一种毛竹寡核苷酸探针及其获得方法和使用方法转让专利
申请号 : CN202110286122.1
文献号 : CN112980833B
文献日 : 2022-05-06
发明人 : 徐川梅 , 黄坚钦 , 王子含 , 金旭胤
申请人 : 浙江农林大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种毛竹寡核苷酸探针组,其特征在于,其包括9种探针,9种探针的核苷酸序列如下:
探针Oligo MZ‑DL‑3,如SEQ ID NO:1所示:TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG;
探针Oligo MZ‑5S‑1,如SEQ ID NO:2所示:ATGGAGAGCATGAGGTTGGGGACGGAGGGGAGTTAAGGGG;
探针Oligo Ba‑14,如SEQ ID NO:3所示:TCAACAAGGGGGAGGTCTGAGCGGCTAAGATCTCCAGAGAGGAGGTCCTAACG;
探针Oligo MZ‑CL22‑1,如SEQ ID NO:4所示:AATAATTCCGAGCAGGTGTGAAACTTTCCAGAACGA;
探针Oligo MZ‑CL22‑2,如SEQ ID NO:5所示:TATGAAATCGAGGCACGGAAAGAAAATCAACACCAAACAC;
探针Oligo Ba‑131X‑1,如SEQ ID NO:6所示:GTAGGGCACACTAGAAGTCCATTATGGGTGTTTGGTATTGATTTTCTTTCCGTGCCTC;
探针Oligo Ba‑131X‑2,如SEQ ID NO:7所示:GATTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACGCGTCGTTCTGGAAAGTTTCACACCGGCTCGG;
探针Oligo Ba‑131X‑3,如SEQ ID NO:8所示:AAAGATTCCAAATGCACCTAGAAATGACTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACCCGT;
探针Oligo Ba‑131X‑4,如SEQ ID NO:9所示:CGTTCTGGAAAGTTTCACACCTGCTCGGAATTATTCCAAATGCACCTAGAAATGAC。
2.根据权利要求1所述的毛竹寡核苷酸探针组,其特征在于,每条探针5'端均标记荧光基团。
说明书 :
一种毛竹寡核苷酸探针及其获得方法和使用方法
技术领域
背景技术
化及山地造林的重要植物。据不完全统计,全世界约25亿人经济来源依靠竹类植物,竹类植
物贸易总额,每年约25亿美元。
(palaeotropical woody bamboos)和草本竹种(tribe Olyreae)四种类型,其中温带木本
竹种染色体数目为2n=46‑48,新热带木本竹种染色体数目为2n=40‑48,古热带木本竹种
染色体数目为2n=70‑72,草本竹种染色体数目为2n=22‑24。根据一些竹种的染色体数目
表现,一些研究者推测,竹类植物染色体基数为X=12,其中温带木本竹种(2n=46‑48)和新
热带木本竹种(2n=40‑48)为4倍体,古热带木本竹种(2n=70‑72)为6倍体。后来一些研究
者发现还有一些竹种染色体数目为2n=64;96及104,如果以染色体基数为X=12推算,染色
体数目为2n=64及104的竹种倍性无法确定,因此推测竹类植物染色体基数可能为X=8,而
不是X=12。
倍体竹种Guadua angustifolia(2n=4x=46)和一个六倍体竹种Bonia amplexicaulis(2n
