二氧六环修饰的四氢咔啉-3-甲酰-The-EDG、其制备、抗转移活性和应用转让专利
申请号 : CN201911214985.7
文献号 : CN112979750B
文献日 : 2022-06-24
发明人 : 赵明 , 彭师奇 , 郤思远
申请人 : 首都医科大学
摘要 :
本发明公开了下式的3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly,公开了它的制备方法,公开了它的抗肿瘤转移活性。因而公开了它在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
权利要求 :
1.下式的3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly在制备抗肿瘤转移药物中的应用，
2.权利要求1所述的3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly在制备抗肿瘤转移药物中的应用,其特征在于,所述化合物
3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly的合成方法,包括以下步骤:
1)合成(3S)‑1,1‑二羟甲基‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸苄酯；
2)合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸苄酯；
3)合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸；
4)采用二环己基碳二亚胺为缩合剂,1‑羟基苯并三唑为催化剂液相合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑OBzl；
5)合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The；
6)采用二环己基碳二亚胺为缩合剂,1‑羟基苯并三唑为催化剂液相合成HCl·Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl；
7)采用二环己基碳二亚胺为缩合剂,1‑羟基苯并三唑为催化剂的方法合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl；
8)合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly。
说明书 :
二氧六环修饰的四氢咔啉‑3‑甲酰‑The‑EDG、其制备、抗转移
活性和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly化合物,涉及它的制备方法，涉及它的抗肿瘤转移活性。因而本发明涉及该化合物在抗肿瘤转移药物中的应用。
[0002]
背景技术
[0003] 肿瘤已经成为严重威胁人类健康的常见病。例如2015年新增的肿瘤患者大约有392.9万,其中有233.8万肿瘤患者死亡。平均每天有超过1万人被确诊为肿瘤。目前，临床应用治疗癌症的方法主要有放射疗法，化学疗法，抗体治疗和免疫治疗等。然而由于严重的副作用，药物治疗后产生多药耐药性以及昂贵的治疗价格，使得癌症的治疗再度陷入困境。发明新型的抗肿瘤药物是药物研究的前沿之一。
[0004] 3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸是具有多种生物活性的药效团,茶氨酸也是具有多种生物活性的药效团。发明人发现3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸与茶氨酸两个药效团融合形成的下式左的3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The具有抗肿瘤的作用。进一步的研究使,发明人认识到，在3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The的羧基端引入尿毒素三肽Glu‑Asp‑Gly生成的下式右的3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly还具有抗肿瘤转移作用。根据这种认识,发明人提出了本发明。
[0005]
发明内容
[0006] 本发明的第一个内容是提供下式的3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly。
[0007]
[0008] 本发明的第二个内容是提供3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly的制备方法，该方法包括：
[0009] 1)合成(3S)‑1,1‑二羟甲基‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸苄酯；
[0010] 2)合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸苄酯；
[0011] 3)合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸；
[0012] 4)采用二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，1‑羟基苯并三唑(HOBt)为催化剂的液相缩合的方法，合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑OBzl；
[0013] 5)合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The；
[0014] 6)采用DCC为缩合剂，HOBt为催化剂的液相缩合的方法，合成HCl·Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl；
