抗人IL-33单克隆抗体及其应用转让专利
申请号 : CN202110427177.X
文献号 : CN112979802B
文献日 : 2021-08-03
发明人 : 王晋 , 邓小芳 , 吴健 , 徐晓红 , 朱戬 , 蔺利娟
申请人 : 上海普铭生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其包括重链可变区和轻链可变区,分别具有选自以下重链可变区序列和轻链可变区序列组合的3个CDRs:(1) 如SEQ ID NO: 2的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 48的轻链可变区序列;
(2) 如SEQ ID NO: 5的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 51的轻链可变区序列;
(3) 如SEQ ID NO: 20的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 66的轻链可变区序列;
(4) 如SEQ ID NO: 22的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 68的轻链可变区序列;
(5) 如SEQ ID NO: 25的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 71的轻链可变区序列;
(6) 如SEQ ID NO: 42的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 88的轻链可变区序列。
2.一种抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其中所述抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别选自以下组合:
(1) 如SEQ ID NO: 2的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 48的轻链可变区序列;
(2) 如SEQ ID NO: 5的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 51的轻链可变区序列;
(3) 如SEQ ID NO: 20的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 66的轻链可变区序列;
(4) 如SEQ ID NO: 22的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 68的轻链可变区序列;
(5) 如SEQ ID NO: 25的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 71的轻链可变区序列;
(6) 如SEQ ID NO: 42的重链可变区序列,和如SEQ ID NO: 88的轻链可变区序列。
3.如权利要求1或2所述抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其特征在于所述抗体或其片‑8
段特异性结合于人IL‑33上与ST2受体结合的位点,并且其与IL‑33结合的KD<1×10 。
4.如权利要求1或2所述抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其特征在于所述抗体或其片段通过阻断人IL‑33与ST2的结合,抑制IL‑33诱导的细胞因子分泌。
5.如权利要求1或2所述抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其特征在于所述抗体或其片段通过阻断人IL‑33与ST2的结合,抑制IL‑33诱导的淋巴细胞分泌IL‑5。
6.如权利要求1或2所述抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其特征在于所述抗体或其片段来自鼠源抗体、兔源抗体、人源抗体、嵌合抗体、人源化抗体。
7.如权利要求1或2所述抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其特征在于所述抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dAb。
8.一种人源化抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其是在权利要求1‑2中任一项所述抗人IL‑33单克隆抗体或其片段的基础上,采用CDRs移植技术、CDR区突变设计构建的人源化抗人IL‑33单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的人源化抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其特征在于:重链可变区,具有选自SEQ ID NO: 93‑108中任一重链可变区序列的3个CDRs;
