一种脂肪干细胞冻存液及其应用

摘要

本发明提供了一种脂肪干细胞及其应用，属于干细胞冻存技术领域。本发明所提供的脂肪干细胞冻存液包括40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，100‑250μM肛褶蛙肽。使用本发明提供的冻存液所长期冻存的脂肪干细胞具有更好的活性和成脂转化能力，而且使用本发明所提供的冻存液能够有效的降低长期冻存的脂肪干细胞的凋亡。

权利要求

1.一种脂肪干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，100‑250μM 肛褶蛙肽，所述肛褶蛙肽的氨基酸序列为Asp‑Val‑Pro‑Lys‑Ser‑Asp‑Gln‑Phe‑Val‑Gly‑Leu‑Met‑NH2。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，200μM 肛褶蛙肽。

说明书

一种脂肪干细胞冻存液及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于干细胞冻存技术领域，尤其涉及一种脂肪干细胞冻存液及其应用。

背景技术

[0002] 干细胞治疗是生物材料科学和组织工程技术相结合的新型治疗方式。常见的干细胞包括：骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞和外周血间充质干细
胞。脂肪间充质干细胞由于更易获得，因此是组织工程中理想的干细胞来源。研究表明，脂
肪间充质干细胞不仅具有很强的增殖和分化能力，而且能行向脂肪，骨，软骨，神经，肌肉等
方向分化。目前，脂肪间充质干细胞的复苏效率一般不高，该问题严重制约着脂肪间充质干
细胞的临床转化和基础研究。因此，制备有效的冻存液来减少冻存过程中脂肪间充质干细
胞的损伤对于脂肪干细胞治疗具有重要意义。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种脂肪干细胞冻存液及其应用。

[0004] 为实现上述目的，本发明提供了一种脂肪干细胞冻存液，所述冻存液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，肛褶蛙肽。

[0005] 优选地，所述冻存液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，100‑250μM 肛褶蛙肽。

[0006] 优选地，所述冻存液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，200μM 肛褶蛙肽。

[0007] 优选地，所述肛褶蛙肽的氨基酸序列为Asp‑Val‑Pro‑Lys‑Ser‑Asp‑Gln‑Phe‑Val‑Gly‑Leu‑Met‑NH2。

[0008] 其次，本发明提供了一种用于脂肪干细胞冻存液的多肽，所述多肽为肛褶蛙肽。

[0009] 优选地，所述肛褶蛙肽在脂肪干细胞冻存液中用于维持脂肪干细胞活性；

[0010] 所述肛褶蛙肽在脂肪干细胞冻存液中用于降低脂肪干细胞凋亡；

[0011] 所述肛褶蛙肽在脂肪干细胞冻存液中用于维持脂肪干细胞成脂分化能力。

[0012] 其次，本发明提供了肛褶蛙肽在制备脂肪干细胞活性维持剂中的应用。

[0013] 其次，本发明提供了肛褶蛙肽在制备脂肪干细胞凋亡抑制剂中的应用。

[0014] 其次，本发明提供了肛褶蛙肽在制备脂肪干细胞成脂分化维持剂中的应用。

[0015] 优选地，所述肛褶蛙肽的氨基酸序列为Asp‑Val‑Pro‑Lys‑Ser‑Asp‑Gln‑Phe‑Val‑Gly‑Leu‑Met‑NH2。

[0016] 本发明的有益效果是：

[0017] 本发明提供的脂肪干细胞冻存液能够在长期冻存环境下有效的维持脂肪干细胞的活性并降低脂肪干细胞的凋亡，同时，使用本发明冻存液长期冻存的脂肪干细胞能够保
持更好的成脂转化能力。

附图说明

[0018] 图1 实施例1和实施例5冻存细胞中Cleaved‑Caspase3和Cleaved‑Caspase9的表达水平；

[0019] 图2 实施例1和实施例5冻存细胞的成脂转化能力。

具体实施方式

[0020] 为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

[0021] 实施例1

[0022] （1）按照如下配方配置冻存液A：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO；

[0023] （2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液A混合，置于冻存盒中于‑80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。

[0024] 实施例2

[0025] （1）按照如下配方配置冻存液B：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，50μM 肛褶蛙肽；

[0026] （2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液B混合，置于冻存盒中于‑80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。

[0027] 实施例3

[0028] （1）按照如下配方配置冻存液C：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，100μM 肛褶蛙肽；

[0029] （2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液C混合，置于冻存盒中于‑80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。

[0030] 实施例4

[0031] （1）按照如下配方配置冻存液D：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，150μM 肛褶蛙肽；

[0032] （2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液D混合，置于冻存盒中于‑80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。

