一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物、筛选方法和诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物、筛选方法和诊断试剂盒。本发明提供的肾透明细胞癌血清circRNA生物标志物，在肾透明细胞癌组织和血清中的表达一致，均表现异常显著降低，是血清样本诊断肾透明细胞癌的非常可靠的标志物，为临床肾透明细胞癌诊断提供了新途径。本发明提供的试剂盒，使肾透明细胞癌的临床诊断简便快捷、诊断结果可靠。

权利要求

1.一种检测肾透明细胞癌circRNA生物标志物表达量的试剂在制备肾透明细胞癌诊断试剂中的应用，其特征是，所述肾透明细胞癌circRNA生物标志物为hsa_circ_0009267。

2.一种检测肾透明细胞癌circRNA生物标志物表达量的试剂在制备用于诊断肾透明细胞癌的试剂盒中的应用,其特征是，所述肾透明细胞癌circRNA生物标志物为hsa_circ_

0009267。

说明书

一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物、筛选方法和诊断试

剂盒

技术领域

[0001] 本发明具体涉及一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物、筛选方法和诊断试剂盒。

背景技术

[0002] 肾细胞癌(简称肾癌)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。肾癌最常见的组织学亚型是肾透明细胞癌，约占80‑90％。目前，部分和根治性肾切除术被认为是肾透明细胞癌的主要治疗方法。虽然肾透明细胞癌的筛查、诊断和治疗有所改善，但肾透明细胞癌患者的局部或远处转移率较高，预后很差，5年生存率低于10％。值得注意的是，肾透明细胞癌患者一旦出现癌症复发转移的情况，就意味着预后会很不理想，导致肾透明细胞癌的治愈率就会大大降低。针对术后复发的肾透明细胞癌患者，临床上通常协同使用酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂等靶向药物，尽管如此，患者的总生存期变化不明显。因此，寻找更合适的生物标志物用以识别并鉴定肾透明细胞癌患者，甚至是区分肾透明细胞癌恶性程度、监测肾透明细胞癌早期复发、预后等具有重要意义。但是目前尚未找到用于肾透明细胞癌早期诊断和预后随访生物标志物。

[0003] 而目前已有的研究显示环状RNA(circRNA)有可能会成为一种潜在的早期诊断和治疗肾透明细胞癌的新途径。

[0004] 但是目前circRNA在肾透明细胞癌领域的相关研究报道非常欠缺，还没有用于肾透明细胞癌诊断的较为稳定的生物标志物以及检测肾透明细胞癌血清中circRNA的相关报道。因此寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清circRNA在肿瘤临床检测中亟待解决的问题。

[0005] 此外，若能筛选出肾透明细胞癌异常表达的血清circRNA作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国肾透明细胞癌的诊断现状必将是一次有力的推动。

[0006] 迄今为止，尚未发现可靠的circRNA生物标志物用于肾透明细胞癌的诊断。

发明内容

[0007] 针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物及其筛选方法。

[0008] 为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

[0009] 一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物，包括hsa_circ_0009267。hsa_circ_0009267的相关信息如图8所示，编码所述circRNA生物标志物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

[0010] 一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：

[0011] (1)采集正常体检人群和肾透明细胞癌患者的血清样本，并对血清样本进行处理；

[0012] (2)对步骤(1)得到的血清样本进行circRNA芯片分析；

[0013] (3)根据步骤(2)得到的circRNA芯片结果，绘制火山图以及层次聚类热图进行分析，筛选出综合分析结果最优、差异表达最显著的circRNA作为候选circRNA；

[0014] (4)收集肾透明细胞癌患者的组织样本，提取组织样本中总RNA，进行RNA逆转录反应，采用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR检测circRNA的表达水平，筛选出肾透明细胞癌组织相对癌旁组织中表达阈值2以上且与circRNA芯片结果一致的circRNA；

[0015] (5)检验步骤(4)筛选出的circRNA在肾透明细胞癌患者血清和肾透明细胞癌组织中的表达一致性，表达一致的，则该circRNA为目标生物标志物。

[0016] 进一步地，步骤(1)中，具体过程为：抽取正常体检人群和肾透明细胞癌患者的清晨空腹静脉血6ml，置于不含抗凝剂的管中，静置30分钟，于4℃3,000g离心15分钟，取上层血清，每500μl分装至RNase‑free EP管置于‑80℃储存。