和
轻链可变区,具有选自SEQ ID NO: 109‑118中任一轻链可变区序列的3个CDRs。
10.如权利要求8‑9中任一项所述的人源化抗人IL‑33单克隆抗体或其片段,其特征在于:所述抗体部分包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dAb。
11.一种多核苷酸,其编码权利要求 1‑10 中任一项所述抗人 IL‑33 单克隆抗体或其片段。
12.核酸构建体,其包含权利要求 11 所述的多核苷酸。
13.宿主细胞,其包含
(1)权利要求 11 所述的多核苷酸或
(2)权利要求 12 所述的核酸构建体。
14.一种制备抗人 IL‑33 单克隆抗体或其片段的方法,包括:(1)在合适的条件下,培养权利要求 13 所述的宿主细胞;
(2)分离回收抗人 IL‑33 单克隆抗体或其片段或者人源化抗人 IL‑33 单克隆抗体或其片段。
15.一种组合物,其包含
(1)权利要求 1‑10 中任一项所述抗人 IL‑33 单克隆抗体或其片段、(2)权利要求 11 所述多核苷酸、(3)权利要求 12 所述核酸构建体和/或
(4)权利要求 13 所述宿主细胞;
以及药学上可接受的辅料。
16.如下产品在制备治疗 IL‑33/ST2 信号通路相关疾病的药物中的用途,(1)权利要求 1‑10 中任一项所述抗人 IL‑33 单克隆抗体或其片段、(2)权利要求 11 所述多核苷酸、(3)权利要求 12 所述核酸构建体、(4)权利要求 13 所述宿主细胞和/或
(5)权利要求 15 所述组合物。
17.如权利要求16所述产品在制备治疗 IL‑33/ST2 信号通路相关疾病的药物中的用途,其中IL‑33/ST2 信号通路相关疾病包括变态反应性疾病。
18.如权利要求 17 所述用途,其特征在于所述变态反应性疾病,包括哮喘,过敏性疾病,自身免疫病,和心肺疾病。
19.如权利要求 18所述用途,其特征在于所述自身免疫病,包括风湿性关节炎、系统性红斑狼疮。
20.如权利要求 18所述用途,其特征在于所述心肺疾病,包括心衰、扩心病。
说明书 :
抗人IL‑33单克隆抗体及其应用
技术领域
用。
背景技术
角‑螺旋的结构模式,含有染色质结合区及核定位序列,是一种具有转录抑制功能的染色质
相关因子;其羧基端具有IL‑1类分子特有的结构域,是IL‑33与其受体的结合部位。IL‑33常
表达于屏障组织细胞,如皮肤、肠、肺等,当这些细胞发生损伤时,全长IL‑33(1‑270)在胞外
经中性粒细胞丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶G和弹性蛋白酶酶切,产生3种活性形式,分别是
IL‑33(95‑270),IL‑33(99‑270)和IL‑33(109‑270)。
促进Th2细胞产生和释放IL‑5、IL‑13等Th2型细胞因子。由于IL‑33的受体(ST2)选择性地表
达在Th2细胞上(Thl细胞不表达),从而增强了Th2型免疫应答。IL‑33对肥大细胞的作用是
通过诱导其产生趋化因子和细胞因子而增强炎症反应。IL‑33对其他细胞(嗜酸粒细胞、嗜
碱粒细胞、树突细胞)的作用也是通过诱导产生Th2型细胞因子和趋化因子,上调细胞黏附
分子的表达而促进炎症反应。
生IL‑4、IL‑5、IL‑13等Th2型细胞因子,加重炎症反应。阻断IL‑33/ST2信号通路有望为过敏
性疾病的诊断、预防和治疗带来新的希望。IL‑4 、IL‑5和IL‑13在2型免疫中发挥多种重要
作用,协同调控2型炎症通路的激活,呈现出2型炎症通路的典型特征:高浓度IgE和嗜酸性
粒细胞。目前认为IL‑4、IL‑5和IL‑13是2型炎症通路的关键驱动因子,是特异性治疗严重过
敏性疾病(包括特异性皮炎、哮喘、特发性荨麻疹、慢性鼻窦炎鼻息肉以及食物过敏等)颇具
吸引力的一类靶点。
(invariant nature killer T,iNKT)和中性粒细胞。在此过程中,IL‑33诱导细胞激活、分
化、极化、趋化及不同细胞因子和化学因子的产生。ST2可表达在一些Th2型免疫相关的细
胞,因此体内应用重组IL‑33可在不同的小鼠模型(包括哮喘和寄生虫感染)诱导或扩增Th2
反应。此外,与体外IL‑33可诱导不同细胞产生前炎性因子相一致,IL‑33也可引起模型动物
产生炎症效应。 IL‑33定位于静止细胞的细胞核,通过H2A‑H2B组蛋白复合体结合到染色
质;IL‑33与异染色质的关系研究表明,其具有转录抑制和染色质凝缩的特性。在胰腺星型
细胞的核内存在IL‑33的表达,通过RNA干扰IL‑33的表达可减少这种细胞的增殖。
