色谱柱：Waters BEH Glycan色谱柱；1.7μm；ID 2.1mm；length 150mm。

[0100] 流动相：A液，50mM甲酸按(pH 4.4)；B液，乙腈。

[0101] 洗脱条件：

[0102]

[0103] 质谱条件为：数据采集时间为55分钟；MS Range：500‑2000；

[0104] N‑糖链(由天冬酰胺连接寡糖)结构分析包括寡糖链释放、标记、液质联用分析和数据处理四个步骤。然后对IgM切下的寡糖碎片进行了质谱分析和结构解析，获得了IgM单
抗蛋白所含糖链的精细结构信息，如表3所示。根据各个糖型的相对含量丰度和理论分子
量，计算得到N蛋白人源IgM单抗蛋白单个糖基化位点的糖链加权平均分子量为1704.72。

[0105] 表3 N蛋白人源IgM单抗蛋白糖链的结构和含量信息

[0106]

[0107]

[0108] 基于以上N蛋白人源IgM单抗蛋白的结构和分子量的表征，我们根据IgM重链和轻链分子量，以及单个糖基化位点的糖链加权平均分子量，计算得到：

[0109] IgM亚单元的分子量(不含糖)：(62616.5+23259.82)×2‑17×2＝171718.64Da；

[0110] IgM抗体的分子量(不含糖)：171718.64×6‑12×2＝1030287.84Da；

[0111] IgM抗体的糖链分子量：(1704.72‑18)×10×6＝101203.3161Da；

[0112] N蛋白人源IgM单抗蛋白的完整分子量(含糖)：1030287.84+101203.3161＝1131491.156Da；

[0113] IgM单抗蛋白的糖含量为8.9％。

[0114] 5、IgM单抗的肽谱

[0115] 为了进一步确证IgM单抗的一级结构，我们进行了肽谱分析。将IgM单抗经酶切处TM
理后经纳升液相毛细管色谱柱分离后由Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid 
Quadrupole‑Orbitrap Mass Spectrometer质谱仪进行检测，通过pFind软件进行数据库搜
索对MS图谱进行处理后得到肽图序列覆盖率。

[0116] 实验方法是将蛋白样品加入50mM碳酸氢胺溶液至总体积为100μL，震荡涡旋混匀。取上述待酶解溶液进行DTT还原和IAM烷基化。采用Chymotrypsin和Trypsin两种酶对蛋白
样品分别进行酶切。取上述酶解液2μL并加入0.1％的FA 8μL，15000g高速离心15min后取上
清5μL进行LC‑MS/MS分析。

[0117] 仪器的液相参数如下：

[0118]

[0119]

[0120] 仪器的质谱参数如下：

[0121] 全扫描分辨率：70000；AGC Target：1e6；Maximum IT：20ms；扫描范围：200‑2000m/z。dd‑MS2分辨率：35000；AGC Target：1e5；Maximum IT：60ms；Loop count：20；(N)CE/
stepped：30。

[0122] 数据分析采用pFind软件对肽图图谱进行数据库检索，可变修饰：Carbamidomethyl(C)，Deamidation(NQ)，Oxidation(M)漏切：允许偏差：MS 20ppm，MS/MS 
50ppm。数据库匹配采用的是两种单抗的C‑kappa区和C_H恒定区序列构建的本地数据库。

[0123] 肽谱测定结果为：N蛋白人源IgM单抗trypsin和Chymotrypsin两种酶切后，轻链恒定区的序列覆盖率为100％，测定结果显示N蛋白人源IgM单抗样品与理论序列能够匹配。

[0124] 6、均匀性检验

[0125] 随机抽取一定数量的最小包装单元(可按随机数表所示方法抽样)，采用精密度高的试验方法，对抽出的各样品在控制同样的实验条件下进行测定，从而使各样品间的差异
完全由样品的不均匀性反映出来。采用方差分析法用来进行统计检验均匀性。

[0126] 根据分装的单元数，分别从标准物质分装的初期、中期、末期随机抽取一定数量单元进行均匀性分析。IgM抗体标准物质分装的单元数为180管，均匀性检验时抽取11管，采用
基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质进行均匀性检验。

[0127] N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质均匀性检验数据见表4，均匀性统计表明F值＜F0.05，说明标准物质均匀性良好。

[0128] 表4 N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质均匀性检验数据

[0129]

[0130]

[0131] 7、稳定性检验

[0132] 采用氨基酸水解‑同位素稀释质谱法，对制备的标准物质进行稳定性考察。短期稳定性实验关注的是在特定运输条件下标准物质的稳定性。根据目前我国的运输条件，使用
快递运输，货物7天内可以运送到我国主要城市。抽取合适量的标准物质样品，做好标记，分
别放入指定环境中，按指定周期进行检验。对N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质分别在4℃、
室温、37℃三种不同温度下考察0、1、3、5、7天短期稳定性。

[0133] 标准物质短期稳定性考察结果为：N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质可在4℃、室温、37℃三种不同温度下稳定保存7天。储存条件为置于‑70℃冰箱中保存。运输条件为采用
干冰运输。

[0134] 长期稳定性实验关注的是在特定贮存条件下标准物质的稳定性状况。本研究贮存条件为‑70℃。表5为‑70℃条件下N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质的长期稳定性。

[0135] 表5 N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质长期稳定性检验数据

[0136]

[0137]