[0033] 实施例5

[0034] （1）按照如下配方配置冻存液E：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，200μM 肛褶蛙肽；

[0035] （2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液D混合，置于冻存盒中于‑80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。

[0036] 实施例6

[0037] （1）按照如下配方配置冻存液F：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，250μM 肛褶蛙肽；

[0038] （2）将1×106个人脂肪间充质干细胞与1ml冻存液D混合，置于冻存盒中于‑80℃放置过夜，之后转移至液氮中保存。

[0039] 实验例1

[0040] 1.细胞存活率检测

[0041] （1）在实施例1‑6细胞冻存12个月后，置于37℃水浴锅中进行细胞复苏；

[0042] （2）取100μl复苏的细胞于1.5ml离心管中，加入100μl台酚蓝染液染色5min，吸取10μl于血球计数板上进行计数，并计算细胞存活率，每组实验重复3次。

[0043] 各实施例冻存细胞的细胞存活率如下表：

[0044]

[0045] 从上表可以看出，实施例2‑实施例6的细胞存活率均高于实施例1，但是实施例2的P值大于0.05，因此无统计学意义。因此，当在现有技术的冻存液中添加100‑250μM 肛褶蛙
肽时，可以显著的提高冻存细胞的活性。其中，尽管相较于实施例5冻存细胞的存活率，实施
例6冻存细胞的存活率有一定程度的提升，但是提升无统计学意义，因此，本着节约的原则，
本发明将200μM 肛褶蛙肽作为最适浓度。

[0046] 实施例2

[0047] 凋亡相关蛋白检测

[0048] （1）在实施例1和实施例5细胞冻存12个月后，置于37℃水浴锅中进行细胞复苏；

[0049] （2）离心收集细胞后，添加含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液裂解细胞；

[0050] （3）冰上裂解30min后，将蛋白裂解液转移到EP管中，低温高速离心机12000rpm离心10min；

[0051] （4）离心结束之后，将上清转移至新的EP管中，参照BCA法测定蛋白浓度并添加loading buffer调整蛋白浓度，95℃煮5min得到蛋白样品；

[0052] （5）配置12%的分离胶和5%的浓缩胶，安装电泳架，进行点样；

[0053] （6）点样后，80V至溴酚蓝至分界处，之后，调整电压为120V，一直到溴酚蓝完全跑出；

[0054] （7）安装电转夹后，调整电转仪参数为恒流250mA电转90min，进行电转，电转结束后将膜取出置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1h；

[0055] （8）配置Cleaved‑Caspase3，Cleaved‑Caspase9和β‑actin一抗进行一抗孵育，置于4℃孵育过夜；

[0056] （9）孵育结束后，回收一抗，使用TBST进行洗膜，洗膜后孵育相应的二抗，置于摇床上，孵育1h；

[0057] （10）孵育结束后，去除二抗，使用TBST进行洗膜，添加显影液，进行显影。

[0058] 实施例结果如图1，可以看出，相较于实施例1，实施例5的Cleaved‑Caspase3和Cleaved‑Caspase9的表达量明显较低，说明200μM 肛褶蛙肽的添加显著的降低了长期冻存
导致的脂肪干细胞细胞凋亡。

[0059] 实施例3

[0060] 成脂转化能力检测

[0061] （1）在实施例1和实施例5细胞冻存12个月后，置于37℃水浴锅中进行细胞复苏；

[0062] （2）复苏后，将细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度达到95%时，更换为含5μg/ml胰岛素、0.25mM IBMX、0.25μM地塞米松和50μM吲哚美辛的α‑MEM完全培养基，细胞培养
3天后，更换为含5μg/ml胰岛素的α‑MEM完全培养基；

[0063] （3）成脂诱导8天后，去除培养基，使用PBS漂洗2次后加入500μl的4%甲醛固定细胞15min；

[0064] （4）固定结束后，弃去固定液，PBS漂洗后，加入500ul的60%异丙醇溶液处理1min，去除后，加入油红O染色液，染色10min；

[0065] （5）去除后，使用去离子水漂洗，之后，置于显微镜下拍照；

[0066] （6）之后，每孔加入500ul的100%异丙醇，孵育20min，将萃取出的油红O转移至新的EP管中，使用酶标仪检测540nm OD值。

[0067]  得到的结果如图2所示，其中，实施例1的OD值为0.776±0.055，实施例5的OD值为1.227±0.052，说明实施例5冻存的细胞具有更好的成脂转化能力。通过上述结果可以得
出，200μM 肛褶蛙肽的添加能够使人脂肪间充质干细胞在长期冻存时维持更好的成脂转化
能力。