化。此外AxelJ.Hueber发现牛皮癣患者皮肤IL‑33和ST2的表达也显著增多。IL‑33通过触发
肥大细胞、中性粒细胞的激活而导致牛皮癣的形成。
的过敏性疾病。目前普遍认为哮喘的发病机制是:Thl/Th2的亚群比例和功能的失衡,即Thl
型细胞数目和功能相对减弱,而Th2型免疫应答占优势。而IL‑33正是加强Th2型免疫应答的
一种细胞因子,它作用的靶细胞也正是上述各类炎性细胞。目前认为过敏性哮喘的发病过
程是由于暴露于空气中的过敏原、污染、呼吸道病毒等造成肺上皮细胞的损害,可激活上皮
细胞模式识别受体(如Toll样受体4,TLR4)],激活的TLR4信号通路可促进IL‑33的表达,从
而引起一系列级联反应,主要是通过激活以下几种细胞发挥作用:①通过招募大量的树突
状细胞从而激活过敏原特异性Th2应答,促使Th2产生大量的IL‑4、IL‑5和IL‑13;②通过促
进嗜酸粒细胞的聚集、成熟和存活;③通过作用于肥大细胞和IL一13诱导气道对过敏原产
生高反应性。目前,国内外关于IL‑33在哮喘的发病机制中所起的作用的研究已取得了一定
的成果,IL‑33主要通过作用于T淋巴细胞而加重哮喘的有关证据:在哮喘发病过程中,浸润
到呼吸道的淋巴细胞主要为Th2细胞。而IL‑33的受体也主要表达于Th2细胞上,通过它的信
号转导通路促进了Th2型细胞因子的产生,引起炎症。IL‑33是Th2细胞的趋化因子,它促使
Th2细胞在淋巴结和组织中募集。在大规模哮喘病的研究中,已得出IL‑33与ST2基因均是哮
喘的易感因素。巩芷娟等发现在人类Th2细胞中ST2选择性表达,并且在支气管哮喘患者外
周血单个核细胞中ST2 mRNA水平明显升高。Pr6fontaine等研究证实人气道上皮细胞、平滑
肌细胞和血管内皮细胞组成型表达IL‑33mRNA,哮喘可使其表达升高。麻晓燕等研究外周血
IL‑33水平,与正常健康者相比,在中重度患者明显提高,在轻度患者无明显差异。Besnard
等研究结果发现在用卵白蛋白诱发哮喘模型中,IL‑33可诱导募集肺部抗原提呈细胞DC,并
活化DC,进而影响Th2型应答导致过敏性气道炎性反应。总之,可以推断IL‑33作用于Th2细
胞的过程是通过其触发一系列级联反应,最终激活Th2细胞并且诱导产生大量Th2型细胞因
子形成慢性炎症。最新动物实验结果表明,应用抗ST2L单克隆抗体能阻止IL‑33与ST2L结
合,并下调IL‑33诱导核因子NF‑KB信号,可减轻Th2型为主的免疫应答。
敏性鼻炎的发病机制目前认为是由细胞因子失衡引起的。有研究报道,日本学者研究发现
在花粉症患者血清中有高水平的IL‑33检出。之后,有研究证实血清中IL 33的水平不仅是
Th2型细胞介导的过敏反应的标志,更是过敏性鼻炎严重程度的标志。在过敏性鼻炎的发病
机制中,起最主要作用的是肥大细胞,IL‑33诱导肥大细胞产生趋化因子和Th2型细胞因子
加重了炎症反应。
过敏性肠炎是IL‑4、IL‑5、IL‑13等介导的Th2型炎症反应。最新资料表示,IL‑33不但是肠粘
膜Th2细胞强效的化学诱导剂,促使Th2相关细胞因子(如IL‑4、IL‑5和IL‑13)的表达,而且
能促进肥大细胞表达促炎症因子和趋化蛋白。IL‑33在正常人的结肠黏膜层的上皮细胞具
有较高水平表达,参与调控固有免疫和适应性免疫的启动阶段。Carriere等在正常人小肠
派氏集合淋巴结的小静脉高内皮细胞中也检出IL‑33的表达。Sponheim等的研究发现,过敏
性肠炎的肠道组织中IL‑33mRNA表达水平较正常人高2‑6倍,对病变部位活检组织标本进行
免疫组化检测发现黏膜上皮下肌纤维母细胞IL‑33呈阳性高表达。研究发现,其实IL‑33在
过敏性肠炎的发病机制中是通过以下三种方式发挥作用的:①作为核因子抑制转录阻遏促
炎症基因表达;②通过参与调控肠黏膜淋巴细胞Th2型免疫应答;③通过促进肠黏膜肥大细
胞表达促炎性因子。
细胞水平的升高而产生大量的IL‑4、IL‑5、IL‑13等细胞因子。已有研究表明:当用不同浓度
的IL‑33作用小鼠时,IL‑33浓度越高,小鼠体内产生的IL‑4、IL‑5、IL‑13也就越多。主要病
理表现体现在肺部血管和呼吸道的变化上:①肺部血管的变化:在血管内皮下、血管壁内以
及血管附近会有嗜酸粒细胞和单核细胞的浸润;②在呼吸道的变化:主要表现在支气管和
较大的细支气管黏膜上皮肿胀,管腔内充满粘液。这可能与IL‑33有效地介导嗜酸粒细胞活
性,并能上调嗜酸粒细胞表面的V6细胞间黏附分子1(ICAM‑1)的表达量,并诱导其产生IL‑
6、IL‑8等细胞因子而加重炎症反应有关。
于治疗过敏性哮喘、慢性阻塞性肺病。AnaptysBio公司推出的Etokimab(ANB020)也进入了
II期临床试验阶段(NCT02920021、NCT03469934、NCT03533751),用于治疗特应性皮炎、过敏
症、鼻窦炎、哮喘。礼来公司研发的LY3375880也初步完成了特异性皮炎的II期临床评估
