一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的引物组、试剂盒及方法转让专利
申请号 : CN202110537002.4
文献号 : CN112961929B
文献日 : 2021-08-10
发明人 : 梁旭东
申请人 : 至善时代智能科技(北京)有限公司 , 至微生物智能科技(厦门)有限公司
摘要 :
本发明提供了一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的引物组、试剂盒及方法，属于分子生物检测技术领域，所述引物组包括扩增金黄色葡萄球菌的引物F1和R1、扩增沃氏葡萄球菌的引物F2和R2、扩增表皮葡萄球菌的引物F3和R3、扩增人葡萄球菌的引物F4和R4；扩增头状葡萄球菌的引物F5和R5和扩增溶血葡萄球菌的引物F6和R6；所述引物F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4、F5、R5、F6和R6的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1~SEQ ID No.12所示。本发明提供的引物组、试剂盒及方法操作简单，灵敏度高，可以在短时间内完成对环境葡萄球菌的检测；成本低，鉴定的葡萄球菌种类多，便于推广应用。
权利要求 :
1.一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
1）采集环境样品；
2）以环境样品的裂解液为模板，分别以F1/R1，F2/R2、F3/R3、F4/R4、F5/R5和F6/R6引物对为引物，进行PCR扩增获得扩增产物；
3）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若以金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌对应的引物扩增获得的扩增产物在电泳结果中出现扩增目的条带，则认为环境中存在相应的细菌，若没有出现扩增目的条带，则认为环境中不存在相应的细菌或者环境中的该细菌含量未达到本方法的检测限；
所述引物F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4、F5、R5、F6和R6的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1SEQ ID No.12所示；其中引物F1和R1用于扩增金黄色葡萄球菌、引物F2和R2用于扩增沃氏~
葡萄球菌、引物F3和R3用于扩增表皮葡萄球菌、引物F4和R4用于扩增人葡萄球菌；引物F5和R5用于扩增头状葡萄球菌和引物F6和R6用于扩增溶血葡萄球菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每一条引物的使用浓度独立为0.2 0.4μM。
~
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述采集环境样品用拭子进行，采样面积2
为20 30cm。
~
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将拭子浸泡在细菌裂解液中，充分湿润后进行采样。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细菌裂解液为包括体积百分含量0.8%
1.2%的Triton X‑100的Tris‑HCl溶液，所述裂解液中Tris‑HCl的浓度为8 12mM。
~ ~
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系，以20μL计，包括以下组分：
10× Taq buffer 1×；
Taq DNA 聚合酶 1 2 units；
~
dNTPs 0.2mM；
上游引物 0.2 0.4μM；
~
下游引物 0.2 0.4μM~
DNA模板 2μL；
灭菌水 补足20μL；
所述PCR扩增的程序包括以下步骤：95℃，5min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；72℃，5min。
说明书 :
一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的引物组、试剂盒及
方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物检测技术领域，尤其涉及一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
[0002] 葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，是最常见的化脓性球菌，机体抵抗力低的老年、孕妇、新生儿等最易受到葡萄球菌侵染，引起天泡疮、结膜炎、脓毒血症等疾病。此外，葡萄球
菌还可在家禽中引起传染病，如脚垫肿、脐炎和葡萄球菌性败血症等，给养禽业造成较大的
损失。
菌还可在家禽中引起传染病，如脚垫肿、脐炎和葡萄球菌性败血症等，给养禽业造成较大的
损失。
[0003] 16S rDNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S rDNA具有高度的保守性和特异性，随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，
16S rDNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具，应用该技术可以实现
对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。
