一种水稻糖诱导启动子SRN1及其应用

摘要

本发明公开了一种水稻糖诱导启动子SRN1及其应用。属于基因工程技术领域。水稻糖诱导启动子SRN1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。启动子SRN1属于一种受蔗糖、葡萄糖诱导的组织特异性启动子，在植物基因工程领域以及研究生物体内糖信号分子的传导机制具有重要的应用价值。启动子SRN1为水稻或其他粮食作物重要农艺性状和应对逆境胁迫的基因工程育种提供了定向表达基因的工具，同时也可用于科研上指示植物体内可溶性糖的水平。

权利要求

1.一种水稻糖诱导启动子SRN1，其特征在于，所述水稻糖诱导启动子SRN1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

2.如权利要求1所述的一种水稻糖诱导启动子SRN1，其特征在于，所述糖为蔗糖或葡萄糖。

3.用于扩增启动子SRN1的引物对，其特征在于，核苷酸序列如下：SRN1proF1：tctctagaactagtggatccatggcgatgacaccgcagct；SEQIDNo.2；

SRN1proR1：ataagcttgatatcgaattcctagccaccatggtttct；SEQIDNo.3。

4.含有权利要求1所述启动子SRN1核苷酸序列的重组载体或重组菌。

5.权利要求1所述的启动子SRN1在受糖诱导高效启动目标基因表达中的应用，其中，所述糖为蔗糖或葡萄糖。

说明书

一种水稻糖诱导启动子SRN1及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种水稻糖诱导启动子SRN1及其应用。

背景技术

[0002] 作物重要农艺性状和应对逆境胁迫的调控基因表达是植物基因工程的研究重点之一，而启动子作为调控基因表达的重要调控序列，是植物基因工程的研究热点。诱导型启
动子在某些物理或化学信号的刺激下，可以大幅度提高或抑制驱动基因的转录水平。诱导
型启动子往往带有增强子、沉默子等序列结构，且一部分该类型启动子呈现组织特异性表
达或节律表达。

[0003] 根据诱导条件的不同，诱导型启动子可分为光诱导型启动子、温度诱导型启动子、激素诱导型启动子、创伤诱导型启动子和微生物诱导型启动子等。在生活中，糖是一种经济
且常见的物质，且对于植物来说，糖是可以通过光合作用来大量合成的基本物质。所以糖诱
导型启动子，尤其是蔗糖或葡萄糖诱导型启动子来作为基因工程载体的调控元件具有方便
且高效的特点。糖诱导型启动子在植物基因工程上的广泛利用，将极大推动对作物农艺性
状和应对逆境胁迫的遗传改良。

[0004] 在植物中关于糖诱导的启动子的研究主要集中在蔗糖、淀粉等的合成、转运以及代谢基因等。然而，高效的蔗糖诱导型启动子的核酸序列一直没有被发现。因此，对于能够
在植物中尤其是水稻等粮食作物中发挥重要作用的糖诱导型启动子的需求十分紧迫。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种水稻糖诱导启动子SRN1及其应用。该启动子能够驱动目的基因在蔗糖、葡萄糖的诱导条件下在植物中表达。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 一种水稻糖诱导启动子SRN1，核苷酸序列如下：

[0008] tggatatatatcttcctatatattattctctttgtctataactatatactatttgtcatgaaactttgtttctctttttttcttttcttgattgtttaaataaaaaaaaaacttaatagggttggattttttttggggaaaatg
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aatacccacccaattgatccatcaatttccc；SEQ ID No.1。

[0009] 进一步的，所述糖为蔗糖或葡萄糖。

[0010] 用于扩增启动子SRN1的引物对，核苷酸序列如下：

[0011] SRN1pro F1：tctctagaactagtggatccatggcgatgacaccgcagct；SEQ ID No.2；

[0012] SRN1pro R1：ataagcttgatatcgaattcctagccaccatggtttct；SEQ ID No.3。

[0013] 含有上述启动子SRN1核苷酸序列的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

[0014] 进一步的，含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的启动子SRN1的报告基因为LUC的表达载体proSRN1::LUC，其核苷酸序列如下：

[0015] tggatatatatcttcctatatattattctctttgtctataactatatactatttgtcatgaaactttgtttctctttttttcttttcttgattgtttaaataaaaaaaaaacttaatagggttggattttttttggggaaaatg
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gtgggtcactgtactattttaacgaataataaaatcaggtataggtaactaaacgga；SEQ ID No.4。

[0016] 进一步的，含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的启动子SRN1的报告基因为GFP的表达载体proSRN::SRN1‑GFP，其核苷酸序列如下：

