白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记、特异性引物及鉴定方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记、特异性引物及鉴定方法。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。所述鉴定方法包括如下步骤：提取待测灵芝样品DNA为模板，以特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R进行PCR扩增反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在750bp～800bp之间出现特异性条带的样品为白肉灵芝优质菌株I140033。本发明有利于白肉灵芝优质菌株I140033在产业化应用过程中的鉴定与保护。

权利要求

1.一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，其特征在于所述白肉灵芝优质菌株I140033为Ganoderma leucocontextum HMGIM‑I140033，于2021年3月29日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61579；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述鉴定方法包括如下步骤：提取待测灵芝样品DNA为模板，以特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R进行PCR扩增反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在750bp～800bp之间出现特异性条带的样品为白肉灵芝优质菌株I140033；

所述特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R的核苷酸序列如下所示：sca13_92_F：ATGAGGACGAGGTCAGACCA；

sca13_92_R：GTGGCACCAAGACGTCAAAC。

2.根据权利要求1所述的一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增反应体系如下：Taq PCR Master Mix 12.5μL；

引物sca13_92_F，10μmol/L，1μL；

引物sca13_92_R，10μmol/L，1μL；

ddH2O 9.5μL；

DNA模板1μL。

3.根据权利要求2所述的一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增反应程序如下：步骤1：95℃5min；

步骤2：95℃30sec；

步骤3：55℃30sec；

步骤4：72℃1min；

步骤5：重复步骤2～4，35个循环；

步骤6：72℃10min。

4.根据权利要求1～3任一项所述的一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，其特征在于所述琼脂糖凝胶电泳检测步骤为：将PCR产物及DNA Marker点样于2％的琼脂糖凝胶，80V电压下电泳30min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观察。

说明书

白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记、特异性引物及鉴定

方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记、特异性引物及鉴定方法。

背景技术

[0002] 灵芝是我国最重要的药用菌之一，已有两千年多年的记载和使用历史。古籍记载灵芝具有“久食轻身不老，延年神仙”，是世人皆知的人间“仙草”。现代医学研究已证实，灵
芝含有300余种化合物，具有生理活性的成分主要是灵芝多糖、三萜类化合物、核苷类、甾醇
等，灵芝及其提取物具有免疫调节、抗肿瘤、保肝解毒、降血糖等功效。目前已被中国药典及
美国药典所收录。白肉灵芝[Ganoderma leucocontextum T.H.Li etal.]是本课题组核心
成员采集并参与发表的中国西南地区灵芝属的一个重要新物种，在林芝地区分布广泛，通
常夏秋季节散生、群生于青冈树近树干基部的腐木上，宏观形态与市场上的灵芝
[G.lucidum (W.Cur.Fr.)Karst.]和四川灵芝[G.sichuanense J.D.Zhao&X.Q.Zhang]很相
近，因此极易混淆使用。在未被学术界认定为新种前，当地常以“白灵芝”、“藏灵芝”等名称
区别于灵芝和四川灵芝，由于其多糖和三萜类化合物含量比其他灵芝要高数倍，因此售价
更为高昂。现有的细胞和动物实验已经验证，白肉灵芝具有降血糖、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒
等功效，巨大的商业应用和科研价值，推动了白肉灵芝人工驯化的栽培，目前西藏全区已经
实现白肉灵芝的规模化人工栽培。菌种的质量决定着栽培的产量和性状，本课题组经过多
年的野生食药用菌资源调查，得到了一大批白肉灵芝菌种，经过筛选、选育和试种，获得了
数株性状优良的菌种，其中I140033菌株经试种发现其菌丝生物学特征和栽培农艺性状优
异，与其他白肉灵芝菌株相比，I140033菌株的菌丝长速较快，栽培子实体菇型稳定，产量较
高，具有规模化应用潜力。由于大型真菌菌种极易被复制，为保护产权，需要利用分子生物
学技术对优质菌种开展分子标记，以为其产业化应用奠定保护的基础。

发明内容

[0003] 基于以上现有技术，本发明的首要目的在于提供一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记。

[0004] 本发明的另一目的在于提供上述白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的特异性引物。

[0005] 本发明的再一目的在于提供上述白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法。

[0006] 本发明目的通过以下技术方案实现：

[0007] 一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记，所述白肉灵芝优质菌株I140033为 Ganoderma leucocontextum HMGIM‑I140033，于2021年3月29日保藏至广东省微生物菌种
保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61579，保藏地址：广州市先烈中路100号；所述分子标记的
核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0008] 上述白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的特异性引物，所述特异性引物为sca13_92_F 和sca13_92_R，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

[0009] sca13_92_F：ATGAGGACGAGGTCAGACCA(SEQ ID NO：2)；

[0010] sca13_92_R：GTGGCACCAAGACGTCAAAC(SEQ ID NO：3)。

[0011] 上述白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，包括如下步骤：

[0012] 提取待测灵芝样品DNA为模板，以特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R进行PCR扩增反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在750bp～800bp之间出现特异性条带的样品为
白肉灵芝优质菌株I140033。