16S rDNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具，应用该技术可以实现
对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。
[0004] 细菌中，促旋酶B亚单位基因gyrB几乎全部以单拷贝的形式出现，且其基因进化速率快，相比于16Sr DNA有更高的碱基替换频率，目前，还没有基于gyrB基因同时对葡萄球菌
属内多种细菌鉴定的方法，现有方法主要是用于对金黄色葡萄球菌的鉴定。中国发明专利
201610139846.2公开了一种检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合，该引物可用于
基于LAMP等温扩增的金黄色葡萄球菌鉴定，该方法鉴定范围小，只能对一种葡萄球菌进行
鉴定，且其所用LAMP等温扩增试剂价格昂贵，不利于推广。
属内多种细菌鉴定的方法，现有方法主要是用于对金黄色葡萄球菌的鉴定。中国发明专利
201610139846.2公开了一种检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合，该引物可用于
基于LAMP等温扩增的金黄色葡萄球菌鉴定，该方法鉴定范围小，只能对一种葡萄球菌进行
鉴定，且其所用LAMP等温扩增试剂价格昂贵，不利于推广。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明基于gyrB基因的特征序列设计引物，提供一种在种的水平上鉴定环境中6种葡萄球菌的引物组、试剂盒和方法；所述引物组能够在种的水平上鉴定环境中
的金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡
萄球菌；所述引物组、试剂盒及方法操作简单，灵敏度高，可以在短时间内完成对环境葡萄
球菌的检测；同时所述方法成本低，鉴定的葡萄球菌种类多，便于推广应用。
的金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡
萄球菌；所述引物组、试剂盒及方法操作简单，灵敏度高，可以在短时间内完成对环境葡萄
球菌的检测；同时所述方法成本低，鉴定的葡萄球菌种类多，便于推广应用。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的引物组，包括
[0008] 扩增金黄色葡萄球菌的引物F1和R1、扩增沃氏葡萄球菌的引物F2和R2、扩增表皮葡萄球菌的引物F3和R3、扩增人葡萄球菌的引物F4和R4；扩增头状葡萄球菌的引物F5和R5
和扩增溶血葡萄球菌的引物F6和R6；
和扩增溶血葡萄球菌的引物F6和R6；
[0009] 所述引物F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4、F5、R5、F6和R6的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1 SEQ ID No.12所示。
~
~
[0010] 本发明提供了一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的试剂盒，包括所述的引物组。
[0011] 优选的，所述引物组中的每一条引物的使用浓度独立为0.2 0.4μM。~
[0012] 优选的，还包括检测试剂。
[0013] 优选的，所述检测试剂包括细菌裂解液、PCR反应液和阳性对照基因组DNA。
[0014] 优选的，所述细菌裂解液为包括体积百分含量0.8% 1.2%的Triton X‑100的Tris‑~
HCL溶液，所述裂解液中Tris‑HCL的浓度为8 12mM。
~
HCL溶液，所述裂解液中Tris‑HCL的浓度为8 12mM。
~
[0015] 优选的，所述PCR反应液包括10× Taq buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs和无菌水。
[0016] 本发明提供了一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
[0017] 1）采集环境样品；
[0018] 2）以环境样品的裂解液为模板，分别以所述的F1/R1，F2/R2、F3/R3、F4/R4、F5/R5和F6/R6引物对为引物，进行PCR扩增获得扩增产物；
[0019] 3）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若以金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌对应的引物扩增获得的扩增产物在
电泳结果中出现扩增目的条带，则认为环境中存在相应的细菌，若没有出现扩增目的条带，
则认为环境中不存在相应的细菌或者环境中的该细菌含量未达到本方法的检测限。
电泳结果中出现扩增目的条带，则认为环境中存在相应的细菌，若没有出现扩增目的条带，
则认为环境中不存在相应的细菌或者环境中的该细菌含量未达到本方法的检测限。
[0020] 优选的，所述采集环境样品用拭子进行，采样面积为20 30cm2。~
[0021] 优选的，所述PCR扩增的体系，以20μL计，包括以下组分：
[0022] 10× Taq buffer 1×；
[0023] Taq DNA 聚合酶 1 2 units；~
[0024] dNTPs 0.2mM；
[0025] 上游引物 0.2 0.4μM；~
[0026] 下游引物 0.2 0.4μM~
[0027] DNA模板 2μL；
[0028] 灭菌水 补足20μL；
[0029] 所述PCR扩增的程序包括以下步骤：95℃，5min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；72℃，5min。