[0015] 7)采用DCC为缩合剂，HOBt为催化剂的液相缩合的方法，合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl；
[0016] 8)合成3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly；
[0017] 本发明的第三个内容是评价3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly的抗肿瘤转移的作用其中包括：
[0018] 1.评价3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly抑制肿瘤细胞迁移及侵袭的能力
[0019] 2.评价3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly体内抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤转移活性
附图说明
[0020] 图1.3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly的合成路线：i)三氟乙酸,1,3‑二羟基丙酮；ii)浓硫酸,丙酮；iii)钯碳(Pd),H2；iv)二环己基碳二亚胺(DCC)，1‑羟基苯并三唑(HOBt)，N‑甲基吗啉(NMM)；v)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)。
具体实施方式
[0021] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0022] 实施例1制备(3S)‑1,1‑二羟甲基‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸苄酯(1)
[0023] 往10mL二氯甲烷中加入2g(7.2mmol)L‑色氨酸苄酯，充分搅拌使其溶解。冰浴条件下，往溶液中缓慢滴加1mL三氟醋酸。然后再往该溶液中加0.78g(8.6mmol)1,3‑二羟基丙酮，室温反应7小时。TLC显示L‑色氨酸苄酯消失(二氯甲烷/甲醇：30:1)。冰浴条件下，往溶液中加入50mL饱和NaHCO3溶液，充分搅拌，然后留下二氯甲烷层，再用饱和NaHCO3溶液(30mL×3)洗，再用饱和NaCl溶液(30mL×3)洗，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液+减压浓缩得到2.03g(77％)标题化合物，为黄色粉末。ESI‑MS(m/e):367[M+H]。
[0024] 实施例2制备3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸苄酯(2)
[0025] 往5mL无水丙酮中加入0.2g(0.55mmol)(3S)‑1,1‑二羟甲基‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸苄酯(1)。在冰浴条件下，往里加入100μL浓硫酸，之后，室温搅拌3小时。TLC显示化合物1消失(石油醚/乙酸乙酯，4:1)。冰浴条件下，用饱和NaHCO3溶液调节反应液pH值为7，得到的溶液减压浓缩除去丙酮，残留液再加乙酸乙酯萃洗3遍，乙酸乙酯层用饱和NaCl溶液洗至中性。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩得到的棕黄色固体，经柱层层析分离(石油醚/乙酸乙酯，4:1)得到0.08g(35.8％)标题化合物，为白色国体。ESI‑MS(m/+e):407[M+H]。
[0026] 实施例3制备3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸(3)
[0027] 往10mL甲醇中加入0.20g(0.5mmol)3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸苄酯(2)和0.02g Pd/C。搅拌并通12h氢气，TLC显示化合物2消失(石油醚/乙酸乙酯，4:1)。过滤除去钯碳(Pd/C)，滤液减压浓缩。残留物用乙醚磨洗，得+
到0.14g(90％)标题化合物，为无色固体。ESI‑MS(m/e):317[M+H]。
到0.14g(90％)标题化合物，为无色固体。ESI‑MS(m/e):317[M+H]。
[0028] 实施例4制备3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑OBzl(4)
[0029] 往20mL四氢呋喃中加入0.19g(0.6mmol)3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸(3)，0.15g(0.72mmol)N,N'‑二环己基碳二亚胺(DCC)和0.09g(0.72mmol)1‑羟基苯并三唑(HOBt)。冰浴下搅拌30分钟。之后，再向反应液中加入
0.20g(0.66mmol)HCl·The‑OBzl。之后，向反应液中滴加N‑甲基吗啉(NMM)调节反应液的pH值为9。室温搅拌6小时，TLC显示化合物3消失(二氯甲烷/甲醇，30/1)。滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩，得到的残留物用30mL乙酸乙酯溶解，溶液再过滤除去DCU。滤液依次用5％NaHCO3水溶液萃洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，5％KHSO4水溶液洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，5％NaHCO3水溶液洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩，得到的黄色粉末经硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯，10/1)，得到0.27g(80％)标题化合物，为无色粉末。ESI‑MS(m/e):
