绿尾虹雉同舍鸟蛋亲缘关系鉴定的微卫星引物组合及应用

摘要

本发明公开了一种绿尾虹雉同舍鸟蛋亲缘关系鉴定的微卫星引物组合及应用，所述引物包括CM34、CM104、CM412、CM687、CM1423、CM1959、CM2014、CM2083、CM2269、CM2289、CM3131和CM3590，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～24所示。本发明引物能在绿尾虹雉蛋壳DNA中稳定扩增，通过这组12对引物，获得多态性含量较高，重复性好的绿尾虹雉微卫星序列，建立了这些标记相应的基因分型技术，并可实现绿尾虹雉同舍产蛋间同胞，半胞或非亲三种亲缘关系情况的鉴定。

权利要求

1.一组绿尾虹雉多态性微卫星标记的引物，其特征在于，所述引物包括CM34、CM104、CM412、CM687、CM1423、CM1959、CM2014、CM2083、CM2269、CM2289、CM3131和CM3590，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～24所示。

2.根据权利要求1所述的一组绿尾虹雉多态性微卫星标记的引物，其特征在于，所述引物的正向引物或反向引物带有荧光标记，所述的荧光标记选自FAM、HEX或TAMRA。

3.根据权利要求2所述的一种绿尾虹雉多态性微卫星标记的引物，其特征在于，引物编号 荧光标记类型及标记位置CM34 F:FAM

CM104 R:HEX

CM412 R:FAM

CM687 R:HEX

CM1423 F:FAM

CM1959 F:TAMRA

CM2014 F:HEX

CM2083 F:FAM

CM2269 F:HEX

CM2289 R:FAM

CM3131 F:FAM

CM3590 R:TAMRA

。

4.根据权利要求1所述的一组绿尾虹雉多态性微卫星标记的引物，其特征在于，所述引物反应体系为：10×Buffer 1μL，25mM MgCl20.8μL，dNTP Mix 0.2μL，正向引物和反向引物

10μmol/L各0.2μL，Taq酶0.2μL，DNA 10ng，双纯水补足到10μL。

5.根据权利要求4所述的一种绿尾虹雉多态性微卫星标记的引物，其特征在于，所述引物反应程序为：95℃预热10min；94℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃10分钟；4℃保存。

6.权利要求1所述的引物在绿尾虹雉同圈舍蛋间亲缘关系鉴定中的应用。

说明书

绿尾虹雉同舍鸟蛋亲缘关系鉴定的微卫星引物组合及应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学DNA分子标记技术领域，具体涉及一种绿尾虹雉同舍鸟蛋亲缘关系鉴定的微卫星引物组合及应用。

背景技术

[0002] 绿尾虹雉是我国特有的珍稀鸟类，和大熊猫一样，都是在宝兴县被发现并命名的。绿尾虹雉分布于四川、云南、青海、甘肃、西藏人迹罕至的高山地带，具有极高的生态保护价值，也是高山草甸生态系统中的伞护物种。绿尾虹雉在自然界数量稀少，2016年，IUCN的专家团队估算其成体数量在2500～9999只之间，并推测野生种群仍然在持续下降的过程中。
目前绿尾虹雉被列入《华盛顿公约》附录Ⅰ(生效年代：1997年)；列入中国国家重点保护专属一级(生效年代：1989年)；列入中国濒危动物红皮书濒危级(生效年代：1996年)；列入《世界自然保护联盟》(IUCN)2013年濒危物种红色名录ver3.1——易危(VU)。

[0003] 迁地保护是拯救绿尾虹雉的重要手段。然而绿尾虹雉的饲养与繁育非常困难。北京动物园在1958年首次饲养并展出绿尾虹雉，1980年进行了成功繁育。北京野生动物园的绿尾虹雉种群曾达到13只，一度成为全球最大的人工繁育种群。然而许多年过去，由于缺乏种群遗传管理，同时饲养繁育技术上仍存在缺陷，那些曾成功繁育绿尾虹雉的动物园和饲养机构里，它们的踪迹都慢慢消失了，目前全球仅余蜂桶寨国家级自然保护区一家绿尾虹雉繁育机构。2019年蜂桶寨共繁育成活绿尾虹雉12只，实现了笼养种群翻一番的目标。