[0030] 本发明的有益效果：本发明提供的在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的引物组，是基于gyrB基因的特征序列设计，能够对环境中的金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄
球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌进行特异性的检测和鉴定，特异性好、
灵敏度高。本发明提供的在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的试剂盒及方法无需对样品中的
细菌进行培养、DNA提取以及测序等多步复杂操作，可对直接从环境采集的样品进行检测，
快速省时，成本低，灵敏度高；从采样开始，整个流程只需要1 2个小时，检测时间短。
~
球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌进行特异性的检测和鉴定，特异性好、
灵敏度高。本发明提供的在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的试剂盒及方法无需对样品中的
细菌进行培养、DNA提取以及测序等多步复杂操作，可对直接从环境采集的样品进行检测，
快速省时，成本低，灵敏度高；从采样开始，整个流程只需要1 2个小时，检测时间短。
~
附图说明
[0031] 图1为本发明的技术流程图；
[0032] 图2为引物特异性属间检测结果；
[0033] 图3为引物特异性属内检测结果；
[0034] 图4为金黄色葡萄球菌检测灵敏度测定结果；
[0035] 图5为环境不同位置葡萄球菌检测结果。
具体实施方式
[0036] 本发明提供了一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的引物组，包括扩增金黄色葡萄球菌的引物F1和R1、扩增沃氏葡萄球菌的引物F2和R2、扩增表皮葡萄球菌的引物F3和R3、
扩增人葡萄球菌的引物F4和R4；扩增头状葡萄球菌的引物F5和R5和扩增溶血葡萄球菌的引
物F6和R6；所述引物F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4、F5、R5、F6和R6的核苷酸序列分别如SEQ ID
No.1 SEQ ID No.12所示；具体如下：
~
扩增人葡萄球菌的引物F4和R4；扩增头状葡萄球菌的引物F5和R5和扩增溶血葡萄球菌的引
物F6和R6；所述引物F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4、F5、R5、F6和R6的核苷酸序列分别如SEQ ID
No.1 SEQ ID No.12所示；具体如下：
~
[0037] 金黄色葡萄球菌
[0038] F1：5'‑ACTTAAAAGAAGTTGGCAC‑3'（SEQ ID No.1）
[0039] R1：5'‑GTTTGACCTTCGAATTGAGGATC‑3'（SEQ ID No.2）
[0040] 沃氏葡萄球菌
[0041] F2：5'‑AGACGAAGATGATATCAGAC‑3'（SEQ ID No.3）
[0042] R2：5'‑GTTTGACCTTCGAATTGAGGATC‑3'（SEQ ID No.4）
[0043] 表皮葡萄球菌
[0044] F3：5'‑AAGATGAAAGAGAAGAGGAAG‑3'（SEQ ID No.5）
[0045] R3：5'‑ GTTGGTTGCATATCCACTG ‑3'（SEQ ID No.6）
[0046] 人葡萄球菌
[0047] F4：5'‑TGAAGAACAACGTGAAGACACG‑3'（SEQ ID No.7）
[0048] R4：5'‑TACTTGAACAGTCTGCCAG‑3'（SEQ ID No.8）
[0049] 头状葡萄球菌
[0050] F5：5'‑GCGTGAAGAGGAAGGCCGTGAG‑3'（SEQ ID No.9）
[0051] R5：5'‑GTTTGTCCTTCGAATTGAGGATC ‑3'（SEQ ID No.10）
[0052] 溶血葡萄球菌
[0053] F6：5'‑GCGTGAAGATGTAGAGCAACGC‑3'（SEQ ID No.11）
[0054] R6：5'‑ GTTTGTCCTTCGAATTGAGGATC‑3'（SEQ ID No.12）。
[0055] 本发明还提供了一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的试剂盒，包括所述的引物组。在本发明中，所述引物组中的每一条引物的使用浓度独立优选为0.2 0.4μM，更优选为
~
0.2μM。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括检测试剂，所述检测试剂优选的包括细菌裂
解液、PCR反应液和阳性对照基因组DNA。在本发明中，所述细菌裂解液优选为包括体积百分
含量0.8% 1.2%的Triton X‑100的Tris‑HCL溶液，更优选为包括体积百分含量1.0%的
~
Triton X‑100的Tris‑HCL溶液；在本发明中，所述裂解液中Tris‑HCL的浓度优选为8 12mM，
~
更优选为9 11mM，最优选为10mM。在本发明中，所述PCR反应液优选的包括10× Taq
~
buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs和无菌水。本发明对所述10× Taq buffer、Taq DNA聚合酶、
dNTPs和无菌水的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。在本发明中，所述