+ 1
563[M+H] ；H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝10.94(s,1H),8.28(t,J＝7.2Hz,1H),7.79(s,1H),7.37(m,6H),7.07(m,1H),7.02(m,1H),5.16(s,1H),5.12(s,1H),4.40(m,1H),4.21(m,1H),3.99(m,1H),3.75(m,1H),3.61(m,2H),3.02(m,2H),2.12(m,2H),1.82(m,2H),1.65(s,3H),1.42(s,3H),1.22(m,2H),1.01(m,3H)。
0.20g(0.66mmol)HCl·The‑OBzl。之后，向反应液中滴加N‑甲基吗啉(NMM)调节反应液的pH值为9。室温搅拌6小时，TLC显示化合物3消失(二氯甲烷/甲醇，30/1)。滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩，得到的残留物用30mL乙酸乙酯溶解，溶液再过滤除去DCU。滤液依次用5％NaHCO3水溶液萃洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，5％KHSO4水溶液洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，5％NaHCO3水溶液洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩，得到的黄色粉末经硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯，10/1)，得到0.27g(80％)标题化合物，为无色粉末。ESI‑MS(m/e):
+ 1
563[M+H] ；H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝10.94(s,1H),8.28(t,J＝7.2Hz,1H),7.79(s,1H),7.37(m,6H),7.07(m,1H),7.02(m,1H),5.16(s,1H),5.12(s,1H),4.40(m,1H),4.21(m,1H),3.99(m,1H),3.75(m,1H),3.61(m,2H),3.02(m,2H),2.12(m,2H),1.82(m,2H),1.65(s,3H),1.42(s,3H),1.22(m,2H),1.01(m,3H)。
[0030] 实施例5制备3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The(5)
[0031] 往10mL甲醇中加入0.28g(0.5mmol)3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑OBzl(4)和0.02g钯碳(Pd/C)。搅拌并通12h氢气，TLC显示化合物4消失(二氯甲烷/甲醇，30/1)。过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩。残留物用乙醚磨洗，+ 1
得到0.21g(90％)标题化合物，为黄色固体。ESI‑MS(m/e):473[M+H] ，H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝10.98(s,1H),8.18(d,J＝7.5Hz,1H),7.79(s,1H),7.40(dt,J1＝4.8Hz,J2＝
8.1Hz,2H),7.02(td,J1＝8.1Hz,J2＝4.8Hz,2H),4.40(m,1H),4.28(m,1H),4.12(m,1H),
4.02(m,1H),3.81(m,1H),3.61(m,1H),3.02(m,2H),2.14(m,2H),1.82(m,2H),1.65(s,3H),
1.41(s,3H),1.22(m,2H),1.03(m,3H)。
得到0.21g(90％)标题化合物，为黄色固体。ESI‑MS(m/e):473[M+H] ，H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝10.98(s,1H),8.18(d,J＝7.5Hz,1H),7.79(s,1H),7.40(dt,J1＝4.8Hz,J2＝
8.1Hz,2H),7.02(td,J1＝8.1Hz,J2＝4.8Hz,2H),4.40(m,1H),4.28(m,1H),4.12(m,1H),
4.02(m,1H),3.81(m,1H),3.61(m,1H),3.02(m,2H),2.14(m,2H),1.82(m,2H),1.65(s,3H),
1.41(s,3H),1.22(m,2H),1.03(m,3H)。
[0032] 实施例6制备Boc‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl
[0033] 采用实施例3的方法，从1.61g(5mmol)Boc‑Asp(OBzl)和1.86g(5.5mmol)Tos·Gly‑OBzl得到1.99g(85％)标题化合物，为无色固体。
[0034] 实施例7制备HCl·Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl
[0035] 冰浴下将1.41g(3mmol)Boc‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl用20mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)溶解并反应4小时。TLC监测显示反应完全(体系为二氯甲烷/甲醇，30/1)。反应混合物减压浓缩，残留物用无水乙酸乙酯溶解，得到的溶液再减压浓缩。该操作重复3次。得到的白色粉末样物质用无水乙醚充分磨洗，得到1.01g(90％)标题化合物，为无色固体。
