一种对大量样本进行标记的DNA条形码标记方法

摘要

本发明公开了一种对大量样本进行标记的DNA条形码标记方法。该方法包括以下步骤：(1)建立立体孔阵；(2)将立体孔阵沿X、Y、Z方向分别标记为NX1～NXn、NY1～NYn和NZ1～NZn；(3)将连接至磁珠的第一段序列、第二段序列和第三段序列分别沿X、Y、Z方向进行标记，并与孔相对应；(4)将具有与磁珠孔坐标相同标记的第一段序列、第二段序列和第三段序列依次添加至相应的孔内，然后将组织样本置于相应孔内即可。本申请设计了一个立方体孔阵，使得加入条形码序列的操作是系统化的，这样就能够在已知合成磁珠条形码序列的前提下，实现同时对成千上万个组织样本进行标记。

权利要求

1.一种对大量样本进行标记的DNA条形码标记方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)建立N×N×N的立体孔阵，每孔内均添加有磁珠；

(2)将立体孔阵沿X、Y、Z方向分别标记为NX1～NXn、NY1～NYn和NZ1～NZn，为每个孔获得相应的X，Y，Z坐标；

(3)将连接至磁珠的若干第一段序列标记为与孔坐标相对应的Barcode X1～Xn、Barcode Y1～Yn或Barcode Z1～Zn；然后将与第一段序列连接的若干第二段序列标记为Barcode X1～Xn、Barcode Y1～Yn或Barcode Z1～Zn，且与第一段序列标记不同；最后将与第二段序列连接的第三段序列标记为Barcode X1～Xn、Barcode Y1～Yn或Barcode Z1～Zn中与第一段和第二段不同的标记；

(4)将具有与磁珠孔坐标相同标记的第一段序列、第二段序列和第三段序列依次添加至相应的孔内，第一段序列通过EDC反应与磁珠连接，第一段序列、第二段序列和第三段序列之间通过PCR连接，然后将组织样本置于相应孔内即可；

所述第一段序列为5’端氨基修饰的序列，其两端分别连接有PCR handle和第一连接序列；第一段序列通过EDC反应与羧基包被的磁珠连接；

所述第二段序列两端分别连接有与第一连接序列连接的反向互补序列以及第二连接序列；

所述第三段序列一端连接有与第二连接序列连接的反向互补序列，另一端依次连接有用于基因定量的UMI和用于捕获3’端带有Poly A尾的转录本的Poly T。

2.根据权利要求1所述的对大量样本进行标记的DNA条形码标记方法，其特征在于，所述若干第一段序列标记为Barcode X1～Xn；所述若干第二段序列标记为Barcode Y1～Yn；

所述若干第三段序列标记为Barcode Z1～Zn。

说明书

一种对大量样本进行标记的DNA条形码标记方法

技术领域

[0001] 本发明属于高通量条形码标记技术，具体涉及一种对大量样本进行标记的DNA条形码标记方法。

背景技术

[0002] 高通量地随机条形码标记技术使得单细胞测序技术迅速发展。其核心推动力是如何实现同时对数以万计的单细胞分别进行唯一标记。目前被广泛使用的单细胞测序技术(如Drop‑seq，inDrop‑seq，Microwell‑seq，SPLiT‑seq等)都是通过合成随机条形码的方式增加条形码序列的多样性，以达到同时标记大量细胞的目的。以Microwell‑seq和SPLiT‑seq使用的split‑pool随机条形码合成原理为例加以说明：在羧基包被的磁珠上依次连接3段寡核苷酸链序列(barcode)，每一段序列有96种。split‑pool方法需要将磁珠分散到96孔板中，每个孔中加入96种第一段barcodes中的一种，在第一段barcode连接至磁珠后合并所有磁珠，再重新分散至新的96孔板中，每孔加入96种第二段barcodes中的一种，待第二段barcode连接至磁珠后，合并所有磁珠，继续分散至新的96孔板中，每孔加入96种第三段barcodes中的一种，连接反应后，合并所有磁珠。这样得到的磁珠序列有近百万(96×96×96)种排列组合，任意两个磁珠完全一样的概率仅为百万分之一，因此可以认为这些磁珠是独一无二的。然而这种方法在每一次合并(pooling)时会造成磁珠的“空间信息”丢失，在合成结束时不能判断某个磁珠上具体的barcode组合，因为合成的磁珠是完全随机化的。因此，随机条形码标记技术不能直接应用在标记大量的指定样本上。

[0003] 而目前新兴的多样本测序、连续样本测序、以及空间转录组测序技术都需要同时对大量的组织或细胞样本进行标记。如果对每个样本单独设计唯一的条形码序列，随着样本通量的提升，所需的条形码序列也会不断增加，造成人力、物力、财力的浪费。因此，亟需一种多路复用的定制化条形码策略，可在已知条形码序列的前提下增加条形码的多样性，既极大程度地提升了样本通量，又能实现大批量样本的唯一标记。