阳性对照基因组DNA为独立分装的金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄
球菌、头状葡萄球菌和溶血葡萄球菌的基因组DNA。
~
0.2μM。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括检测试剂，所述检测试剂优选的包括细菌裂
解液、PCR反应液和阳性对照基因组DNA。在本发明中，所述细菌裂解液优选为包括体积百分
含量0.8% 1.2%的Triton X‑100的Tris‑HCL溶液，更优选为包括体积百分含量1.0%的
~
Triton X‑100的Tris‑HCL溶液；在本发明中，所述裂解液中Tris‑HCL的浓度优选为8 12mM，
~
更优选为9 11mM，最优选为10mM。在本发明中，所述PCR反应液优选的包括10× Taq
~
buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs和无菌水。本发明对所述10× Taq buffer、Taq DNA聚合酶、
dNTPs和无菌水的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。在本发明中，所述
阳性对照基因组DNA为独立分装的金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄
球菌、头状葡萄球菌和溶血葡萄球菌的基因组DNA。
[0056] 本发明提供了一种在种的水平鉴定环境中葡萄球菌的方法，包括以下步骤：1）采集环境样品；2）以环境样品的裂解液为模板，分别以所述引物组中的F1/R1，F2/R2、F3/R3、
F4/R4、F5/R5和F6/R6引物对为引物，进行PCR扩增获得扩增产物；3）对扩增产物进行琼脂糖
凝胶电泳，若以金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌
以及溶血葡萄球菌对应的引物扩增获得的扩增产物在电泳结果中出现扩增目的条带，则认
为环境中存在相应的细菌，若没有出现扩增目的条带，则认为环境中不存在相应的细菌。
F4/R4、F5/R5和F6/R6引物对为引物，进行PCR扩增获得扩增产物；3）对扩增产物进行琼脂糖
凝胶电泳，若以金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌
以及溶血葡萄球菌对应的引物扩增获得的扩增产物在电泳结果中出现扩增目的条带，则认
为环境中存在相应的细菌，若没有出现扩增目的条带，则认为环境中不存在相应的细菌。
[0057] 在本发明中，采集环境样品。在本发明中，所述采集环境样品优选的用拭子进行；2 2
在本发明中，采样面积优选为20 30cm ，更优选为25cm ，本发明对所述环境样品的来源没有
~
特殊限定，常规环境中的样品均可，例如桌子、窗户、玻璃、垃圾桶、门把手、地板、手套、鞋
子、实验服、实验台、仪器表面等。在本发明具体实施过程中，优选的将拭子浸泡在所述细菌
裂解液中使其充分湿润，随后进行采样，采样后沿拭子切口截去拭子多余的部分，放入细菌
裂解液中，依次进行第一震荡、静置、第二震荡和离心；所述第一震荡和第二震荡的时间优
选为1min，所述静置的时间优选为2 4min，更优选为3min；所述离心的转速优选为3000
~ ~
5000rpm，更优选为4000rpm，所述离心的时间优选为4 6min，更优选为5min，本发明在所述
~
离心后，取上清作为环境样品裂解液，以所述环境样品裂解液为模板进行PCR扩增，无需额
外的DNA提取过程。
在本发明中，采样面积优选为20 30cm ，更优选为25cm ，本发明对所述环境样品的来源没有
~
特殊限定，常规环境中的样品均可，例如桌子、窗户、玻璃、垃圾桶、门把手、地板、手套、鞋
子、实验服、实验台、仪器表面等。在本发明具体实施过程中，优选的将拭子浸泡在所述细菌
裂解液中使其充分湿润，随后进行采样，采样后沿拭子切口截去拭子多余的部分，放入细菌
裂解液中，依次进行第一震荡、静置、第二震荡和离心；所述第一震荡和第二震荡的时间优
选为1min，所述静置的时间优选为2 4min，更优选为3min；所述离心的转速优选为3000
~ ~
5000rpm，更优选为4000rpm，所述离心的时间优选为4 6min，更优选为5min，本发明在所述
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离心后，取上清作为环境样品裂解液，以所述环境样品裂解液为模板进行PCR扩增，无需额
外的DNA提取过程。
[0058] 在本发明中，以环境样品的基因组DNA为模板，分别以所述的F1/R1，F2/R2、F3/R3、F4/R4、F5/R5和F6/R6引物对为引物，进行PCR扩增获得扩增产物。在本发明中，所述PCR扩增
的体系，以20μL计，优选的包括以下组分：
的体系，以20μL计，优选的包括以下组分：
[0059] 10× Taq buffer 1×；
[0060] Taq DNA 聚合酶 1 2 units；~
[0061] dNTPs 0.2mM；
[0062] 上游引物 0.2 0.4 μM；~
[0063] 下游引物 0.2 0.4 μM~
[0064] DNA模板 2μL；
[0065] 灭菌水 补足20μL。
[0066] 在本发明中，所述PCR扩增的程序优选的包括以下步骤：95℃，5min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；72℃，5min。
[0067] 本发明在获得所述扩增产物后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的琼脂糖凝胶电泳方案即可。
本发明在所述琼脂糖凝胶电泳后，对所述琼脂糖凝胶电泳结果进行分析，若以金黄色葡萄