[0017] tggatatatatcttcctatatattattctctttgtctataactatatactatttgtcatgaaactttgtttctctttttttcttttcttgattgtttaaataaaaaaaaaacttaatagggttggattttttttggggaaaatg
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gtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa；SEQ ID No.5。

[0018] 启动子SRN1在受糖诱导高效启动目标基因表达中的应用。

[0019] 进一步的，启动子SRN1在转基因水稻叶片中可以驱动目的基因在转录水平和蛋白水平的检测。

[0020] 进一步的，启动子SRN1驱动GFP蛋白在转基因水稻根细胞中的光学检测。

[0021] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：启动子SRN1属于一种受蔗糖、葡萄糖诱导的组织特异性启动子，在植物基因工程领域以及研究生
物体内糖信号分子的传导机制具有重要的应用价值。启动子SRN1为水稻或其他粮食作物重
要农艺性状和应对逆境胁迫的基因工程育种提供了定向表达基因的工具，同时也可用于科
研上指示植物体内可溶性糖的水平。

附图说明

[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图获得其他的附图。

[0023] 图1附图为本发明实施例1中水稻启动子SRN1中顺式作用元件功能注释；

[0024] 图2附图为本发明实施例2中工程载体pCAMBIA1300图谱；

[0025] 图3附图为本发明实施例3中转基因植株根尖细胞响应蔗糖和葡萄糖表达；

[0026] 图4附图为本发明实施例4中SRN1基因在转录水平和翻译水平响应蔗糖和葡萄糖的诱导；其中A为相对转录水平图，B为SRN1‑GFP相对表达量图，C为Western blot检测结果；

[0027] 图5附图为本发明实施例5中叶片中SRN1基因响应组织内糖的水平表达以及在不同糖处理下，利用多功能酶标仪测定LUC活性指数；其中A为组织内糖的水平表达，B为荧光
素相对量，C为Western blot检测结果。

具体实施方式

[0028] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029] 本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

[0030] 实施例1：水稻启动子SRN1序列分析

[0031] 利 用 植 物 启 动 子 预 测 分 析 网 站 P l a n t C A R E ( h t t p : / /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)和New PLACE(https://
www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)对SRN基因2000bp的启动子区域(即启动子SRN1)进行顺式
作用元件分析和整理，结果见图1和表1。

[0032] 表1水稻启动子SRN1中顺式作用元件序列信息注释

[0033]

[0034]

[0035] 由图1和表1可知，SRN基因2000bp的启动子区域(即启动子SRN1)存在着参与8种响应表达的14种顺式作用元件，74％的顺式作用元件参加的糖响应和光响应过程。由于植物
体内糖的含量和光照状态存在极大的相关性，以上这些结果说明启动子SRN1(即SRN1基因)
可能受糖诱导表达并参与糖信号相关的生物学过程。

[0036] 实施例2：水稻proSRN1::SRN1‑GFP重组载体的构建以及转化

[0037] (1)利用CTAB法提取的水稻Nip基因组DNA。

[0038] (2)利用水稻Nip cDNA作为扩增SRN基因编码序列的模板，引物序列如下：

[0039] SRN F:tcaccaaatccctgcaagaaatggtgagcaagggcgaggag；SEQ ID No.6；

[0040] SRN R:ctgtacatggtagatcttgcgaagatctaccatgtacagctcgt；SEQ ID No.7。

[0041] (3)根据RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)网站上查到的SRN基因转录起始位点ATG上游2000bp序列，设计启动子SRN1引物。使用高保真酶KOD FX扩增启动子
SRN1，引物序列如下：

[0042] SRN1pro F1：tctctagaactagtggatccatggcgatgacaccgcagct；SEQ ID No.2；

[0043] SRN1pro R1：ataagcttgatatcgaattcctagccaccatggtttct；SEQ ID No.3。

[0044] (4)利用GFP载体用作扩增GFP基因编码序列的模板。通过高保真酶KOD FX扩增GFP基因编码序列，引物序列如下：

[0045] GFP F1:tcaccaaatccctgcaagaaatggtgagcaagggcgaggag；SEQ ID No.8；

[0046] GFP R1:ctgtacatggtagatcttgcgaagatctaccatgtacagctcgt；SEQ ID No.9。

[0047] (5)最后通过同源重组的方法与KpnI和BamHI酶切处理后pCAMBIA1300(其图谱如图2所示)连接，将连接产物转化到感受态细胞中，涂布在相应抗性的LB固体平板上，菌落
PCR鉴定筛选阳性工程菌，提取质粒进行测序验证。最终成功构建了proSRN1::SRN1‑GFP重
组载体，序列如SEQ ID No.5所示。并通过农杆菌介导法转化进入日本晴水稻的愈伤组织
中，并获得阳性的转化苗。