[0004] 近年来有报道称，绿尾虹雉圈养种群在繁育方面获得了极大提升，但其种群管理仍存在很多问题，尤其是该种群规模小，种群内亲缘关系不明，很容易发生近交衰退。近交衰退是影响小种群灭绝的一个重要原因。其次，圈养绿尾虹雉的繁殖常采用一雄多雌的方式，一般是2只雌鸟和1只雄鸟合笼。但如果配种后第一轮没有受精蛋产出，会换另1只雄鸟配，考虑到产出的蛋不能完全确认是否受精，因此一雌配多雄的现象在绿尾虹雉圈养管理中也颇为常见，一只雌鸟产下的一窝蛋可能来自于多只雄鸟。此外，由于繁殖期多只雌鸟生活在一起，因此同圈舍拾得的鸟蛋很难确定分别产自哪只雌鸟。管理者们往往凭借经验，按蛋的大小、颜色来进行辨别，准确性无法得到保障。由于未实施过绿尾虹雉的亲子鉴定，谱系记录的错误仍在继续积累。

[0005] 微卫星是用于种群遗传管理的常规手段。使用近源物种的微卫星位点对特定物种进行遗传多样性分析是比较常见的，特别是研究者们在分析鸟类种群遗传结构时，常会采用一些近缘物种的微卫星进行分析。如曹曼曼(2010)对斑翅山鹑的研究，就是引用家鸡和鹌鹑的8个微卫星位点，而刘园园(2012)则从58个位点中筛选了4种8个近源鸟类微卫星位点对黄腹角雉进行了种群结构分析。种群结构分析或许可以满足需要，但很少见文献用近源微卫星来建立种群谱系。如Zou等(2010)年在丹顶鹤的遗传多样性分析中采用了6个蓝鹤的微卫星位点，然而丹顶鹤种群的亲缘关系判定还是等到大量丹顶鹤特有微卫星位点被开发后才得以完成(zhang et al.,2015)。又如潘登等(2005)，周芸芸(2015)，任轶(2007)等多位研究者都采用近源物种(人或其他猴类)的微卫星位点对川金丝猴种群进行了遗传结构分析或亲子鉴定。但本实验室在采用以上位点对川金丝猴进行亲缘关系推定的研究中发现，这些近缘物种的微卫星位点存在不适用、精度不够等情况，还不能满足对川金丝猴种群进行亲缘关系推定的需求。因此，在进行绿尾虹雉亲缘关系鉴定时，开发该物种特有的微卫星标记是非常必要的。

[0006] 与普通哺乳动物不同，绿尾虹雉的应激反应很大，采血会对动物造成很大伤害，并有致死可能。所以比较现实的DNA来源一般是刚孵化完或死胎的蛋壳。这种非损伤性采样的样品提出来的DNA，存在DNA量少及降解的问题，这对微卫星标记的筛选也提出了更高的要求。

[0007] 本研究首次开发了绿尾虹雉特有的微卫星位点。所设计的引物能在其蛋壳DNA中稳定扩增。应用技术手段分析了同舍产蛋间的亲缘关系，增加了绿尾虹雉谱系记录的准确性，避免近亲繁殖隐患。在绿尾虹雉繁殖技术以及采样问题得到解决的前提下，最终将实现圈养种群的遗传管理与自我维持。

发明内容

[0008] 本发明旨在提供一种绿尾虹雉多态性微卫星标记的引物，该组微卫星引物能扩增出具有较高多态性且重复性好的核苷酸序列，并可应用于蛋壳这种特殊来源的DNA样品。该组微卫星引物所扩增核苷酸序列的碱基重复数为3‑5个，引物稳定性高，多态信息含量丰富，能够通过该组引物进行绿尾虹雉鸟蛋间亲缘关系的研究，从而可以为绿尾虹雉谱系管理提供相关鉴定手段，并为未来解决相关绿尾虹雉种群管理问题打下基础。