球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌对应的
引物对扩增获得的扩增产物在电泳结果中出现扩增目的条带，则认为环境中存在相应的细
菌，若没有出现扩增目的条带，则认为环境中不存在相应的细菌。
本发明在所述琼脂糖凝胶电泳后，对所述琼脂糖凝胶电泳结果进行分析，若以金黄色葡萄
球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌对应的
引物对扩增获得的扩增产物在电泳结果中出现扩增目的条带，则认为环境中存在相应的细
菌，若没有出现扩增目的条带，则认为环境中不存在相应的细菌。
[0068] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0069] 实施例1
[0070] 环境葡萄球菌的种类鉴定
[0071] 具体步骤如下：
[0072] A、用拭子对环境中不同位置（实验台、冰箱等）的细菌进行采样（采样液为裂解2
液），采样面积为25cm。
液），采样面积为25cm。
[0073] B、将采样液梯度稀释到10‑6，分别取10‑4，10‑5，10‑6三个浓度的菌液10μl，涂布在LB固体培养基上，于37℃培养箱过夜培养，待长出菌落后，挑取单菌落，进行3次划线分离培
养，以获得纯菌。
养，以获得纯菌。
[0074] C、挑取纯化后的划线培养的细菌单菌落，用16S rDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增。
[0075] 27F引物序列：5'‑AGAGTTTGATCMTGGCTCAG‑3'（SEQ ID No.13），
[0076] 1492R引物序列：5'‑CGGYTACCTTGTTACGACTT‑3'（SEQ ID No.14）；
[0077] D、对PCR产物进行测序。
[0078] E、将测序结果与NCBI基因数据库序列进行比对，确定48种环境细菌的种属分类，详细内容见表1，其中含有金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头
状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌6种葡萄球菌。
状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌6种葡萄球菌。
[0079] 表1 环境样品中48种菌的种属分类
[0080]
[0081] 实施例2
[0082] 6种葡萄球菌特异引物的设计
[0083] 具体步骤如下：
[0084] A、从Genebank基因库里面下载金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌gyrB基因序列。
[0085] B、对基因序列进行比对，寻找差异序列，设计分别针对6种葡萄球菌的特异引物，引物序列如下：
[0086] 金黄色葡萄球菌
[0087] F1：5'‑ACTTAAAAGAAGTTGGCAC‑3'（SEQ ID No.1）
[0088] R1：5'‑GTTTGACCTTCGAATTGAGGATC‑3'（SEQ ID No.2）
[0089] 沃氏葡萄球菌
[0090] F2：5'‑AGACGAAGATGATATCAGAC‑3'（SEQ ID No.3）
[0091] R2：5'‑GTTTGACCTTCGAATTGAGGATC‑3'（SEQ ID No.4）
[0092] 表皮葡萄球菌
[0093] F3：5'‑AAGATGAAAGAGAAGAGGAAG‑3'（SEQ ID No.5）
[0094] R3：5'‑ GTTGGTTGCATATCCACTG ‑3'（SEQ ID No.6）
[0095] 人葡萄球菌
[0096] F4：5'‑TGAAGAACAACGTGAAGACACG‑3'（SEQ ID No.7）
[0097] R4：5'‑TACTTGAACAGTCTGCCAG‑3'（SEQ ID No.8）
[0098] 头状葡萄球菌
[0099] F5：5'‑GCGTGAAGAGGAAGGCCGTGAG‑3'（SEQ ID No.9）
[0100] R5：5'‑GTTTGTCCTTCGAATTGAGGATC ‑3'（SEQ ID No.10）
[0101] 溶血葡萄球菌
[0102] F6：5'‑GCGTGAAGATGTAGAGCAACGC‑3'（SEQ ID No.11）
[0103] R6：5'‑ GTTTGTCCTTCGAATTGAGGATC‑3'（SEQ ID No.12）。
[0104] 实施例3
[0105] 葡萄球菌引物属间特异性检测
[0106] A、以金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和人葡萄球菌引物为例，验证葡萄球菌引物的属间特异性。分别以泛菌属、微球菌属、假单胞菌属以及芽孢杆菌属细菌为
模板，进行PCR扩增；其中阳性对照分别为引物对应的葡萄球菌菌种(P)，阴性对照为裂解液
(N)，M为Maeker，Maeker片段大小从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、
100bp。
模板，进行PCR扩增；其中阳性对照分别为引物对应的葡萄球菌菌种(P)，阴性对照为裂解液
(N)，M为Maeker，Maeker片段大小从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、
100bp。
[0107] B、通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。