发明内容

[0004] 针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种对大量样本进行标记的DNA条形码标记方法，本申请摒弃了split和pool这两个步骤，使得磁珠上的序列是完全确定的；然后，设计了一个立方体孔阵，使得加入条形码序列的操作是系统化的。这样就能够在已知合成磁珠条形码序列的前提下，实现同时对成千上万个组织样本进行标记。

[0005] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0006] 一种对大量样本进行标记的DNA条形码标记方法，包括以下步骤：

[0007] (1)建立N×N×N的立体孔阵，每孔内均添加有磁珠；

[0008] (2)将立体孔阵沿X、Y、Z方向分别标记为NX1～NXn、NY1～NYn和NZ1～NZn，为每个孔获得相应的X，Y，Z坐标；

[0009] (3)将连接至磁珠的若干第一段序列标记为与孔坐标相对应的Barcode X1～Xn、Barcode Y1～Yn或Barcode Z1～Zn；然后将与第一段序列连接的若干第二段序列标记为Barcode X1～Xn、Barcode Y1～Yn或Barcode Z1～Zn，且与第一段序列标记不同；最后将与第二段序列连接的第三段序列标记为Barcode X1～Xn、Barcode Y1～Yn或Barcode Z1～Zn中与第一段和第二段不同的标记；

[0010] (4)将具有与磁珠孔坐标相同标记的第一段序列、第二段序列和第三段序列依次添加至相应的孔内，第一段序列通过EDC反应与磁珠连接，第一段序列、第二段序列和第三段序列之间通过PCR连接，然后将组织样本置于相应孔内即可。

[0011] 进一步地，若干第一段序列标记为Barcode X1～Xn；若干第二段序列标记为Barcode Y1～Yn；若干第三段序列标记为Barcode Z1～Zn。

[0012] 进一步地，第一段序列为5’端氨基修饰的序列，其两端分别连接有PCR handle和第一连接序列；第一段序列通过EDC反应与羧基包被的磁珠连接。

[0013] 进一步地，第二段序列两端分别连接有与第一连接序列连接的反向互补序列以及第二连接序列。

[0014] 进一步地，第三段序列一端连接有与第二连接序列连接的反向互补序列，另一端依次连接有用于基因定量的UMI和用于捕获3’端带有Poly A尾的转录本的Poly T。

[0015] 本发明的有益效果：

[0016] 本发明与现有技术相比优势明显，首先，与随机条形码技术相比，本申请解决了大量样本进行标记的难题，这是随机条形码技术无法实现的。其次，与传统单纯使用一段合成序列作为barcode的方法相比，空间条形码标记技术同样具有明显优势，随着样本通量的不断增加，传统方法在barcode合成上的成本直线上升，同时，将不同的barcode配制成溶液时也需要单独处理，费时费力。而空间条形码标记技术能有效地提升实验效率、降低实验成本，对于上千个样本的单独标记也仅需使用数十条barcodes即可。

附图说明

[0017] 图1为本申请流程图；其中，A为构建得到的立体孔阵；B为技术流程。

具体实施方式

[0018] 下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

[0019] 实施例1构建立体孔阵

[0020] 1、在X、Y、Z三个相互垂直空间方向上，构建一个48×48×48的立体孔阵，每一层有48×48个孔，共48层(图1A)。我们选择384孔板(24×16)为一个平面阵列的基本组件(每层2×3块板)，将立体孔阵沿X、Y、Z方向分别标记为X1～X48、Y1～Y48和Y1～Y48，由此即可孔阵内每孔具体的X，Y，Z坐标。

[0021] 2、将第一段序列标记为Barcode X1‑X48，与立体孔阵中X方向上的48个孔分别对应；第二段序列标记为Barcode Y1‑Y48，与立体孔阵中Y方向上的48个孔分别对应；第三段序列标记为Barcode Z1‑Z48，与立体孔阵中Z方向上的48个孔分别对应。

[0022] 如图1B所示，磁珠上包含一段PCR引物用于后续扩增建库，三段barcode组合，一段UMI(Unique molecular index)用于基因定量，一段Poly T尾用于捕获3’端带有Poly A尾的转录本。

[0023] 合成时，先加入5’端氨基修饰的第一段序列(含PCR handle、Barcode X和linker 1)，通过EDC反应与羧基包被的磁珠相连，然后加入第二段序列(含linker 1的反向互补序列linker1*、Barcode Y*和linker 2*)，通过PCR对磁珠上的序列进行延伸，最后加入第三段序列(含linker2*的反向互补序列、Barcode Z*、UMI*和Poly A)，通过PCR得到最终的三段barcode组合。