[0036] 实施例8制备Boc‑Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl
[0037] 采用实施例3的方法从1.68g(5mmol)Boc‑Glu(OBzl)和2.44g(6mmol)HCl·Asp+(OBzl)‑Gly‑OBzl得到2.76g(80％)标题化合物，为无色固体。ESI‑MS(m/e):712[M+Na]。
[0038] 实施例9制备HCl·Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl
[0039] 采用实施例6的方法从2.06g(3mmol)Boc‑Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl得到1.69g(90％)标题化合物，为无色固体。
[0040] 实施例10制备3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl(6)
[0041] 往30mL无水四氢呋喃中加入0.47g(1mmol)3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The(5)、0.25g(1.2mmol)DCC和0.16g(1.2mmol)HOBt，冰浴下，搅拌30分钟。之后，向反应液中加入0.69g(1.1mmol)HCl·Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl。滴入N‑甲基吗啉(NMM)调节反应液的pH值为9。室温反应8小时。TLC显示化合物5消失(二氯甲烷/甲醇，15/1)，滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩。残留物用100mL乙酸乙酯溶解，溶液再过滤除去DCU。滤液依次用5％NaHCO3水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，5％KHSO4水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，5％NaHCO3水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩，得到黄色粉末，经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，15/1)，得到0.71g+ 1
(70％)标题化合物，为黄色粉末。ESI‑MS(m/e):1045[M+H] ；H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝10.92(s,1H),8.25(m,2H),8.18(m,1H),8.03(m,1H),7.76(m,1H),7.30(m,17H),7.07(m,1H),6.96(m,1H),5.06(m,6H),4.70(m,1H),4.30(m,3H),4.00‑3.75(m,4H),3.63(m,
2H),3.02(m,4H),2.83(m,1H),2.67(m,1H),2.44(m,2H),2.13(m,2H),2.12(m,2H),1.87(m,
2H),1.61(s,3H),1.38(s,3H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H)。
(70％)标题化合物，为黄色粉末。ESI‑MS(m/e):1045[M+H] ；H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝10.92(s,1H),8.25(m,2H),8.18(m,1H),8.03(m,1H),7.76(m,1H),7.30(m,17H),7.07(m,1H),6.96(m,1H),5.06(m,6H),4.70(m,1H),4.30(m,3H),4.00‑3.75(m,4H),3.63(m,
2H),3.02(m,4H),2.83(m,1H),2.67(m,1H),2.44(m,2H),2.13(m,2H),2.12(m,2H),1.87(m,
2H),1.61(s,3H),1.38(s,3H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H)。
[0042] 实施例11制备3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly(7)
[0043] 往10mL甲醇中加入0.05g(0.05mmol)3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu(OBzl)‑Asp(OBzl)‑Gly‑OBzl(6)和0.005g Pd/C，搅拌并通12h氢气，TLC显示化合物6消失(乙酸乙酯:水:冰醋酸，4:1:1)。过滤除去钯碳(Pd/C)，滤液减压浓缩。残留物用乙醚磨洗，得到0.03g(85％)标题化合物，为无色固体。ESI‑MS‑
(m/e):773[M‑H] ,1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝10.92(s,1H),8.23(m,1H),8.16(m,
1H),8.03(m,2H),7.40(m,2H),7.00(m,2H),4.56(m,2H),4.25(m,1H),4.01(m,1H),3.89(m,
2H),3.72‑3.52(m,4H),2.72(m,1H),2.61(m,1H),2.31(m,2H),2.12(m,2H),1.98(m,2H),
13
1.89(m,2H),1.62(s,3H),1.40(s,3H),1.02(t,J＝7.2Hz,3H). CNMR(125MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝174.54,172.10,171.83,171.80,171.45,171.39,171.28,136.53,121.62,119.13,