[0138] 8、标准物质定值

[0139] (一)实验方法

[0140] 采用所建立的基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法经两名操作者对N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质进行定值。

[0141] HPLC‑IDMS分析在Agilent1200液相系统串联AB5500三重四级杆质谱中完成，采用多反应监测模式(Multi reaction monitoring model，MRM)。通过对色谱条件的优化，选择
了如下色谱分离条件：色谱柱为菲罗门公司KINETEX C18柱(2.6μm*150*2.1mm)；洗脱条件：
含0.1％三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)的流动相A(水)与流动相B(100％乙腈)按
91:9的体积比等梯度洗脱10min，流速为200μl/min。

[0142] 质谱条件的优化：由于本实验采用MRM模式，因此主要对离子化条件、母离子扫描的去簇电压(Declustering potential，DP)和入口电压(Entrance potential，EP)、子离子
产生的碰撞能量(Collision energy，CE)进行优化，其采集条件及监测的离子对(Q1>Q3)如
表6所示。

[0143] 表6 HPLC‑IDMS分析时质谱采集条件及监测的离子对

[0144]

[0145]

[0146] 根据括号法的计算公式：

[0147]

[0148] 其中，C为样品水解后氨基酸的浓度；M为水解溶液中样品的质量；R1为高标溶液中氨基酸与标记氨基酸的峰面积比；R2为低标溶液中氨基酸与标记氨基酸的峰面积比；P为氨
基酸的纯度；m标为水解样品中标记氨基酸的质量；R样为样品水解后氨基酸与标记氨基酸
的峰面积比；W1为高标溶液中氨基酸与标记氨基酸的质量比；R2为低标溶液中氨基酸与标
记氨基酸的质量比。

[0149] 在单抗蛋白溶液标准物质的定值研究中，均采用Val、Leu、Ile及Phe四种氨基酸对蛋白进行定量。先求得水解后Val、Leu、Ile及Phe氨基酸的浓度，再根据每种氨基酸的浓度
计算蛋白含量，最后由这四种氨基酸所测定的蛋白含量取平均值即为蛋白的精确含量。

[0150] (二)实验结果

[0151] 采用同位素稀释质谱法分别对N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质进行定值，结果如表7所示。

[0152] 表7 N蛋白人源IgM抗体四种氨基酸测定蛋白含量结果(μg/g)

[0153]

[0154] 9、计量溯源性

[0155] 标准物质均采用同位素稀释质谱方法定值，以国家氨基酸一级标准物质作为溯源标准，分别是Val国家一级标准物质(GBW 09236)，Leu国家一级标准物质(GBW 09237)，Ile
国家一级标准物质(GBW 09238)Phe国家一级标准物质(GBW 09235)。氨基酸标准物质采用
定量核磁和质量平衡方法定值，最终结果可以溯源到SI单位，溯源图如图3所示。

[0156] 10、标准物质的验证与试用

[0157] 用所研制的N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质对市售的胶体金免疫层析试纸条进行评价并确定阳性参考值。由于没有标准物质，胶体金免疫层析试纸条无法提供检测限等
参数，用所研制的N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质可以为试纸条提供检测限参考值，实现
检测结果的可比和质量控制。

[0158] 根据胶体金免疫层析试纸条产品说明书操作步骤进行评价。设置N蛋白人源IgM抗体标准物质浓度分别为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、
10000ng/mL、50000ng/mL。

[0159] 根据所研制的标准物质定值，4款胶体金免疫层析试纸条的检测限见表8。

[0160] 表8胶体金免疫层析试纸条评价结果汇总

[0161]

[0162] 通过以上结果可以看出：用所研制的N蛋白人源IgM单抗溶液标准物质可以对抗体检测试剂盒和方法的性能进行质量控制与评价。

[0163] 实施例2

[0164] 对于常见的重要传染病，以艾滋病为例，也可依照本发明的技术方案研制IgM单克隆抗体标准物质：

[0165] 目前国内没有艾滋病IgM抗体有证标准物质，主要有两个原因：

[0166] 1、无法在日常条件下获取、处理艾滋病病人血清作为标准品；

[0167] 2、即使能获取数十人份的艾滋病病人血清，里面的成分也非常复杂，只包含1％甚至0.1％以下的抗艾滋病病毒多克隆IgM抗体，难以精确表征、定量以使其成为有证标准物
质。

[0168] 故采用实施例1中的方案筛选针对艾滋病抗原的IgG抗体，进行人源化改造及可变区嫁接，得到人源化的IgM抗体，在哺乳动物细胞中表达、纯化后作为原料，依次进行充分的
纯度和结构表征，最后依照实施例1里建立的同位素稀释质谱法对抗艾滋病抗原的纯IgM进
行定值，从而获得艾滋病IgM单克隆抗体标准物质，用于临床诊断方法开发、验证、质控与一
致化。

[0169] 为突出本发明的有益效果，例举以下对比例。

[0170] 对比例

[0171] 当直接用免疫动物得来的抗体做标准物质原料，不进行人源化改造时：

[0172] 获得的IgM是被免疫动物种属来源的，理论上不应与试剂盒中的试剂反应，因而失去充当参考标准的作用，无法用于对病人血清IgM抗体的免疫检测方法的开发、检测试剂盒
质量控制与评价、实验室质量控制和测量结果的一致化。

[0173] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方
案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。