(NCT03831191)。另外,辉瑞公司研发的PF‑06817024进入了I期临床阶段(NCT02743871)。
再生元开发的全人源抗IL‑33单抗Itepekimab,然而其在哮喘、特异性皮炎、慢性阻塞性肺
炎等的临床应用前景方面仍不明朗。此外,全人源抗体Itepekimab在临床上导致不良反应
率较高,单独使用Itepekimab的不良事件(aes)发生率为61.6%。其它关于抗IL‑33抗体药物
的研究在人源化程度、亲和力强度、影响细胞因子分泌等方面产生的效果均存在不足。
发明内容
ST2结合的阻断活性分析、测序,构建人‑鼠嵌合抗人IL‑33单克隆抗体,检测嵌合抗体的动
力学参数。在鼠源抗体、嵌合抗体性能分析的基础上,采用CDRs移植技术、CDR区突变设计构
建人源化抗人IL‑33单克隆抗体,检测人源化抗体的动力学参数、亲和力、以及阻断IL33诱
导的细胞因子释放。所述抗人IL‑33单克隆抗体对IL‑33具有较高的亲和力、能有效阻断IL‑
33与其受体ST2的结合、抑制IL‑33/ST2通路相关的免疫应答,在哮喘、炎症性疾病、糖尿病、
自身免疫性疾病的治疗中具有良好的应用前景。
其片段特异性结合于人IL‑33上与ST2受体结合的位点,并且其与IL‑33结合的KD<1×10 。
、1×10 、5×10 、1×10 、5×10 、1×10 。
设计构建的人源化抗人IL‑33单克隆抗体。
和/或前述宿主细胞,以及可选的药学上可接受的辅料。
组合物在制备治疗IL‑33/ST2信号通路相关疾病的药物中的用途。
如心衰、扩心病等。
IL‑1家族,常表达于屏障组织细胞,如皮肤、肠、肺等。当这些细胞发生损伤时,IL‑33的胞外
域能够被中性粒细胞丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶G和弹性蛋白酶酶切,产生活性形式的酶切
片段,激活肥大细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞从而产生Th2类细胞因子。IL‑33在炎症、感
染、自身免疫性疾病中发挥着十分重要的作用。
定的受体/抗体结合,并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成,
即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结
构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区,其由较为保守的框架
区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成,从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、
FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。
抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,包括多种免疫系统细胞(例
如,效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段,由VL、
VH、CL和CH1构成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的
二价片段;(iii)由VH和CH1构成的Fd片段;(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段;(v)由VH
构成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544‑546);(vi)分离的互补决定区
(CDR);以及(vii)纳米抗体,一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此
外,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码,它们可以通过重组法经由使两者
成为单蛋白链的合成接头而连接,其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv);参
见例如Bird et al.,(1988)Science 242:423‑426;and Huston et al.,(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879‑5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些
抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到,且片段可以通过与完整抗体相
同的方式进行功能筛选。