=6x=72)3种不同倍性的竹种进行了测序分析,根据这些竹种的基因组测序数据,对竹类
植物基因组演化历史进行了揭示,推测大约在4.2亿年前,木本竹种从草本竹种中分化出
来,并快速形成A、B、C、D四个不同的亚基因组,在后期进化过程中,B基因组与C基因组竹种
杂交产生了基因组类型为BBCC的新热带木本竹种,C基因组与D基因组竹种杂交,形成了基
因组为CCDD的温带木本竹种,后来又经过漫长的进化,A基因组竹种与基因组为BBCC的新热
带木本竹种杂交,形成了染色体组类型为AABBCC的异源六倍体热带木本竹种。毛竹染色体
数目为2n=48,为温带木本竹种,根据上面分子系统学研究结果,其基因组类型应为CCDD,
但毛竹(Phyllostachys edulis(Carrière)J.Houz.)测序结果显示,其是一个二倍体竹种,
与以上染色体组分类系统不完全吻合。在整个竹类植物中,温带木本竹种在数量上占有绝
对优势,这些温带木本竹种在基因组类型上是否存在差异?另外,竹类植物是一种兼性生殖
植物,即可通过有性生殖繁殖后代,也可通过无性生殖扩大群体,这种特殊的繁殖方式为竹
类植物保存各种遗传变异提供了良好的条件。竹类植物中目前存在着大量的变种及变型,
这些变种及变型间在染色体结构上是否存在差异?目前仅靠少数几个竹种的测序结果还无
法对这些问题进行有效揭示。
型及外源染色体等进行精细分析和鉴定。利用荧光原位杂交技术分析植物染色体的前提条
件是有合适和充足的荧光探针,也即染色体物理标记。然而,目前竹类植物染色体物理标记
非常匮乏,除了45S rDNA外,几乎没有可用的染色体物理标记,目前仅有45S rDNA在毛竹、
斑竹(Phyllostachys bambusoides f.lacrima‑deae)、龟甲竹(Phyllostachys
heterocycla(Carr.)Mitford)、茶秆竹(Pseudoasa amabilis var.amabilis)、菲白竹
(Sasa fortunei)、日本矮竹(Sasa pygmea)、铺地竹(Sasa argenteastriatus)及白绿竹
(Bambusa oldhamii(W))等8个竹种染色体上的分布特点的报道,大部分竹种的细胞遗传学
工作还停留在染色体计数或传统的核型分析等初级细胞遗传学研究水平,这些研究仅能揭
示竹类植物染色体数目及形态大小等信息,并不能对竹类植物染色体组类型及染色体结构
变异等进行有效分析。竹类植物属于小染色体物种,染色体数目不仅多,而且染色体形态非
常小,有些染色体甚至呈点状,部分染色体个体在形态及大小上也非常相似,因此如果没有
相应的染色体物理标记作辅助,很难对竹类植物染色体结构变异及染色体组类型等进行精
细分析和鉴定。可以说竹类植物染色体物理标记缺乏已成为制约竹类植物细胞遗传学发展
的技术瓶颈。
另外,与传统的BAC‑FISH技术相比,寡核苷酸荧光原位杂交技术省去了质粒DNA扩繁、提取
及探针标记等繁琐步骤,而且实验更加简化和高效。目前毛竹全基因组测序工作已经完成,
其基因组大小约2.05Gb,其中转座元件类型的重复序列约占整个基因组的59%,显示毛竹
重复序列寡核苷酸探针具有很大的开发空间。
发明内容
色体物理标记为零的空白;并应用新设计的寡核苷酸探针对包括毛竹在内的18个竹种基因
组进行分析,建立毛竹及其近缘种龟甲竹、花毛竹、黄竿乌哺竹、斑竹、高节竹、紫竹、四季
竹、金镶玉竹、白哺鸡竹及雷竹等11个竹种的高清FISH核型。
息学分析设计获得:登录(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6204424/#