118.20,111.75,109.02,98.16,64.55,52.92,52.57,52.45,49.82,41.28,36.50,33.82,
32.28,30.46,28.31,27.72,26.30,20.24,15.16。
(m/e):773[M‑H] ,1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝10.92(s,1H),8.23(m,1H),8.16(m,
1H),8.03(m,2H),7.40(m,2H),7.00(m,2H),4.56(m,2H),4.25(m,1H),4.01(m,1H),3.89(m,
2H),3.72‑3.52(m,4H),2.72(m,1H),2.61(m,1H),2.31(m,2H),2.12(m,2H),1.98(m,2H),
13
1.89(m,2H),1.62(s,3H),1.40(s,3H),1.02(t,J＝7.2Hz,3H). CNMR(125MHz,DMSO‑d6):δ/ppm＝174.54,172.10,171.83,171.80,171.45,171.39,171.28,136.53,121.62,119.13,
118.20,111.75,109.02,98.16,64.55,52.92,52.57,52.45,49.82,41.28,36.50,33.82,
32.28,30.46,28.31,27.72,26.30,20.24,15.16。
[0044] 实施例12用Transwell小室实验评价化合物7抑制肿瘤细胞迁移的能力
[0045] 实验方法：
[0046] 取生长状态良好处于对数生长期的A549细胞，0.25％胰酶消化，镜下观察，加入血6
清终止消化并3000rpm离心3min，计数，配成单细胞悬液，密度为2×10个/mL。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液，同时加入化合物7的溶液，使终浓度为20μM。下室加入600μL的含10％FBS的1640培养基，在37℃和5％CO2培养箱中培养6小时，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色15min，吸除染色液，用PBS洗3次，在每个小室选取9个视野进行拍照并计数，细胞数以 表示。
清终止消化并3000rpm离心3min，计数，配成单细胞悬液，密度为2×10个/mL。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液，同时加入化合物7的溶液，使终浓度为20μM。下室加入600μL的含10％FBS的1640培养基，在37℃和5％CO2培养箱中培养6小时，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色15min，吸除染色液，用PBS洗3次，在每个小室选取9个视野进行拍照并计数，细胞数以 表示。
[0047] 实验结果：
[0048] 实验结果列入表1：
[0049] 表1化合物7抑制A549细胞迁移的活性
[0050]
[0051] 注：n＝6，给药方式均为灌胃，经t检验，a)与空白对照组相比，P<0.05.[0052] 结果表明，加入化合物7的组别的细胞迁移数(207.56±11.50)与阴性对照组生理盐水有显著性差别(243.00±44.92，P<0.01)。可见，20μmol/L浓度的化合物7可抑制人非小细胞肺癌细胞A549的迁移。
[0053] 实施例13用Transwell小室实验评价化合物7抑制肿瘤细胞侵袭的能力
[0054] 实验方法：
[0055] 包被基质胶：预先将保存在‑20℃冰箱中呈黄色固态的Matrigel基质胶置于4℃冰箱约12h使之成为粉红色具有良好流动性的液态。尽快取240μL Matrigel基质胶加入到960μL相应肿瘤细胞所需的无血清培养基中，吹打将其稀释5倍分散均匀，上室每孔加100μL后于37℃，5％CO2的细胞孵箱中孵育5h，使基质胶均匀铺至聚碳酸酯膜小孔中。
[0056] 水化基底膜：使用移液枪小心吸除上室残液，加入50μL相应无血清培养基，再次于37℃，5％CO2的细胞孵箱中孵育30min后，使用移液枪小心吸除上室残液备用。
[0057] 取生长状态良好处于对数生长期的A549细胞，0.25％胰酶消化，镜下观察，加入血6
清终止消化并3000rpm离心3min，计数，配成单细胞悬液，密度为2×10个/mL。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液，同时加入化合物7的溶液，使终浓度为20μM。下室加入600μL的含10％FBS的1640培养基，，置于37℃5％CO2的细胞孵箱内培养(A549细胞培养12h)，待各细胞株所需时间过后进行后处理，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色15min，吸除染色液，用PBS洗3次，在每个小室选取9个视野进行拍照并计数，细胞数以 表示。
清终止消化并3000rpm离心3min，计数，配成单细胞悬液，密度为2×10个/mL。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液，同时加入化合物7的溶液，使终浓度为20μM。下室加入600μL的含10％FBS的1640培养基，，置于37℃5％CO2的细胞孵箱内培养(A549细胞培养12h)，待各细胞株所需时间过后进行后处理，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色15min，吸除染色液，用PBS洗3次，在每个小室选取9个视野进行拍照并计数，细胞数以 表示。
[0058] 实验结果：
[0059] 实验结果列入表2：
[0060] 表2化合物7抑制A549细胞侵袭的活性
[0061]
[0062] 注：n＝6，给药方式均为灌胃，经t检验；a)与空白对照组相比，P<0.01且与RGDS组相比P>0.05.