链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的
二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F
(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区,从动物的循环中更快速地清除,并且可能
具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如,Wahl等人,1983,J. Nucl. Med. 24:
316)。
条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链
中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
个可变结构域的三个CDR相互作用,以限定在VH‑VL二聚体的表面上的靶结合位点。通常,六
个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而,在一些情况下,甚至单个可变结构域(或仅包含对于
靶特异性的三个CDR的Fv的一半)可以具有识别且结合靶的能力,尽管其亲和力低于整个结
合位点。
能够形成有利于靶结合的结构。
ofImmunological Methods 231:25–38)。
胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种,所
述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外,衍生物
可以含有一种或多种非天然氨基酸,例如,使用ambrx技术(参见例如,Wolfson,2006,
Chem.Biol. 13(10):1011‑2)。
竞争抑制能力的一个重要指标。
型的载体是病毒载体,其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们
被导入的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载
体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基
因组中,并由此与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导它们有效连接的基因的表
达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常,在重组DNA技
术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。然而,也包括其他形式的表达载体,如病毒载
体(例如,复制缺陷型逆转录病毒,腺病毒和腺伴随病毒),其起到等同的功能。
键。“蛋白质”可以包含一种或多种多肽。
后代都与亲本细胞相同,因为在复制过程中可能会发生突变,这类后代被包括在内。
10 、1×10 、5×10 、1×10 、5×10 、1×10 。为了克服将鼠源抗体通过CDRs移植技
术人源化带来的抗体分子结构不稳定的问题,还进一步对人源化抗人IL‑33进行了可变区
突变,以提高人源化抗体的稳定性、确保其体内生物活性。
附图说明
的限制。而且在整个附图中,用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中:
抑制。
具体实施方式
施方式所限制。相反,提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开,并且能够将本公
开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
在弗氏佐剂中乳化后进行皮下注射免疫,共三次,每次间隔2周,第三次免疫后一周尾静脉
采血,测血清的抗体效价,选取效价高的小鼠在融合前3天进行冲刺免疫。
~
上清用ELISA进行分析,筛选得到若干能够结合人白介素33的杂交瘤细胞系。通过有限稀释
法将筛选到的阳性孔单细胞化,待连续两次亚克隆的阳性都为100%时结束亚克隆,一般三
到四轮亚克隆即可达到要求,这时得到的杂交瘤细胞株只分泌一个抗体。
体的阳性杂交瘤母克隆。
闭2h;然后用PBST洗板,并甩干孔中水分。向孔板中加入20µl待测样品,室温孵育1 h。然后
用PBST洗板后每孔加入30ul 1:30000稀释的二抗羊抗鼠IgG偶联辣根过氧化物酶
(Jackson,cat#:115‑035‑164),并置于室温孵育1h。用PBST洗板,每孔加入30µl TMB显色液
(life technologies,cat#:002023),于室温孵育10 min后于酶标仪(M5e,Molecular
Device)650nm波长处检测吸光度。较高的650nM读值表明该孔中杂交瘤细胞分泌的小鼠抗