sup1)网站,下载毛竹测序数据,然后利用CD‑HIT Suite(http://weizhong‑lab.ucsd.edu/
cdhit_suite/cgi‑bin/index.cgi?cmd=cd‑hit)、DNAMAN(http://www.lynnon.com)和
RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org/)寻找全部重复序列,按照period size(>
4),copy number(>100),period size×copy number>3000条件筛选出有效重复序列,按拷
贝数从多到少排列,从中设计了80条寡核苷酸序列,合成相应的寡核苷酸探针,然后利用毛
竹中期染色体制片对这80条探针进行荧光原位杂交筛选,发现Oligo Ba‑14,Oligo MZ‑
CL22‑1,Oligo MZ‑CL22‑2,Oligo Ba‑131X‑1,Oligo Ba‑131X‑2,Oligo Ba‑131X‑3及Oligo
Ba‑131X‑4均可在毛竹染色体上产生荧光信号;
分析结果,设计出一定数量的寡核苷酸探针,然后利用毛竹中期染色体与所设计的探针进
行荧光原位杂交分析,发现Oligo MZ‑5S‑1在毛竹染色体上有荧光信号,之后利用5S rDNA
进行定位分析,Oligo MZ‑5S‑1与5S rDNA信号重叠;
别放入2.5%纤维素酶和果胶酶混合液中,37℃酶解1.5h,酶解结束后,吸去酶液,之后分别
用预冷的TE缓冲液和无水乙醇各处理3次,每次5min,无水乙醇处理结束后,吸去无水乙醇,
加入适量的固定液即乙酸:乙醇按体积比9:1配制,用镊子将根尖夹碎,制备成细胞悬浮液,
进行染色体滴片,每张载玻片滴加7μl细胞悬浮液,让细胞悬浮液在载玻片上缓慢散开,再
于空气中气干染色体制片,利用相差显微镜对染色体制片进行观察和筛选,筛选出优质的
染色体制片,用于后续荧光原位杂交实验;
片,加入4%多聚甲醛,盖上盖玻片,于室温下处理10min,最后取下盖玻片于70%v/v、90%
v/v及100%v/v的乙醇进行梯度脱水,每级酒精处理5min,脱水结束后,气干;
染色体制片;
0.6μl、66.7ng/μl Oligo探针1.0‑4.0μl,余量ddH2O,总体系18.0μl;杂交液在离心管内混
匀后在100℃变性13min,然后将离心管立即置于‑20℃的无水乙醇中冷却10‑15min;
5min;将染色体制片沥干,在每张染色体制片上加含0.5μg/mL DAPI的DAPI缓冲液500μl染
色10‑15min,用DAPI缓冲液冲洗4‑5次,吹干染色体制片,滴12μl防荧光淬灭封片剂,盖上盖
玻片,用荧光显微镜照相获取荧光原位杂交图片。
探针。然后利用新开发的寡核苷酸探针对毛竹及其17个近缘竹属竹种的染色体组进行分
析,构建毛竹及其近缘种的高清FISH核型,目的是建立经济高效且通用性强的毛竹细胞学
标记设计技术与染色体识别技术,丰富竹类植物染色体标记,从细胞遗传学角度分析毛竹
及其近缘野生种的基因组类型,同时对一些竹种染色体结构变异进行鉴定。
与其近缘野生种基因组、染色体及染色体结构变异奠定了技术基础,为竹类植物相关的分
子细胞遗传学研究开辟了新的研究领域。
附图说明
Oligo Ba‑131X‑1、Oligo Ba‑131X‑3及Oligo Ba‑131X‑4,a2,b2及c2绿色信号均为Oligo
Ba‑131X‑2,a3,b3及c3黄色信号分别为Oligo Ba‑131X‑1、Oligo Ba‑131X‑3及Oligo Ba‑
131X‑4与Oligo Ba‑131X‑2荧光共定位结果。
同,与Oligo Ba‑131X‑1、Oligo Ba‑131X‑2及Oligo Ba‑131X‑3序列相比,Oligo Ba‑131X‑4