[0009] 为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

[0010] 一种绿尾虹雉多态性微卫星标记的引物，所述的引物为(引物方向均为5'‑3')：

[0011] CM34：ACAAGCTCCCACCAGAATGC和ACTGATTGGGGCATAAAAACTGC；

[0012] CM104：CAAAAGCACCAAGTAATAACCACTGG和GACTTGTGCTTCTGTGGTTGC；

[0013] CM412：TGTTGGCAGGAACAATGGTCG和AGCAGTTGGTTGCATAAAGTTTGG；

[0014] CM687：GCCTATAGACTTTGTGGTCACCC和ATGGATGGGTTGGCAGATGG；

[0015] CM1423：CACAGCCAGAAAGGTAGCCC和AGGCACTGCAGAATAATGATCCC；

[0016] CM1959：GTACCTCCACTCAGACACTGC和GCATTCAGTCGATTTTACAGAGCC；

[0017] CM2014：CACACTGAAGATGCTGGGGG和CAAAAGGGAGGCTGAAACTTTCC；

[0018] CM2083：AGCGCTTTTCGTATGCCTGG和AGCCAGTTAGTTGATCCGGC；

[0019] CM2269：GGTATACACAACCCGGAGAGC和CGTATAGAAACACGGAGCGACG；

[0020] CM2289：ATCACAGCGTGTTCTTACAATGC和ATGATCAATAGCCCTGTGGAGC；

[0021] CM3131：TTGGACACCTGCAGTTCACC和GGTGAATATAAAGACCCAAGGACAGG；

[0022] CM3590：GGTATTTCTGTAGTCCTCTTCATCTGC和GATGCAGGTTCAGTTCATTGTCC。

[0023] 本发明引物是针对三碱基至五碱基重复的微卫星位点设计的引物，稳定性高，具有良好多态性，通过这组12对绿尾虹雉微卫星引物，建立这些标记相应的基因分型技术，应用于蛋壳DNA，并获得多态性含量较高，重复性好的绿尾虹雉微卫星数据，可实现绿尾虹雉同圈舍蛋间的亲缘关系鉴定。

[0024] 具体的，三碱基重复序列的特异性引物为CM34、CM2269、CM2289和CM3131；四碱基重复序列的特异性引物为CM104、CM412、CM687、CM1959、CM2014、CM2083和CM3590；五碱基重复序列的特异性引物为CM1423。

[0025] 上述所述引物的正向引物(F)或反向引物(R)带有荧光标记，所述的荧光标记选自FAM、HEX或TAMRA，具体如下：

[0026]

[0027]

[0028] 在本发明的另一方面，提供了上述引物在绿尾虹雉蛋壳DNA中的PCR方法，包括以下步骤：

[0029] 1)提取待测绿尾虹雉样品DNA作为模板；

[0030] 2)用上述引物进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶电泳，然后分型判定。

[0031] 进一步的，所述的PCR扩增反应体系为：10×Buffer 1μL，25mM MgCl20.8μL，dNTP Mix 0.2μL，正向引物和反向引物10μmol/L各0.2μL，Taq酶0.2μL，DNA 10ng，双纯水补足到10μL。

[0032] 进一步的，所述的PCR扩增反应程序为：95℃预热10min；94℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃10分钟；4℃保存。

[0033] 在本发明的另一方面，提供了上述引物在绿尾虹雉同圈舍蛋间亲缘关系鉴定中的应用。

[0034] 本发明的有益效果为：

[0035] (1)设计了12对绿尾虹雉微卫星引物，该组引物是针对三碱基至五碱基重复的微卫星位点设计的引物，稳定性高，具有良好多态性，通过这组12对绿尾虹雉微卫星引物，获得多态性含量较高的绿尾虹雉微卫星位点，建立了这些标记相应的基因分型技术，为绿尾虹雉种群遗传管理提供技术支持。

[0036] (2)该12对绿尾虹雉微卫星引物，可应用于蛋壳来源含量较少、存在降解的DNA，采样时不会对动物造成伤害，保障了绿尾虹雉的相关动物福利，也为圈养管理工作提供了便利。

[0037] (3)用于绿尾虹雉的同舍所产蛋间的亲缘关系鉴定，便于绿尾虹雉圈养种群的管理，增加谱系记录的准确性，降低近亲繁殖风险。今后还可以利用大量微卫星研究结果来构建清晰的遗传学家谱，为绿尾虹雉的保护做出相应贡献。

具体实施方式

[0038] 下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0039] 实施例1

[0040] 本发明在绿尾虹雉全基因组序列中，进行微卫星位点开发，同时设计这些位点的引物，在含有微卫星重复位点的核苷酸序列中选取若干，进行物种特异性筛选，选取了200对具有物种特异性的引物序列合成普通引物，对随机选取的3份绿尾虹雉DNA样品进行PCR，并在琼脂糖凝胶上电泳，进行引物初筛，得到93个微卫星位点，在此基础上合成93对荧光引物，在多份DNA样品中进行PCR扩增及基因分型，完成绿尾虹雉微卫星位点的筛选，得到多态性高，重复性好的分子标记12对。具体内容如下：

[0041] 1)提取绿尾虹雉DNA

[0042] 在绿尾虹雉繁殖期，从蜂桶寨国家级自然保护区圈舍中采集刚孵化完或死胎的蛋壳。采用QIAMP 69506血液/组织微量试剂盒提取DNA。

[0043] 用灭菌的剪刀小心揭下蛋壳里边的膜约0.2g到2ml EP管中；加入ATL 500μL(试剂盒内试剂)及30μL蛋白酶K(20mg/ml)，混合均匀，置于水浴箱中振荡，56℃孵育3小时；短暂离心后，分装液体200μL到新的EP管中，加入试剂盒内试剂AL200μL，混匀，70℃孵育10分钟；加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；短暂离心后，将上一步的液体全转入离心柱中；加入
500μL AW1(试剂盒内试剂)，12000转/分离心1分钟；加入500μL AW2(试剂盒内试剂)，12000转/分离心1分钟；继续空转3分钟，然后将离心柱放在新的EP管中；加入100μL TE缓冲液洗脱；DNA检测：点样1μL，2％琼脂糖凝胶电泳110伏30分钟检测DNA的完整性；微量分光光度计NanoDrop2000检测DNA的浓度。储存于4℃或‑20℃备用。