人白介素33蛋白抗体与人IL‑33蛋白的结合活性较高。部分高结合活性的小鼠抗人白介素
33蛋白抗体如图1所示。
孵育过夜;次日用PBST洗板3次,样品孔中加入200µl的含1% BSA的PBST,37℃封闭2h;然后
用PBST洗板,并甩干孔中水分。向孔板中加入50ul预孵育待测样品(biotin hIL‑33蛋白和
杂交瘤克隆上清液),室温孵育1 h。然后用PBST洗板后每孔加入50ul 1:5000稀释的二抗
StrepTactin‑HRP Conjugate(Bio‑rad, #1610380),并置于室温孵育1h。用PBST洗板,每孔
加入50µl TMB显色液(life technologies,cat#:002023),于室温孵育10 min后加入50ul/
well 2N HCl终止反应,最后于酶标仪(M5e)450nm波长处检测吸光度。能有效阻断人IL33与
人ST2结合的鼠抗如图2所示。
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix(Invitrogen,#11756050)将杂交瘤细胞总RNA反转
录成cDNA;使用简并引物和Extaq PCR试剂(Takara,#RR001A)扩增抗体轻链可变区IgVL(κ)
和重链可变区VH序列;利用胶回收试剂盒纯化PCR产物(MN,#740609);按照pMD‑19T Simple
Vector Kit(Takara)将PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞,菌株扩增、抽提
质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。获取鼠源抗体(以克隆编号命名)的可变
区序列并分析,重链可变区的氨基酸序列如表1所示(SEQ ID NO:1‑46);轻链可变区的氨基
酸序列如表2所示(SEQ ID NO:47‑92)。
开发表的人单克隆抗体κ亚类的序列。构建好的抗人IL33嵌合抗体的重链质粒和轻链质粒
比例为1:1.5配对混合,使用聚乙烯亚胺(PEIPolysciences,#24885‑2))转染HEK293细胞,
约7天后收集细胞上清,使用Mabselect纯化得到抗人IL33嵌合抗体蛋白。
分钟;然后将NTA传感器先捕获浓度为100nM的带有组氨酸标签的IL33抗原,进一步将传感
器与100nM嵌合抗体进行结合反应,之后转移至上述缓冲液中进行解离反应。实验完毕,扣
除空白亲本响应值,用软件进行1:1 Langmuir结合模式拟合,计算抗原抗体结合的动力学
常数(部分结果如表3)。表3的数据表明本发明得到的不同抗体能以高亲和力结合人IL33蛋
白。
保守三维构象的框架区域(framework region)。随后通过分析搜索已知人源抗体序列,选
择与鼠源抗体最为相似接近的人源抗体重链可变区序列,选择其抗体框架区序列作为模
板,将鼠源抗体重链CDR与人源抗体框架区结合,最终生成人源化抗体重链可变区序列。同
样过程,生成人源化抗体轻链可变区序列。随后,对可能参与抗原抗体结合的鼠源框架区个
别氨基酸位点进行回复突变,同时检查是否有一些潜在的翻译后修饰位点,如N(天冬酰胺)
糖基化位点、N脱酰胺化位点、D(天冬氨酸)异构化位点等。生成人源化抗体重链序列(版本
1,2,3)。同样过程,生成人源化抗体轻链序列(版本0,1,2……)。将设计好的人源化抗体轻
重链序列构建到哺乳动物细胞表达载体中,然后轻重链质粒使用PEI共转染HEK293细胞,使
用Mabselect纯化得到人源化抗体蛋白。人源化抗体(版本命名方式例如:重链版本0+轻链
版本0共表达,即为hz00)。人源化抗体的重链可变区及CDR区序列如表4所示;人源化抗体的
轻链可变区及CDR区序列如表5所示。
源化抗体能以高亲和力结合人IL33蛋白。
A02‑21E12 Hz01 1.62E‑09 2.62E+04 4.23E‑05
A02‑21E12 Hz02 <1.0E‑12 2.24E+04 <1.0E‑07
A02‑21E12 Hz10 <1.0E‑12 6.46E+04 <1.0E‑07
A02‑21E12 Hz11 <1.0E‑12 1.62E+04 <1.0E‑07
A02‑21E12 Hz12 <1.0E‑12 1.66E+04 <1.0E‑07
A02‑21E12 Hz21 5.03E‑10 2.68E+04 1.35E‑05
A02‑21E12 Hz22 <1.0E‑12 2.09E+04 <1.0E‑07
D02‑3P1 Hz00 1.53E‑08 1.62E+05 2.48E‑03
D02‑3P1 Hz01 5.10E‑09 1.29E+05 6.56E‑04
D02‑3P1 Hz10 1.79E‑08 1.68E+05 3.01E‑03
D02‑3P1 Hz11 7.43E‑09 1.27E+05 9.40E‑04
D02‑3P1 Hz20 1.74E‑08 1.58E+05 2.74E‑03