[0024] 实施例2

[0025] 1、第一轮连接反应

[0026] 反应前将Barcode X序列引物用无核酸酶水溶解，使其浓度为400μM。取3个1.5mL6
离心管，每管加入约3.33×10羧基磁珠(约464μL)，用0.1M MES清洗磁珠1～2次。将装有磁珠的离心管置于磁力架，弃去上清，每管加入716μL 0.1M MES溶液与68.8μL EDC溶液，充分混匀后，将每个离心管内容物平均分配至8个PCR管中。每管加入63μL 0.2M MES溶液和63μL相应Barcode X1～X24，混匀，室温反应20min。每管加入25.65μL EDC溶液，室温反应10min。
重复上一步，再次室温反应80min。将24个PCR管放置在磁力架上，待磁珠完全沉降后吸弃上清，各孔磁珠依次用含0.02％Tween‑20的0.1M PBS溶液、无核酸酶水和TE缓冲液(pH 8.0)清洗一次，最后用500μL TE缓冲液重悬磁珠，4℃备用。

[0027] 2、第二轮连接反应

[0028] 在1.5mL EP管中配制PCR反应溶液：280μL 2×Phanta Master Mix和56μL相应的50μM的第二段序列(Barcode Y)，吹打混匀。将TE缓冲液中保存的磁珠在磁力架上静置
2min，吸弃上清，用无核酸酶水清洗一次后加入220μL无核酸酶水重悬磁珠，混匀。取一块
384孔PCR板，每孔加入相应含不同Barcode Y的PCR反应溶液(6μL/孔)及相应连有不同Barcode X的磁珠(4μL/孔)，混匀，离心，置于PCR仪中进行反应，PCR反应结束后，利用高通量磁珠转移装置吸附磁珠，弃去未反应的溶液并用无核酸酶水清洗磁珠一次。每孔加入20μL无核酸酶水，盖上封板膜，将384孔板放置在95℃水浴锅中反应6min，迅速取出，再次利用高通磁珠转移装置吸附磁珠，弃去未反应的溶液并用95℃预热的无核酸酶水清洗磁珠两次，最后将磁珠重悬在TE‑TW溶液，4℃备用。

[0029] 3、第三轮连接反应

[0030] 取18块上述反应后384孔板，利用高通量磁珠转移装置吸附其内磁珠(已连有Barcode X与Barcode Y)，弃去上清并用无核酸酶水清洗两次后加入无核酸酶水重悬(4μL/孔)。在1.5ml离心管中配置PCR反应溶液并加入相应第三段引物(Barcode Z1～Z18，5μM)，混匀后每块384孔板加入相应的PCR反应溶液(6μL/孔)，混匀，离心，置于PCR仪中进行反应，PCR反应结束后，利用高通量磁珠转移装置吸附其内磁珠，弃去上清并用无核酸酶水清洗一次后每孔加入15μL核酸外切酶混合物(6.125mL无核酸酶水+700μL核酸外切酶I缓冲液+175μL核酸外切酶)，37℃孵育60min。各孔中磁珠依次用15μL TE‑SDS溶液、TE‑TW溶液清洗一次，最后用20μL无核酸酶水重悬。盖上封板膜，将384孔板放置在95℃水浴锅中反应6min，利用高通量磁珠转移装置吸附其内磁珠，弃去未反应的溶液并用95℃预热的无核酸酶水清洗磁珠两次。每孔加入15μL TE‑TW溶液重悬，4℃保存。

[0031] 实施例3

[0032] 1、组织切片与染色

[0033] 小鼠取脑，迅速冰冻，沿矢状轴和冠状轴分别对小鼠脑组织进行切片，得到25张冠状面切片以及11张矢状面切片，使用焦油紫染色法对脑切片进行染色。

[0034] 2、显微切割

[0035] 使用激光捕获显微切割(LCM)系统对切片中的各脑区(13个不同脑区)进行切割。使用96孔板收集切割后的组织块，每个组织块由指定的孔进行收集(共计214个组织样本，由3块96孔板收集)。96孔板中加入细胞裂解液和带有不同条形码的磁珠(本申请方法制备得到的磁珠)，每孔一种磁珠。

[0036] 3、RNA‑seq测序

[0037] 显微切割后的组织块在96孔板中与磁珠结合，经过组织裂解、mRNA捕获、逆转录、扩增以及cDNA建库等步骤后，样本在 Xten平台上进行双端测序。

[0038] 将上述214个脑区样本中的mRNA分别捕获并进行测序分析，测序数据经Drop‑seq标准分析处理后，得到个组织样本的数字表达矩阵(digital gene expression，DGE)，基本统计如表1所示：

[0039] 表1各脑区样本数与基因表达矩阵基本统计一览表

[0040]

[0041] 表1中reads、transcripts和genes数量为该脑区多个样本的平均值。可以看出数据合并后，各脑区得到的基因数总体分布均匀。