[0044] 2)引物筛选

[0045] 通过Krait软件对绿尾虹雉基因组进行微卫星位点的筛选。从基因组序列中寻找微卫星位点，范围广，信息量大，能得到大量的微卫星位点，同时节约大量的时间与成本。对绿尾虹雉进行基因组部分SSR标记测序，得到大量含有微卫星座位的DNA序列信息：近30万个微卫星重复片段，其中20万多为单碱基重复，2万多二碱基重复序列，三碱基重复序列近2万条，四碱基重复序列近3万条，五碱基重复系列1万多条，六碱基重复序列2千多条。

[0046] 选取三碱基以上重复位点，设计了274对引物序列，其中三碱基86对，四碱基72对，五碱基116对。从以上274对引物中最终筛选出稳定且富有多态性的绿尾虹雉微卫星引物12对，建立了这些标记相应的基因分型技术，并可实现绿尾虹雉的亲缘关系鉴定。

[0047] 筛选的具体步骤为：

[0048] ①引物预处理：将装有合成好的引物的EP管，分别加入适量的超纯水配成浓度为50pmol/μL的溶液，混匀后，放于‑20℃的冰箱，备用；

[0049] ②初步筛选能够进行PCR扩增的引物：将随机选取的3个绿尾虹雉个体的DNA，作为模板，利用合成的微卫星引物进行PCR筛选；反应体系为：在10μL体系中，10×Buffer 1μL，25mM MgCl20.8μL，dNTP Mix 0.2μL，正向引物和反向引物10μmol/L各0.2μL，Taq酶0.2μL，DNA 10ng，双纯水补足到10μL。

[0050] 反应程序：95℃预热10min；94℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃10分钟；4℃保存；

[0051] ③用琼脂糖电泳检测步骤②中引物扩增后的产物：PCR反应的产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，从电泳图片上判定PCR产物的大小以及引物的适用性；

[0052] ④对扩增效果清楚的引物，分成三组，分别在生物公司合成带荧光标记6‑FAM、HEX或TAMRA的荧光引物；

[0053] ⑤再次对荧光标记后的引物进行筛选，反应体系同步骤②；

[0054] ⑥用琼脂糖电泳检测步骤④中引物扩增后的产物：PCR反应的产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果判断PCR产物的大小以及引物的适用性；

[0055] ⑦选用6只绿尾虹雉个体，采用步骤⑥中筛选出来的微卫星引物，按步骤②中的反应条件进行PCR扩增，反应产物送公司进行分型检测，根据分型结果判断引物适用性。

[0056] 实施例2

[0057] 采用QIAMP 69506血液/组织微量试剂盒操作手册提取蜂桶寨国家级自然保护区绿尾虹雉圈养种群内2018年3个圈舍内所生蛋壳(孵化完成或死胎)DNA共6份，提取方法同实施例1。使用了12对微卫星引物(表1)。PCR反应条件同实施例1，每个反应重复3次以上，以保证结果的一致性。

[0058] 表1引物

[0059]

[0060]

[0061] 采用一代基因测序仪对以上PCR产物进行基因分型，其微卫星分型数据(扩增片段长度)见表2。

[0062] 表2微卫星分型数据(扩增片段长度bp)

[0063]

[0064] 用软件ML‑Relate对以上6份样品分别进行亲缘关系鉴定，其分析结果见表3。其中HS(Half Sibling)代表半胞关系，FS(Full Sibluing)代表全胞关系，U(Unrelated)代表无亲缘关系。

[0065] 表3亲缘关系鉴定分析结果

[0066]  DK1 DK2 DK3 DK4 DK5 DK6
DK1 ‑          
DK2 HS ‑        
DK3 U U ‑      
DK4 HS U U ‑    
DK5 U U U U ‑  
DK6 U U U U FS ‑

[0067] 根据以上分析结果，整理出的绿尾虹雉同圈舍蛋间亲缘关系及与记录的比对见表4。

[0068] 表4亲缘关系

[0069]

[0070]

[0071] 其中房间3鉴定结果与生产记录；鉴定出房间1中两只蛋不是同胞关系，而是半胞关系，至于是同父还是同母尚待取到父母样本才能进一步判断；鉴定出了房间2中生产的两只蛋是非亲关系，而非记录上登记的同胞关系；同时鉴定出了房间1与房间2的两只蛋DK01与DK04来自同一个父亲，指出了记录错误。

[0072] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。