产生发荧光信号略弱。
CL22‑2(红色)在毛竹染色体上的分布,d3为Oligo MZ‑CL22‑1和Oligo MZ‑CL22‑2在毛竹染
色体上共定位结果。e1和e2分别为Oligo MZ‑CL22‑1(红色)和Oligo Ba‑131X‑2(绿色)在毛
竹染色体上的分布,e3为Oligo MZ‑CL22‑1(红色)和Oligo Ba‑131X‑2(绿色)在毛竹染色体
上共定位结果。f1和f2分别为Oligo MZ‑5S‑1(红色)和5S rDNA(绿色)在毛竹染色体上的分
布,f3为Oligo MZ‑5S‑1(红色)和5S rDNA(绿色)在毛竹染色体上共定位结果。f4和f5分别
为Oligo MZ‑5S‑1(红色)和5S rDNA(绿色)在雷竹染色体上的分布,f6为Oligo MZ‑5S‑1(红
色)和5S rDNA(绿色)在雷竹染色体上共定位结果。
染色体上的分布位置和模式也完全相同。另外寡核苷酸探针Oligo MZ‑5S‑1产生的荧光与
5S rDNA也完全共定位。
色体上的分布,g1为红色荧光通道所拍摄的Oligo Ba‑14信号。
(红色)在黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、龟甲竹、花毛竹和高节竹染色体上的分布情况,h7
为Oligo MZ‑CL22‑1(绿色)在雷竹染色体上的分布情况。
染色体上均有荧光信号存在。
为45SrDNA信号,I2和I4为信号与染色体叠加图。
竹、黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、花毛竹、高节竹及雷竹等竹种分布模式不同,Oligo MZ‑
CL22‑1在紫竹染色体上有2种分布模式,第一种模式其48条染色体中,有11条染色体没有
Oligo MZ‑CL22‑1信号,另外还有一条染色体Oligo MZ‑CL22‑1信号非常微弱,如I1和I2箭
头所示,其余36条染色体均有较强的Oligo MZ‑CL22‑1信号分布(I1‑I2),第二种分布模式
中,其48条染色体中有36条染色体具有Oligo MZ‑CL22‑1信号分布,另外12条染色体没有任
何Oligo MZ‑CL22‑1信号(I3‑I4)。另外,紫竹染色体上有2个45S rDNA(绿色),其中一个
45SrDNA位点信号较强,另外一个位点非常微弱,有时甚至检测不到。
45SrDNA(绿色)在京竹染色体上的分布,J4‑J6分别为Oligo MZ‑CL22‑1(红色)及Oligo MZ‑
5S‑1(绿色)在金镶玉竹种染色体上的分布,J7‑J8分别为Oligo MZ‑CL22‑1(红色)及
45SrDNA(绿色)在四季竹染色体上的分布。
还有2条染色体仅有微弱的Oligo MZ‑CL22‑1信号(图J1‑J2,标号11和12的染色体),其余36
条染色体均有较强的Oligo MZ‑CL22‑1信号,第二种分布模式中,京竹48条染色体中,有12
条染色体完全没有Oligo MZ‑CL22‑1信号,另外36条染色体均有较强的Oligo MZ‑CL22‑1信
号(图J3)。Oligo MZ‑CL22‑1在金镶玉竹种染色体上的分情况与京竹第二种分布模式较为
相似,48条染色体中,有12条没有任何荧光信号,另外36条染色体均具有Oligo MZ‑CL22‑1
信号(图J4),另外,Oligo MZ‑5S‑1在金镶玉竹种中有3个位点,其中两个位点位于一对染色
体中间,另外一个位点位于染色体端部。位于染色体臂中间的两个位点在信号强度上存在
极大差异,其中一个信号较强,另外一个位点信号极弱,几乎检测不到(图J5‑J6箭头所示)。