D02‑3P1 Hz21 4.88E‑09 1.49E+05 7.27E‑04
D02‑3P1 Hz30 1.53E‑08 1.98E+05 3.02E‑03
D02‑3P1 Hz31 6.41E‑09 1.41E+05 9.06E‑04
D02‑3P1 Hz40 1.55E‑08 2.12E+05 3.29E‑03
D02‑3P1 Hz41 8.91E‑09 1.35E+05 1.20E‑03
E01‑14O9 Hz00 1.59E‑08 1.34E+05 2.13E‑03
E01‑14O9 Hz01 1.68E‑08 1.30E+05 2.17E‑03
E01‑14O9 Hz10 6.61E‑09 1.38E+05 9.13E‑04
E01‑14O9 Hz11 6.92E‑09 1.35E+05 9.30E‑04
E01‑14O9 Hz20 1.16E‑08 2.62E+05 3.04E‑03
E01‑14O9 Hz21 1.32E‑08 2.47E+05 3.26E‑03
H02‑8F11 Hz00 3.84E‑08 3.51E+04 1.35E‑03
H02‑8F11 Hz01 1.14E‑08 3.47E+04 3.95E‑04
H02‑8F11 Hz10 4.74E‑08 3.15E+04 1.49E‑03
H02‑8F11 Hz11 1.68E‑08 3.21E+04 5.38E‑04
H22‑38E11 Hz00 2.34E‑07 3.23E+04 7.54E‑03
H22‑38E11 Hz10 9.23E‑09 3.04E+04 2.80E‑04
H22‑38E11 Hz20 1.09E‑08 2.86E+04 3.13E‑04
度抗原的进样及再生。将抗体以固定的流速注入样品通道,使其通过anti‑human IgG
antibody捕获在该通道表面。将稀释后的hIL33‑His抗原(novoprotein, #C233)依次以不
同的浓度梯度注入芯片参比通道和样品通道。使用Biacore S200分析软件(Biacore S200
Evaluation Software Version:1.1,General Electric Company)对数据进行分析。分析
所用模型为1:1binding, 最终得到抗体的结合常数Kon和解离常数Koff,以及亲和力常数
KD。结果如表7和图3所示。表7和图3的数据表明本发明得到嵌合/人源化抗IL‑33抗体能以
高亲和力结合人IL33蛋白。
xiIgG H05‑19E1 5.23E+05 2.80E‑04 5.35E‑10
xiIgG H22‑38E11 1.31E+05 3.06E‑04 2.34E‑09
xiIgG A02‑21E12 3.62E+04 4.19E‑04 1.16E‑08
A02‑21E12 Hz02 9.25E+04 2.83E‑03 3.06E‑08
A02‑21E12 Hz11 8.50E+03 4.53E‑02 5.33E‑06
A02‑21E12 Hz12 6.48E+02 3.18E‑04 4.92E‑07
A02‑21E12 Hz22 1.06E+05 3.98E‑03 3.77E‑08
RPMI1640+10%FBS培养基中,调整细胞状态至活力达95%以上。实验当日,将KU812细胞密度
调整至2000000个/mL,50μL/孔加入透明96孔板中;IL33抗体稀释至200μg/mL起始,5倍稀
释,设置8个梯度点,将各样品梯度点按50μL/孔加入上述铺有细胞的透明96孔板中,37℃孵
育30分钟;将IL33蛋白稀释至60ng/mL,按50μL/孔加入上述铺有细胞和抗体的透明96孔板
中,37℃继续孵育48小时;取上述细胞培养液100μL/孔进行ELISA测试,使用IL‑5 Duoset
ELISA(R&D)试剂盒检测,OD值使用MD酶标仪读取,最后使用Prism软件进行四参数拟合得到
样品IC50值。结果见表8和图4。表8和图4的结果表明本发明得到的嵌合/人源化抗IL‑33抗
体能以剂量依赖的方式在体外阻断人IL33介导的KU812细胞中IL‑5的释放。
H05‑19E1 xiIgG 22.18
A02‑21E12 xiIgG 149.2
A02‑21E12 Hz10 N/A
A02‑21E12 Hz11 N/A
A02‑21E12 Hz12 N/A
H02‑8F11 xiIgG 23.62
H02‑8F11Hz00 36.77
H02‑8F11Hz01 32.46
H02‑8F11Hz10 50.80
H02‑8F11Hz11 25.99
H22‑38E11 xiIgG 20.17
H22‑38E11 Hz00 4.560
H22‑38E11 Hz10 5.260
H22‑38E11 Hz20 8.920
都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范
围为准。