[0063] 结果表明，加入化合物7的组别的细胞侵袭数(183.22±21.94)与阴性对照组生理盐水有显著性差别(252.78±17.49，P<0.01)，且与阳性对照组RGDS无显著差别(183.22±21.94，P>0.05)。可见，20μmol/L浓度的化合物7可抑制人非小细胞肺癌细胞A549的侵袭，并与同浓度下的RGDS组抑制癌细胞侵袭的活性相当。
[0064] 实施例14评价化合物7抑制小鼠肿瘤转移的活性
[0065] 实验动物：
[0066] C57BL/6小鼠，雄性，20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0067] 给药剂量及给药方式：
[0068] 本发明的化合物3S‑1‑(1,1‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑6‑螺基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑The‑Glu‑Asp‑Gly(化合物7)的口服剂量为0.23μmol/kg，阳性对照RGDS四肽的注射剂量为20μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
[0069] 实验方法：实验采用小鼠Lewis抗肺癌转移模型。
[0070] 实验操作：
[0071] Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，购自ATCC。选用DMEM培养基，其中含10％经灭活的胎牛5
血清，1×10 U/L青霉素和100mg/L链霉素。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好，处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至2×
7
10个/mL，胎盘蓝(Tryanblue)染色计数，活细胞数>95％。取近交系C57BL/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液0.2mL/只。小鼠接种后10天可以长出直径约4‑5mm的肿瘤，作为瘤源备用。
血清，1×10 U/L青霉素和100mg/L链霉素。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好，处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至2×
7
10个/mL，胎盘蓝(Tryanblue)染色计数，活细胞数>95％。取近交系C57BL/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液0.2mL/只。小鼠接种后10天可以长出直径约4‑5mm的肿瘤，作为瘤源备用。
[0072] 取接种8‑10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，乙醚麻醉，脱颈椎处死，用75％的乙醇浸泡消毒10min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的肿瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重(g):生理盐水体积(mL)为1:3的比例加入4℃预冷的生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目细胞筛制成单细胞悬液，用生理盐水调整7
细胞浓度为2×10个/mL，胎盘蓝染色计数，活细胞数>95％。
细胞浓度为2×10个/mL，胎盘蓝染色计数，活细胞数>95％。
[0073] 取近交系C57BL/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液0.2mL/只。接种10天后长出直径约4‑5mm的肿瘤，测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积随机分组，
[0074] 从接种肿瘤第10天后开始给药，共给药10次，每隔两天测量并记录肿瘤体积。第22天后，乙醚麻醉小鼠，脱颈椎处死，取出肿瘤称重，并记录肿瘤的肺部转移率和转移瘤结数。
[0075] 实验结果：
[0076] 实验结果列入表3：
[0077] 表3化合物7抑制肿瘤肺转移的活性
[0078]
[0079] 注：n＝12，RGDS为腹腔注射给药，其他均为灌胃方式给药，经t检验；a)与生理盐水组相比，P<0.05且与RGDS组相比，P>0.05.
[0080] 结果表明，0.23μmol/kg剂量下口服化合物7治疗的小鼠的体内抗肿瘤转移瘤结数(4.45±2.11)与阴性对照组生理盐水有显著性差别(9.38±2.62，P<0.05),且与阳性对照组RGDS无显著性差别(4.50±2.25，P>0.05)可见，化合物7在口服剂量低至0.23μmol/kg时与腹腔注射剂量为20μmol/kg/天的RGDS的抑制肿瘤转移的活性相当。可见,本发明有突出的技术效果。