[0108] C、琼脂糖凝胶电泳结果见图2，表2为琼脂糖凝胶电泳所用菌株编号列表，从图2中可以看出，不同的葡萄球菌引物只能对相应的葡萄球菌进行扩增，表明设计的引物在属间
具有良好的特异性。
具有良好的特异性。
[0109] 表2 属间特异性检测所用菌株编号列表
[0110]
[0111] 实施例4
[0112] 葡萄球菌引物属内特异性检测
[0113] 利用设计的引物，以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC8325（P1）以及NCTC6538（P2）作为阳性对照，阴性对照为裂解液（N），以6种不同的葡萄球菌为模板进行PCR扩增。
[0114] 通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。
[0115] 琼脂糖凝胶电泳结果见图3，表3为琼脂糖凝胶电泳所用菌株编号列表，从图3中可以看出，不同的引物只能对本种内的葡萄球菌进行扩增，表明设计的引物在葡萄球菌属内
仍具有较高的特异性，可分别用于对金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡
萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌的菌种鉴定。
仍具有较高的特异性，可分别用于对金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡
萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌的菌种鉴定。
[0116] 表3 属内特异性检测所用菌株编号列表
[0117]
[0118] 实施例5
[0119] 葡萄球菌检测灵敏度的测定
[0120] 具体步骤如下：
[0121] A、以沃氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌以及头状葡萄球菌为例，将三种葡萄球菌过夜培养后提取基因组DNA，测定浓度后对基因组DNA进行10倍梯度稀释，沃氏葡萄球菌、金黄
色葡萄球菌以及头状葡萄球菌初始浓度分别为107.7ng/ul、62.5ng/ul、114.6ng/ul。
色葡萄球菌以及头状葡萄球菌初始浓度分别为107.7ng/ul、62.5ng/ul、114.6ng/ul。
[0122] B、以不同浓度梯度的沃氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌以及头状葡萄球菌基因组DNA为模板，分别利用三种葡萄球菌特异引物进行PCR扩增（阴性对照为裂解液）。
[0123] C、对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0124] D、琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4，图中1‑7分别为10倍稀释的基因组DNA，8为阴性对照，从图4可以看出，头状葡萄球菌基因组DNA浓度在1.146pg/μl时仍可以得到有效扩
增，表明本发明的反应体系检测下限可达到1.146pg/μl，具有良好的灵敏度。
增，表明本发明的反应体系检测下限可达到1.146pg/μl，具有良好的灵敏度。
[0125] 实施例6
[0126] 环境不同位置的葡萄球菌检测
[0127] 具体步骤如下：
[0128] A、用拭子对环境中不同位置：
[0129] 1、小垃圾桶，2、手套，3、实验服，4、试验台，5、第一混合菌（表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌）6、第二混合菌（沃氏葡萄球菌、溶血葡
萄球菌和人葡萄球菌），7、鞋子，8、阴性对照（裂解液）；进行采样（采样液为裂解液），采样面
2
积为25cm。
萄球菌和人葡萄球菌），7、鞋子，8、阴性对照（裂解液）；进行采样（采样液为裂解液），采样面
2
积为25cm。
[0130] B、以采集的样品为模板，分别用实施例2中设计的6对特异引物进行PCR扩增。
[0131] 反应试剂：包括裂解液A，反应液B，阳性对照C，阴性对照D。
[0132] 裂解液A具体成分：
[0133] Tris‑HCL (PH 8.0) 10mM；
[0134] Triton X‑100 1%；
[0135] 反应液B具体成分如下：
[0136] 10× Taq buffer 1×
[0137] Taq DNA聚合酶 1units
[0138] dNTPs 0.2mM
[0139] 上游引物 0.2μM；
[0140] 下游引物 0.2μM；
[0141] 灭菌水 补足18μl。
[0142] 阳性对照C的具体成分如下：独立分装的金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌的基因组DNA；
[0143] 阴性对照D：裂解液。
[0144] PCR反应体系：
[0145] PCR反应液B 18μl
[0146] 模板 2μl。
[0147] C、对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0148] D、琼脂糖凝胶电泳结果见图5，从图5中可以看出，本发明提供的检测体系可以用来直接扩增环境中不同位置采样的细菌模板，从而对环境中是否存在金黄色葡萄球菌、沃
氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌中的一种或多种
葡萄球菌进行鉴定。
氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌以及溶血葡萄球菌中的一种或多种
葡萄球菌进行鉴定。
[0149] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。
视为本发明的保护范围。