[0017] 进一步地，步骤(4)中，所述肾透明细胞癌患者的组织样本包括肾透明细胞癌组织样本以及配对的距离肾透明细胞癌组织3厘米以上范围的癌旁组织。

[0018] 进一步地，步骤(3)中，得到的候选circRNA分别为：hsa_circ_0030264、hsa_circ_0000118、hsa_circ_0081215、hsa_circ_0109946、hsa_circ_0009267。

[0019] 进一步地，步骤(5)中，目标生物标志物为hsa_circ_0009267。

[0020] 一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物在制备肾透明细胞癌诊断试剂中的应用，所述生物标志物为以上所述的肾透明细胞癌circRNA生物标志物。

[0021] 本发明提供了一种所述肾透明细胞癌circRNA生物标志物的检测试剂在制备用于诊断肾透明细胞癌的试剂盒中的应用。

[0022] 本发明另一方面公开了一种肾透明细胞癌诊断试剂盒，其至少包括hsa_circ_0009267的检测引物。

[0023] 优选的，所述的诊断试剂盒为肾透明细胞癌血清样本诊断试剂盒。本发明确定了肾透明细胞癌血清中hsa_circ_0009267与肾透明细胞癌组织中hsa_circ_0009267表达趋势一致性，血清hsa_circ_0009267作为肾透明细胞癌诊断标志物，而且是无创的，可以用于未来的临床诊断。hsa_circ_0009267是血清样本诊断肾透明细胞癌的非常可靠的标志物，为临床肾透明细胞癌诊断提供了新途径。

[0024] 进一步的，所述的hsa_circ_0009267的检测引物的前引物序列如SEQ ID NO.1所示；后引物序列如SEQ ID NO.2所示。进一步地，hsa_circ_0009267的定量PCR前引物序列为5’‑ATCTCTGCAGCACTGACCCG‑3’，定量PCR后引物序列为5’‑ACAAGGGCAAGAAGAGGCAC‑3’。

[0025] 肾透明细胞癌诊断试剂盒还包括RNA提取试剂、PCR逆转录试剂和PCR荧光定量试剂。进一步地，RNA提取试剂以及PCR逆转录试剂可以直接选用现有市售商品。PCR荧光定量试剂用于进行SYBR qRT‑PCR反应，使用常规市售的商品试剂即可。

[0026] 本发明的有益效果是：

[0027] (1)本发明基于生物信息学分析，结合qRT‑PCR方法，将候选的circRNAs分别在肾透明细胞癌患者组织和肾透明细胞癌患者血清生物样本中，进一步验证其表达差异和诊断价值，以达到最优评价体系，以此筛选出的目标circRNA生物标志物，更具有临床指导性，为今后开发诊断肾透明细胞癌的非侵入性生物标志物提供理论依据，具有重大的临床实用价值。

[0028] (2)本发明确定了肾透明细胞癌血清中hsa_circ_0009267与肾透明细胞癌组织中hsa_circ_0009267表达趋势一致性，血清hsa_circ_0009267作为肾透明细胞癌诊断标志物，而且是无创的，可以用于未来的临床诊断。

[0029] (3)本发明基于生物信息学分析，结合qRT‑PCR方法验证以及肾透明细胞癌组织同血清表达一致性的验证，筛选出适用于肾透明细胞癌血清样本的circRNA生物标志物，是一种简单有效的筛选方法。

[0030] (4)本发明将肾透明细胞癌组织与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold，qRT‑PCR中CT值小于30)的1种circRNA进行血清学表达分析，结果表明这种circRNA在血清中稳定表达，血清circRNA的表达与组织circRNA的表达具有很好的一致性；这种circRNA可以作为肾透明细胞癌诊断的生物标志物。

[0031] (5)本发明提供的肾透明细胞癌血清circRNA生物标志物，在肾透明细胞癌组织和血清中的表达一致，均表现异常显著降低，是血清样本诊断肾透明细胞癌的非常可靠的标志物，为临床肾透明细胞癌诊断提供了新途径。本发明提供的试剂盒，使肾透明细胞癌的临床诊断简便快捷、诊断结果可靠。本发明首次公开了hsa_circ_0009267基因与肾透明细胞癌相关，并为肾透明细胞癌的分子机理提供新的思路。

附图说明

[0032] 图1是肾透明细胞癌患者血清样本中的circRNA表达谱分析图；其中图A为火山图，图B为层次聚类热图，其中，ccRCC表示肾透明细胞癌患者血清样本，Normal表示健康对照者血清样本。