Oligo MZ‑CL22‑1在四季竹上的分布模式非常特殊,48条染色体中,24条染色体具有Oligo
MZ‑CL22‑1信号,另外24条染色体没有任何Oligo MZ‑CL22‑1信号(J7‑J8)。另外,45SrDNA
(绿色)在四季竹染色体上有2个位点分布,两条具有45SrDNA的染色体中,一条染色体具有
Oligo MZ‑CL22‑1信号,另一条却没有Oligo MZ‑CL22‑1信号,如图J8箭头所示。
DL‑3在这9个竹种染色体上均可产生荧光信号,基本上位于染色体端部,不同竹种在荧光强
度上存在一定差异,其中Oligo MZ‑DL‑3在唐竹、四季竹及白哺鸡竹3个竹种上的荧光强度
较强,在斑竹、金镶玉、龟甲竹染色体上的信号较弱。
高清FISH核型图。
具体实施方式
suite/cgi‑bin/index.cgi?cmd=cd‑hit)、DNAMAN(http://www.lynnon.com)和
RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org/)寻找全部重复序列,按照period size(>
4),copy number(>100),period size×copy number>3000条件筛选出有效重复序列,按拷
贝数从多到少排列,从中设计了80条寡核苷酸序列,合成相应的寡核苷酸探针,然后利用毛
竹中期染色体制片对这80条荧光探针进行荧光原位杂交筛选,发现Oligo MZ‑CL22‑1,
Oligo MZ‑CL22‑2,Oligo Ba‑131X‑1,Oligo Ba‑131X‑2,Oligo Ba‑131X‑3,Oligo Ba‑
131X‑4及Oligo Ba‑14均可在毛竹染色体上产生荧光信号,其中Oligo MZ‑CL22‑1,Oligo
MZ‑CL22‑2,Oligo Ba‑131X‑1,Oligo Ba‑131X‑2,Oligo Ba‑131X‑3及Oligo Ba‑131X‑4在
毛竹染色体上分布模式非常相似,均分布在每一条染色体的近着丝粒处。Oligo MZ‑CL22‑1
与Oligo MZ‑CL22‑2来源于同一重复序列单元的不同区段序列,通过双色FISH证实,Oligo
MZ‑CL22‑1与Oligo MZ‑CL22‑2在毛竹染色体上的分布位置完全重叠(图2,d1‑d3),这两个
探针可以作为一个探针使用,同时使用会使荧光信号增强。Oligo Ba‑131X‑1,Oligo Ba‑
131X‑2、Oligo Ba‑131X‑3,及Oligo Ba‑131X‑4这4段寡核苷酸序列是由一条较长的重复序
列单元截成4个区段而获得,通过双色FISH证实,这4段序列在毛竹的分布位置也完全重叠
(图1,a1‑c3),这4个探针可以作为一个探针使用,同时使用会使荧光信号增强。之后选用
Oligo MZ‑CL22‑1和Oligo Ba‑131X‑2再次进行双色FISH,结果证实这两个探针在毛竹染色
体上的分布位置也完全重叠(图2,e1‑e3)。Oligo Ba‑14在毛竹染色体上呈现弥散状分布,
其中有4条染色体具有很强的端部信号,另外还有两条染色体着丝粒区域具有很强的荧光
信号,还有一对染色体几乎整个染色体臂均具有很强的荧光信号(图3,g1‑g2,箭头所示)。
Oligo MZ‑5S‑1是利用毛竹基因组DNA序列与小麦5S rDNA序列(GenBank:M10470.1)进行比
对分析,根据分析结果,截取同源序列上的一段,设计出一定数量的寡核苷酸探针,然后利
用毛竹中期染色体与所设计的探针进行荧光原位杂交分析,发现Oligo MZ‑5S‑1在毛竹染
色体上有荧光信号,之后利用5S rDNA进行定位分析,Oligo MZ‑5S‑1与5S rDNA信号重叠