[0048] 实施例3：荧光显微镜下观察糖诱导水稻SRN1基因(启动子SRN1)表达

[0049] pro35s::GFP的构建方法如下：

[0050] (1)根据NCBI(http://https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF234297/)网站上查到的35s启动子序列，设计启动子35s引物。使用高保真酶KOD FX扩增启动子35S，引
物序列如下：

[0051] 35s pro F：acgaattcgagctcggtacccatggagtcaaagattcaa；SEQ ID No.10；

[0052] 35s pro R：agtcccccgtgttctctccaaatgaa；SEQ ID No.11。

[0053] (2)利用GFP载体用作扩增GFP基因编码序列的模板。通过高保真酶KOD FX扩增GFP基因编码序列，引物序列如下：

[0054] GFP F2:agtcccccgtgttctctatgacaccgcagcta；SEQ ID No.12；

[0055] GFP R2:ctgtacatggtagatcttgcgaagatctaccatgtacagctc；SEQ ID No.13。

[0056] (3)最后通过同源重组的方法与KpnI和BamHI酶切处理后pCAMBIA1300(其图谱如图2所示)连接，将连接产物转化到感受态细胞中，涂布在相应抗性的LB固体平板上，菌落
PCR鉴定筛选阳性工程菌，提取质粒进行测序验证。最终成功构建了pro35s::GFP重组载体，
序列如SEQ ID No.14所示。并通过农杆菌介导法转化进入日本晴水稻的愈伤组织中，并获
得阳性的转化苗。

[0057] catggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaa
aaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctc
ctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgcc
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caccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaac
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gccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcga
ggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgac
aaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagt
tcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa；SEQ ID No.14。

[0058] 将在光照培养箱(水稻全营养液(具体配方参照国际水稻所推荐的水稻营养液配方)，28℃，12h光照，12h黑暗)中培养的15天proSRN1::SRN1‑GFP和pro35s::GFP的T2代幼苗
分别做如下处理：

[0059] ①分别在黑暗条件下处理12h和24h。

[0060] ②分别在光照条件下对T2代幼苗的水稻全营养液中加入终浓度为5mM的蔗糖、葡萄糖或蔗糖的代替物异麦芽酮糖处理12h和24h。

[0061] ③不用糖液处理光照下的T2代幼苗(光照环境下对照组)。

[0062] 为排除植物节律的影响，实验设计为所有的处理在同一时间点结束并取根尖组织在激光共聚焦显微镜下观察荧光信号强度，结果如图3所示。结果表明，在黑暗处理中的
proSRN1::SRN1‑GFP的T2代幼苗根尖中荧光信号相较于光照环境下对照组显著减弱；而在
光下蔗糖和葡糖糖的处理组中，根尖中荧光信号相较于光照环境下对照组显著增强，在光
下蔗糖和葡糖糖处理24h，荧光信号最强。加入蔗糖的代替物异麦芽酮糖不能够使荧光信号
变强，即外施异麦芽酮糖不能诱导SRN1基因的表达。阳性对照pro35s::GFP的T2代幼苗在各
个处理组中荧光信号差异不显著。以上结果证实，SRN1基因响应糖的诱导表达，并受糖饥饿
抑制表达，尤其是可利用的蔗糖和葡萄糖。

[0063] 实施例4：水稻SRN1基因在转录和翻译水平上受外源糖诱导表达

[0064] 将生长在光照培养箱(水稻全营养液，28℃，12h光照/12h黑暗)的15天日本晴和proSRN1::SRN1‑GFP的T2代幼苗，分别转移至无光培养箱(28℃)中培养36h，每间隔6h取叶
片于‑80℃中保存备用。36h后在水稻全营养液中加入终浓度为10mM的蔗糖、葡糖糖或蔗糖
的代替物异麦芽酮糖，继续在无光培养箱(28℃)中培养36h，每间隔6h取叶片于‑80℃中保
存备用。我们通过对样品RNA的提取、反转录获得cDNA和qRT‑PCR检测SRN1基因的表达水平，
具体方法如下：