[0033] 图2是初步筛选的5种circRNA在肾透明细胞癌组织和其相应癌旁正常组织中的相对表达水平结果图。

[0034] 图3是hsa_circ_0009267的临床小样本验证分析结果；其中图A为hsa_circ_0009267在7对肾透明细胞癌组织和其相应癌旁正常组织中的相对表达水平，图B为hsa_circ_0009267在6例健康对照者的血清和8例肾透明细胞癌患者的血清中的相对表达水平。

[0035] 图4是hsa_circ_0009267的临床大样本验证结果图。

[0036] 图5是hsa_circ_0009267对肾透明细胞癌细胞增殖的影响示意图，其中，图5中Mock表示的是没有加RNase R处理的样品；NC指的是转染细胞的时候转染空载质粒的那一组，也就是说对照组；图5A为hsa_circ_0009267的共价闭环结构稳定性的检测结果图，图5B为hsa_circ_0009267在肾透明细胞癌细胞中的过表达结果图，图5C为克隆形成实验评价hsa_circ_0009267对肾透明细胞癌细胞增殖的影响示意图，图5D为CCK‑8实验评价hsa_circ_000927对肾透明细胞癌细胞增殖的影响示意图，图5E为免疫荧光染色实验评价hsa_circ_0009267对肾透明细胞癌细胞增殖的影响示意图。

[0037] 图6是hsa_circ_0009267对肾透明细胞癌细胞凋亡和细胞周期的影响示意图；图6A为hsa_circ_0009267对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响示意图，图6B为hsa_circ_0009267对肾透明细胞癌细胞周期的影响示意图。

[0038] 图7是体内过表达hsa_circ_0009267抑制肾透明细胞癌细胞成瘤结果图；图7A为建立的异种移植小鼠模型结果图，图7B为hsa_circ_0009267过表达细胞组和对照组的裸鼠体内的肿瘤生长情况图，图7C为hsa_circ_0009267过表达细胞组和对照组的裸鼠的肿瘤重量差异图。

[0039] 图8是hsa_circ_0009267外显子环化而成的生物信息示意图，hsa_circ_0009267是一种由第11个外显子至第13个外显子环化而成的circRNA，剪接成熟后的序列长度为378bp。

具体实施方式

[0040] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的仪器、材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规商业途径获得。

[0041] 以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

[0042] 下述实施例中的人肾透明细胞癌细胞系ACHN、786‑O均购自中国科学院细胞库，资源编号分别为SCSP‑5063和SCSP‑5059。

[0043] 下述实施例中的动物出处如下：

[0044] Balb/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

[0045] 实施例1肾透明细胞癌中的circRNA表达谱分析

[0046] (1)收集肾透明细胞癌患者的血清样本

[0047] 在取得患者知情同意后，收集浙江省浙江大学第一附属医院2018年4月‑2018年5月经病理诊断明确的肾透明细胞癌患者6例和健康人4例清晨空腹静脉血6ml(作为对照)。所有肾透明细胞癌患者均为初次确诊患者，取血之前未进行手术、放疗及化疗治疗。4例健康对照组为未患有恶性肿瘤及其他疾病，同时年龄匹配的健康人群。

[0048] (2)血清样本采集及处理

[0049] 抽取清晨空腹静脉血6ml置于不含抗凝剂的管中，静置30分钟，于4℃3,000g离心15分钟，取上层血清，每500μl分装至RNase‑free EP管置于‑80℃冰箱储存。

[0050] (3)circRNA芯片筛选差异表达的circRNA

[0051] 利用北京博奥生物芯片有限责任公司进行circRNA芯片技术筛选，分别将4个正常体检人群的血清样本(正常对照组)，6个肾透明细胞癌患者的血清样本进行筛查，依据circRNA表达水平不同，将两组标本所检测的差异circRNA进行生物信息学分析，根据芯片结果绘制火山图以及层次聚类热图进行生物信息学分析(分别如图1中A和B所示)，其中在肾透明细胞瘤中上调的环状RNA有16个，下调的环状RNA有21个(p≤0.05，fc≥1.5)；其中下面5种circRNA为显著差异性表达的，分别为hsa_circ_0030264、hsa_circ_0000118、hsa_circ_0081215、hsa_circ_0109946和hsa_circ_0009267。接下来，通过qRT‑PCR验证5种circRNA在肾透明细胞癌组织和其相应正常组织中的相对表达水平。

[0052] 实施例2目标circRNA的初步筛选

[0053] (1)收集肾透明细胞癌患者的组织样本

[0054] 在取得患者知情同意后，收集浙江省浙江大学第一附属医院2018年4月‑2018年5月经病理证实为肾透明细胞癌患者手术后标本6对，包括癌组织标本以及配对的距离癌组织3厘米以上范围的癌旁组织，所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。所有组织样本装至RNase‑free EP管置于‑80℃冰箱储存。