(图2,f1‑f3),且在龟甲竹、花毛竹及雷竹(图2,f4‑f6)等竹种上均可产生荧光信号。MZ‑DL‑
3是截取端粒重复序列上的一段获得,定位后发现其在毛竹染色体端部产生荧光信号(图3,
g3)。所获探针如下(5'端标记了荧光基团,但所标记荧光基团并不限于此):
131X‑4功能相同,从其中选择了Oligo MZ‑CL22‑1),Oligo MZ‑DL‑3及Oligo MZ‑5S‑1寡核
苷酸探针对毛竹及其近缘竹属竹种进行了分析,所用探针浓度均为66.7ng/μl。
别放入2.5%纤维素酶和果胶酶的混合液中,37℃酶解1.5h,酶解结束后,吸去酶液,之后分
别用预冷的TE缓冲液和无水乙醇各处理3次,每次5min,无水乙醇处理结束后,吸去无水乙
醇,加入适量的固定液(乙酸:乙醇按体积比9:1配制),用镊子将根尖夹碎,制备成细胞悬浮
液,进行染色体滴片,每张载玻片滴加7μl细胞悬浮液,让细胞悬浮液在载玻片上缓慢散开,
再于空气中气干染色体制片,利用相差显微镜对染色体制片进行观察和筛选,筛选出优质
的染色体制片,用于后续荧光原位杂交实验。
片,加入4%多聚甲醛,盖上盖玻片,于室温下处理10min,最后取下盖玻片于70%v/v、90%
v/v及100%v/v的乙醇进行梯度脱水,每级酒精处理5min,脱水结束后,气干。
染色体制片。
鱼精DNA 0.6μl、Oligo探针1.2μl和ddH2O 3.0μl;杂交液在离心管内混匀后在100℃变性
13min,然后将离心管立即置于‑20℃的无水乙醇中冷却10‑15min;
5min;将染色体制片沥干,在每张染色体制片上加含0.5μg/mL DAPI的DAPI缓冲液500μl,染
色10‑15min,用DAPI缓冲液冲洗4‑5次,吹干染色体制片,滴12μl防荧光淬灭封片剂,盖上盖
玻片,用荧光显微镜照相获取荧光原位杂交图片(图4‑图7)。从图4可以看出,Oligo MZ‑
CL22‑1在黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、龟甲竹、花毛竹、高节竹和雷竹7个竹种的每一条
染色体近着丝粒区域均可产生荧光信号,且信号分布模式与毛竹相似。Oligo MZ‑CL22‑1在
紫竹、金镶玉竹、京竹及四季竹4个竹种染色体上也可产生清晰的荧光信号,但是其荧光信
号分布模式与毛竹、黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、龟甲竹、花毛竹、高节竹及雷竹情况不
同,Oligo MZ‑CL22‑1在紫竹染色体上有2种分布模式,第一种模式如I1和I2所示,48条染色
体中,有37条染色体具有Oligo MZ‑CL22‑1信号(红色信号),其中有36条染色体信号清晰可
见,另外1条染色体Oligo MZ‑CL22‑1信号非常微弱,几乎检测不出来,如I1和I2图中箭头所
示,另外还有11条染色体完全没有信号(图5);第二种分布模式如I3和I4所示,有36条染色
体具有明显的Oligo MZ‑CL22‑1信号,另外12条染色体完全没有Oligo MZ‑CL22‑1信号(图
5),另外,由图5还可以看出,45S rDNA在紫竹同源染色体上存在明显差异,其中一条染色体
的45S rDNA信号较强,而另外一条染色体的45S rDNA信号极弱,有时甚至检测不到,如图5,
I4箭头所示,这一结果暗示着紫竹其中一条染色体在45S rDNA区域发生过染色体片段的缺
失。Oligo MZ‑CL22‑1在京竹染色体上分布模式与紫竹相似,也存在2种分布模式,第一种分
布模式中,有38条染色体具有Oligo MZ‑CL22‑1信号,其中36条染色体的Oligo MZ‑CL22‑1