[0013] 进一步地，所述PCR扩增反应体系如下：

[0014] Taq PCR Master Mix(生工B110006)12.5μL；

[0015] 引物sca13_92_F(10μmol/L)1μL；

[0016] 引物sca13_92_R(10μmol/L)1μL；

[0017] ddH2O 9.5μL；

[0018] DNA模板1μL。

[0019] 进一步地，所述PCR扩增反应程序如下：

[0020] 步骤1：95℃5min；

[0021] 步骤2：95℃30sec；

[0022] 步骤3：55℃30sec；

[0023] 步骤4：72℃1min；

[0024] 步骤5：重复步骤2～4，35个循环；

[0025] 步骤6：72℃10min。

[0026] 进一步地，所述琼脂糖凝胶电泳检测条件为：将PCR产物及DNA Marker点样于2％(质量体积比)的琼脂糖凝胶，80V电压下电泳30min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观
察。

[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0028] (1)本发明提供的分子标记为白肉灵芝优质菌株I140033的特异性核酸序列，利用该特异性核酸序列能够将I140033菌株与其他白肉灵芝菌株区分开来。有利于白肉灵芝优
质菌株 I140033在产业化应用过程中的鉴定与保护。

[0029] (2)本发明进一步开发的特异性引物能够有效扩增白肉灵芝优质菌株I140033的特异性核酸序列，为白肉灵芝优质菌株I140033的筛选与鉴定提供了一种简单快速的方法。

附图说明

[0030] 图1为实施例2中采用特异性引物对33株白肉灵芝菌株样品进行PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

[0031] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0032] 实施例1

[0033] 本实施例特异性引物的获得：

[0034] 将经过形态及分子生物学鉴定、低温保藏的白肉灵芝菌株共33株(来自西藏地区，通过野外资源采集和分离获得，见下表1)经25℃培养活化，转接至PDA平板，待培养结束后
收集新鲜菌丝体，使用DNA抽提试剂盒提取各菌株的总DNA，使用真菌通用引物ITS1 
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG，SEQ ID NO：4)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC， SEQ ID NO：5)完成
PCR实验，扩增产物送检测序，将测序结果与模式种ITS序列比对完成鉴定，确定为白肉灵
芝。然后开展全基因组重测序，即各样品基因组DNA经超声波处理后形成随机片段，然后，对
片段化的DNA进行末端修复、3′端加A、连接测序接头后，再利用磁珠吸附进行富集，富集
400bp左右的随机片段，经过PCR扩增形成测序文库。建好的文库先进行文库质检，质检合格
TM
的文库用Illumina Hiseq 平台进行测序，测序策略为Illumina PE150，总测序读长为
TM
300bp。在Illumina Hiseq 测序数据(Raw Data)下机之后，对下机数据进行质量控制，过滤
其中低质量的数据，获得高质量的数据(Clean Data)。利用BWA软件将Clean Data比对到本
课题组前期自测的基因组序列上，获得序列的位置归属即BAM文件。利用GATK软件对BAM文
件进行校正，完成SNP检测，根据各样本的SNP差异位点完成特异性引物的设计，经过筛选和
PCR验证，获得一对特异性引物sca13_92_F： ATGAGGACGAGGTCAGACCA(SEQ ID NO：2)/
sca13_92_R： GTGGCACCAAGACGTCAAAC(SEQ ID NO：3)。

[0035] 表1.白肉灵芝菌株表

[0036]

[0037]

[0038] 实施例2

[0039] 使用实施例1获得的特异性引物对33株样品进行PCR实验：

[0040] 使用DNA抽提试剂盒提取如表1所示33株白肉灵芝菌株的DNA为模板，采用实施例1 获得的特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R进行PCR扩增反应。

[0041] 其中PCR反应体系：

[0042] Taq PCR Master Mix(生工B110006)12.5μL；

[0043] 引物sca13_92_F(10μmol/L)1μL；

[0044] 引物sca13_92_R(10μmol/L)1μL；

[0045] ddH2O 9.5μL；

[0046] DNA模板1μL。

[0047] PCR反应程序：

[0048] 步骤1：95℃5min；

[0049] 步骤2：95℃30sec；

[0050] 步骤3：55℃30sec；

[0051] 步骤4：72℃1min；

[0052] 步骤5：重复步骤2～4，35个循环；

[0053] 步骤6：72℃10min；

[0054] 结束。

[0055] 将PCR产物及DNA Marker(2Kbp，生工B500350，包括分子量为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp的核酸片段)点样于2％(质量体积比)的琼脂糖凝胶，80V电压
下电泳 30min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观察，结果如图1所示。其中I140033样品
呈现出唯一一条特异性条带，大小介于750～800bp。经该条带切胶回收送检测序，所测序列
如SEQ ID NO：1所示，共计762bp，与电泳条带的大小吻合。因测序仪器的原因，不同的测序
仪测得该特异性条带的长度可能有所差异，但会介于750bp到800bp之间。

[0056] 由以上结果可知，采用本发明的特异性引物及方法能够将白肉灵芝优质菌株I140033与其他菌株区分开来。

[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。