[0055] 2、组织样本总RNA的提取

[0056] 具体步骤如下：

[0057] ⑴称取重量在0.3‑0.5g之间的组织切块，加入1ml AG RNAex Pro Reagent(艾科瑞生物工程有限公司)裂解液，并加入磁珠，利用组织破碎仪进行组织破碎，匀浆至肉眼看不到组织样本颗粒为止。

[0058] ⑵裂解好的样品先上下颠倒几次，室温静置5min。每管样品中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，静置5min。

[0059] ⑶4℃，12000g离心15min，取上清至RNA‑free EP管中，同时记录上清大致体积。然后加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，并在冰上放置15min。

[0060] ⑷4℃，12000g离心15min，弃上清，同时防止沉淀随上清丢弃。

[0061] ⑸加入1ml用DEPC水配制的体积分数80％乙醇清洗RNA沉淀。4℃，12000g离心5min，弃上清。

[0062] ⑹4℃，12000g离心1min，并利用枪头吸去残余上清。

[0063] ⑺超净台内，将EP管打开，晾干2‑5min。

[0064] ⑻用RNase‑free水溶解RNA，每管加入10‑20μl RNase‑free水，枪头吹打均匀并放置在冰上。

[0065] ⑼NanoDrop 2000超微量分光光度计检测样品RNA浓度，暂时不用，可在‑80℃保存。

[0066] 3、RNA逆转录

[0067] 采用 II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆转录试剂盒(诺唯赞生物技术有限公司)进行RNA逆转录反应，采用20μl反应体系，具体步骤如下：

[0068] ⑴基因组DNA去除

[0069] 在RNase‑free的离心管中配制如下混合液，

[0070] 试剂 使用量RNase‑free ddH2O to 16μl
4×gDNA wiper Mix 4μl
模板RNA 1μg

[0071] 用移液器轻轻吹打混匀。42℃水浴2min。

[0072] ⑵配制逆转录反应体系

[0073] 在第1步的反应管中直接加入5×HiScript II qRT SuperMix II，

[0074] 试剂 使用量5×HiScript II qRT SuperMix II 4μl
第1步的反应液 10μl

[0075] 用移液器轻轻吹打混匀。

[0076] ⑶进行逆转录反应

[0077] 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后，在37℃反应15min，最后85℃孵育5s，使酶失活。产物可立即用于qRT‑PCR反应，或在‑20℃保存。

[0078] 4、circRNA qRT‑PCR反应

[0079] 对逆转录好的反应液，取3μl加入到50μl ddH2O中稀释。

[0080] 进行实时荧光定量PCR，使用诺唯赞生物技术有限公司提供的SYBR Green酶，20μl反应体系如下：

[0081]试剂名称 加液量(μl/孔)
2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5μl
cDNA 5μl
Forward primer 0.3μl
Reverse primer 0.3μl
ddH2O 1.9μl
Tolal volume 15μl

[0082] 将反应液分装入96孔板中，然后再加入cDNA样品，封板膜封口，离心机低速离心后，同时并以β‑actin基因作为内参，每个样本同时做3个复孔，放入荧光定量PCR仪检测。

[0083] 该方法的反应条件：95℃预变性反应10sec；95℃反应5sec、60℃反应20sec，40个循环；溶解曲线为95℃反应60sec，55℃反应30sec，95℃反应30sec。

[0084] 5、结果分析

[0085] 实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，Ct值指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。目的circRNA起始拷贝数越多，则Ct值越小，反之则越大。在目的circRNA与内参扩增效率相同的情况下可以直接得到目的circRNA相对于内参的定量△Ct＝Ct(目的)‑Ct(内参)，△△Ct＝△Ct(癌旁组织)‑△Ct(肾透明细胞癌组织)。

[0086] 计算2‑△△Ct值，用graphpad prism6作图，来分析比较肾透明细胞癌组织及其癌旁组织的circRNA的相对表达量。研究结果显示，hsa_circ_0009267在肾透明细胞癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织(如图2所示)，且与circRNA芯片结果表达一致。因此，为明确hsa_circ_0009267的临床意义，进一步地对其进行小样本组织和血清验证。