信号较强,另外还有1对染色体信号极弱,几乎检测不到,另外有10条染色体完全没有信号
(图6,J1‑J2);第二种分布模式中,有36条染色体具有较强的Oligo MZ‑CL22‑1信号,另外12
条染色体完全没有Oligo MZ‑CL22‑1信号(图6,J3)。Oligo MZ‑CL22‑1在金镶玉竹种上有一
种分布模式,其48条染色体中有36条染色体具有清晰的Oligo MZ‑CL22‑1信号,另外12条染
色体完全没有Oligo MZ‑CL22‑1信号(图6,J4)。图6,J5‑J6是利用Oligo MZ‑5S‑1和Oligo
MZ‑CL22‑1对金镶玉竹种进行双色FISH分析,可以看出Oligo MZ‑5S‑1在金镶玉竹种上有3
个位点,其中2个位点位于一对同源染色体上,另外一个位点单独位于染色体臂末端,位于
同源染色体上的两个Oligo MZ‑5S‑1信号在强度上存在很大差异,1个信号强度较强,另外
一个非常微弱,几乎检测不到,如图6,J5‑J6箭头所示(图6),这一结果暗示着金镶玉竹种在
这一区域可能发生过DNA片段缺失或插入等遗传变异。J7‑J8是Oligo MZ‑CL22‑1及45S
rDNA在四季竹染色体上的分布情况,可以看出,其48条染染色体中,其中24条具有Oligo
MZ‑CL22‑1信号,另外24条染色体完全没有Oligo MZ‑CL22‑1信号(图6)。K1‑K6分别为Oligo
MZ‑CL22‑1在茶杆竹、大明竹、橄榄竹、摆竹、苦竹及唐竹染色体上的分布,可以看出Oligo
MZ‑CL22‑1在这6个竹种染色体上没有任何信号(图7)。根据OligoMZ‑CL22‑1在18种不同竹
种上的分布结果,我们可以初步确定竹类植物染色体基数为X=12,18个竹种在染色体组类
型上可初步分成4类:第一类主要包括刚竹属的毛竹、花毛竹、斑竹、高节竹、黄竿乌哺鸡竹、
白哺鸡竹、雷竹及龟甲竹,这8个竹种具有相同的染色体组类型,第二类主要包括刚竹属的
紫竹、金镶玉竹及京竹,这3个竹种的染色体组类型与毛竹等竹种大部分相同,另外可能增
加了1套其他类型的染色体组。第三类主要为四季竹,我们推测四季竹为异源四倍体,有2个
不同的染色体组,其中1套染色体组与毛竹等竹种其中的1套染色体组相同,另外一套染色
体组未知。第四类主要包括茶杆竹、大明竹、橄榄竹、摆竹、苦竹及唐竹,这6个竹种在染色体
组类型上与毛竹等竹种没有重叠,属于完全不同的基因组类型。以上结果说明本发明可以
初步分析和识别不同竹种的染色体组。
DL‑3在这9个竹种染色体上均可产生荧光信号,基本上位于染色体端部,不同竹种在荧光强
度上存在一定差异,其中Oligo MZ‑DL‑3在唐竹、四季竹及白哺鸡竹3个竹种上的荧光强度
较强,在斑竹、金镶玉竹、龟甲竹染色体上的信号较弱,这些结果说明,这些竹种染色体端粒
序列在拷贝数上存在一定差异。另外,在黄竿乌哺鸡竹一些染色体着丝粒部位也观察到了
Oligo MZ‑DL‑3信号,说明这几条染色体发生断裂及重接过程,导致端粒信号在着丝粒部位
出现。
竹、高节竹、紫竹、四季竹、金镶玉竹、白哺鸡竹及雷竹等11个竹种的高清FISH核型(图9),从
图9可以看出,根据Oligo MZ‑CL22‑1及45S rDNA等探针信号分布模式,进一步提高了这些
竹种的染色体核型配对准确性,并且可以看出,四季竹第3对染色体具有45S rDNA信号,但
是这一对同源染色体中,其中一条近端部具有Oligo MZ‑CL22‑1荧光信号,另外一条却没有
Oligo MZ‑CL22‑1荧光信号,说明其中一条染色体染色体片段在结构上发生过遗传变异,显
示出本发明可以用于染色体结构变异识别。
包含在本发明的保护范围之内。