[0065] 取新鲜的叶片样品采用Trizol法提取RNA。cDNA的合成使用TOYOBO公司的反转录试剂盒First Strand cDNA Synthesis Kit Rever Tra Ace‑ɑ。合成的第一链cDNA用
DEPC·H2O稀释至50μL用于克隆等分子实验。实时荧光定量qPCR(quantitative PCR)反应
使用上海翊圣生物科技有限公司 Power qPCR SYBR Green Master Mix。

[0066] 10μL体系包括：1μL cDNA，5μL SYBR Green Master Mix，0.2μL 10μM Primer F(forward)，0.2μL 10μM Primer R(reverse)，3.6μLddH2O。

[0067] 扩增程序是：95℃3mins，95℃10s，60℃30s，72℃15s，40个循环，在荧光定量PCR仪中进行。以Ubiquitin(LOC_Os03g13170)基因作为内参，基因的相对表达量用2‑ΔΔCT计
算。

[0068] 定量检测SRN1表达量的引物序列为：

[0069] SRN1‑qRT F：ttcggtgaatcgtcttccca；SEQ ID No.15；

[0070] SRN1‑qRT R：taggcaggtccttgttggag；SEQ ID No.16。

[0071] 结果如图4所示。结果表明，随着日本晴幼苗在黑暗中的继续培养，细胞中的糖分在不断消耗且不能进行光合作用进行补充，即SRN1基因在转录水平上随着碳源和糖的减少
表达量快速下降；在加入外源蔗糖和葡萄糖补充后，表达量快速恢复，但是加入蔗糖的代替
物异麦芽酮糖不能够使SRN1基因的表达量恢复。

[0072] 我们在对proSRN1::SRN1‑GFP的T2代幼苗样品植物总蛋白提取后进行Western blot检测后发现，SRN1蛋白在糖饥饿和外源糖加入过程中的表达变化趋势和SRN1基因在此
过程中转录水平上的趋势一致(如图4所示)。

[0073] 实施例5：水稻SRN1基因受组织内源性糖水平诱导表达

[0074] 在晴朗的大田自然环境下，每隔3h取Nip水稻和proSRN1::SRN1‑GFP的T2代的剑叶。用收取的Nip剑叶立即进行RNA的提取、反转录获得cDNA和qRT‑PCR检测SRN1基因的节律
表达模式。并同时用各时间点收取的Nip剑叶测定蔗糖、可溶性糖和淀粉含量，NSC含量等于
淀粉含量加上可溶性糖含量。用收取的proSRN1::SRN1‑GFP剑叶立即提取总蛋白并通过
western blot实验检测SRN1节律表达模式。实验结果如图5所示，野生型叶片中可溶性糖和
淀粉的在中午12点是含量最高，在凌晨3点钟左右含量最低。SRN1基因在转录水平和蛋白水
平在一天中的节律表达变化趋势和组织内源性糖含量的变化趋势一致，可以推断SRN1受水
稻组织内源性糖的诱导表达。

[0075] 此外，我们用10mM蔗糖、葡糖糖或蔗糖的代替物异麦芽酮糖作为效应剂，利用双荧光素酶原生质体转化系统在水稻原生质体中检测报告基因proSRN1::LUC的表达水平。具体
方法如下：

[0076] p190LUC载体上带有的萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)表达元件，可以作为报告基因。本实验将p190LUC载体经HindⅢ和BglⅠ酶切处理使之线性化。以Nip的基因组
DNA为模板，用带有重组接头的引物扩增1.5kb长度的启动子片段，通过同源重组的方法将
启动子片段连接入p190LUC载体上将重组质粒转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞。然后挑
取阳性克隆进行测序验证，测序完成且正确则载体构建成功。使用QIAGEN Plasmid Maxi 
Kit大量提取高质量的重组质粒和空载质粒。

[0077] 将所提取的高浓度的重组质粒以各种不同的反应组合分别转化进入水稻原生质体细胞中，每种质粒组合设置6次重复。实验中使用含海肾荧光素酶Renilla Luciferase表
达元件的rLUC载体作为内参，通过使用Promega  Reporter Assay System试剂
盒在Promega GLOMAX仪器上对不同反应组合的荧光素酶活性进行检测，记录萤火虫荧光素
酶/海肾荧光素酶(Luc/Ren)比值。

[0078] 结果如图5所示，报告基因proSRN1::LUC的转录能被蔗糖和葡萄糖显著激活，不能被异麦芽酮糖激活表达，说明蔗糖和葡萄糖可以直接激活SRN1基因的转录，即SRN1基因启
动子受蔗糖和葡萄糖诱导表达。

[0079] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

[0080] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的
一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明
将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一
致的最宽的范围。