[0087] 实施例3目标circRNA的临床小样本验证

[0088] 1、临床样本的收集

[0089] 本发明选取了7对肾透明细胞癌以及癌旁组织样本，他们分别来自7个肾透明细胞癌患者，选取6例健康对照者和8例肾透明细胞癌患者的血清，肾透明细胞癌组织的样本收集及保存同实施例2，血清样本的收集及保存同实施例1。

[0090] 2、总RNA的提取

[0091] 肾透明细胞癌组织样本总RNA的提取同实施例2。

[0092] 血清样本总RNA的提取步骤如下：

[0093] ⑴准备500μl的解冻血清样本，加入2500μl的AG RNAex Pro Reagent裂解试剂，在涡旋振荡器或上下颠倒几次，混合均匀，室温静置5min。

[0094] ⑵每管样品中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，静置5min。

[0095] ⑶4℃，12000g离心15min，取上清至RNA free EP管中，同时记住上清大致体积。然后加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，并在‑20℃放置1h。

[0096] ⑷4℃，12000g离心15min，弃上清，同时防止沉淀随上清丢弃。

[0097] ⑸加入1ml用DEPC水配制的体积分数80％乙醇清洗RNA沉淀。4℃，12000g离心5min，弃上清。

[0098] ⑹4℃，12000g离心1min，并利用枪头吸去残余上清。

[0099] ⑺超净台内，将EP管打开，晾干2‑5min。

[0100] ⑻用RNase‑free水溶解RNA，每管加入10‑20μl RNase‑free水，枪头吹打均匀并放置在冰上。

[0101] ⑼NanoDrop 2000超微量分光光度计检测样品RNA浓度，暂时不用可在‑80℃保存。

[0102] 3、RNA逆转录合成，同实施例2。

[0103] 4、qRT‑PCR反应，同实施例2。

[0104] 5、结果分析

[0105] 在7例肾透明细胞癌患者的肾透明细胞癌组织和癌旁组织中发现，hsa_circ_0009267在肾透明细胞癌组织中的表达远远低于癌旁组织(如图3中A所示)。为了进一步探讨hsa_circ_0009267是否能够作为新兴的无创生物标志物紧接着检测了hsa_circ_
0009267在肾透明细胞癌患者血清中的表达水平，研究发现hsa_circ_0009267在肾透明细胞癌患者的血清中的表达水平也明显下调(如图3中C所示)。因此可以判断，无论在肾透明细胞癌组织还是血浆样本中，hsa_circ_0009267表达模型一致，均表现异常显著降低。

[0106] 实施例4目标circRNA的临床大样本验证

[0107] 为了增加实验结果的可信性和确定性，进一步扩大对照和病理血清标本数量，然后，检测了50名肾透明细胞癌患者和30名健康对照者的血清样本中的hsa_circ_0009267的相对表达水平。血清样本的收集、保存同实施例1，总RNA的提取同实施例3，RNA逆转录合成和qRT‑PCR反应，同实施例2。

[0108] 研究结果发现，肾透明细胞癌患者血清中的hsa_circ_0009267表达明显下调(p＝0.0254，p值表示统计学分析对照组和肾透明细胞癌组两者的circRNA表达是否有差异，p<
0.05具有统计学意义，如图4所示)，这表明hsa_circ_0009267作为肾透明细胞癌分子标记物的潜力巨大。

[0109] 实施例5目标circRNA的体外功能性验证

[0110] 1、hsa_circ_0009267的共价闭环结构的检测

[0111] 首先，为了进一步验证hsa_circ_0009267的共价闭环结构，使用786‑O和ACHN细胞系作为细胞模型，采用RNase R耐受性检测验证circRNA的稳定性。RNase R(Ribonuclease R)是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’‑5’核糖核酸外切酶，可从3’‑5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA。因此，使用RNase R处理总RNA，qPCR检测处理前后circRNA的相对表达量变化。

[0112] 图5中A为RNase R处理后hsa_circ_0009267、线性RNA DVL1以及对照β‑actin的相对表达量结果，图5中Mock表示的是没有加RNase R处理的样品。如图5中A所示，β‑actin以及DVL1经过RNase R消化后相对表达量显著下降，而circRNA相对表达量也略有下降。造成这种现象的原因，除了考虑RNA样品被外源RNA酶降解外，也有可能hsa_circ_0009267耐受RNase R消化力较弱，从而导致检测的circRNA丰富度下降。但总体来说，hsa_circ_0009267对RNase R外切酶的消化具有一定抗性，相对于线性RNA DVL1来说比较稳定。

[0113] 2、hsa_circ_0009267在肾透明细胞癌中增殖能力的检测

[0114] 细胞增殖是肾透明细胞癌恶性行为的重要特征。为了研究hsa_circ_0009267的功能，首先构建了hsa_circ_0009267过表达载体，以有效地上调hsa_circ_0009267在786‑O和ACHN细胞中的表达。通过qRT‑PCR检测hsa_circ_0009267的表达水平，图5中B为hsa_circ_0009267在肾透明细胞癌细胞中的过表达结果，图5中，NC指的是转染细胞的时候转染空载质粒的那一组，也就是说对照组；结果证实，在786‑O和ACHN细胞中转染hsa_circ_0009267过表达载体后，hsa_circ_0009267表达明显上调。

[0115] 接下来，进行克隆形成、细胞计数试剂盒‑8(CCK‑8)和免疫荧光染色实验，探讨hsa_circ_0009267对肾透明细胞癌细胞的生物学效应。图5C为克隆形成实验结果，结果表明，hsa_circ_0009267上调导致786‑O和ACHN细胞集落数减少，这说明hsa_circ_0009267的上调能够抑制肾透明细胞癌细胞的存活能力。

[0116] 过表达hsa_circ_0009267后铺96孔板，铺板0小时(铺板后6小时细胞完全贴壁定位铺板0小时)、24小时、48小时及72小时。图5中D为细胞计数试剂盒‑8(CCK‑8)实验结果，结果表明，过表达hsa_circ_0009267可显著抑制786‑O和ACHN细胞的增殖，72小时后对照组和hsa_circ_0009267过表达组这两组具有显著性差异(**p<0.01，***p<0.001)。

[0117] 图5中E为免疫荧光染色法结果，结果揭示了稳定地过表达hsa_circ_0009267，786‑O和ACHN细胞中Ki67增殖指数降低。

[0118] 总之，以上所有这些结果都表明hsa_circ_0009267在体外能够抑制肾透明细胞癌细胞的增殖。

[0119] 3、hsa_circ_0009267在肾透明细胞癌中凋亡能力的检测

[0120] 细胞凋亡异常是恶性肿瘤的另一重要特点。本实施例过表达hsa_circ_0009267后采用流式细胞术检测细胞的凋亡能力，以进一步评估hsa_circ_0009267是否通过改变细胞凋亡而影响786‑O和ACHN细胞的增殖。在786‑O和ACHN细胞中过表达hsa_circ_0009267后检测凋亡细胞，统计右上象限(早期凋亡)及右下象限(晚期凋亡)细胞比例的总和。图6中A为细胞凋亡检测的结果，研究发现，与对照组相比较，转染过表达hsa_circ_0009267载体的786‑O和ACHN细胞明显促进细胞凋亡。

[0121] 4、hsa_circ_0009267在肾透明细胞癌中细胞周期的检测

[0122] 用流式细胞术分析hsa_circ_0009267对肾透明细胞癌细胞周期的影响。图6中B为细胞周期检测的结果，结果显示hsa_circ_0009267过表达在786‑O和ACHN细胞中可以对细胞周期G1阻滞并缩短G2和S期进程，从而影响细胞的增殖能力。

[0123] 实施例6目标circRNA的体内功能性验证

[0124] 由于hsa_circ_0009267在体外抑制肾透明细胞癌细胞的增殖，因此推测hsa_circ_0009267也可能抑制肾透明细胞癌细胞在体内的肿瘤发生。为了进一步探讨hsa_circ_0009267在体内的作用，我们将用含有hsa_circ_0009267质粒或空载质粒转染ACHN细胞接种到裸鼠体内，建立了异种移植小鼠模型。图7中A为建立的异种移植小鼠模型结果图，其中，圆圈圈起来的部分代表的是小鼠长的肿瘤，图7A右边显示了相应肿瘤的大小。图7中B和C为hsa_circ_0009267过表达后，肿瘤在裸鼠体内生长情况，结果表明，与对照组裸鼠的肿瘤生长相比，hsa_circ_0009267过表达细胞组的裸鼠的肿瘤生长明显受到抑制。hsa_circ_0009267过表达组的肿瘤大小明显小于对照组的肿瘤，在hsa_circ_0009267过表达组中，肿瘤重量也要低得多。这些结果表明，hsa_circ_0009267抑制了肾透明细胞癌细胞在体内的生长。

[0125] 综上所述，本发明中的目标circRNA hsa_circ_0009267无论是在细胞水平还是动物水平都体现了能抑制肾透明细胞癌的肿瘤发生和进展。

[0126] 显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。