体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法

摘要

本发明涉及药物分析方法技术领域，是一种体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法，包括氧化型同型半胱氨酸和待筛选酶的反应条件、色谱分析前的样品前处理以及测定同型半胱氨酸的高效液相色谱分析方法。本发明既省去了血浆样品前处理的繁琐步骤，使用该筛选体系可快速、准确的初步筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶，为开发预防和治疗高同型半胱氨酸血症潜在药物提供新思路和新方法，为体外筛选预防和治疗高同型半胱氨酸潜在药物提供了借鉴和参考；在现有测定同型半胱氨酸的高效液相色谱技术的基础上，基于紫外检测器运用较广泛，检测灵敏度较高的优点，又建立了同型半胱氨酸的高效液相紫外检测方法，该检测方法准确、灵敏、快速，简便。

权利要求

1.一种体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)氧化型同型半胱氨酸溶液与待筛选蒜酶溶液进行反应，反应温度为35℃，反应时间为10min，反应结束后降至室温；

(2)在步骤(1)反应结束后得到的溶液中加入还原剂进行还原反应，还原剂和氧化型同型半胱氨酸的比例为1:2，还原反应温度为37℃，还原反应时间为10min，还原反应结束后降至室温；其中，还原剂为三(2‑羧乙基)膦盐酸盐；

(3)在步骤(2)还原反应结束后得到的溶液中加入衍生剂进行衍生化反应，衍生剂和还原型同型半胱氨酸的比例为1:8，衍生化反应温度为70℃，衍生化反应时间为60min，衍生化反应结束后冷却10min；其中，衍生剂为7‑氟苯呋咱‑4‑硫酸铵盐；

(4)以步骤(3)冷却得到的溶液作为反应后样品溶液，将磷酸盐缓冲液替代待筛选蒜酶依序经过步骤(1)至(3)的处理后得到空白对照溶液，并以空白对照溶液作为反应前样品溶液，分别将反应前、后的样品溶液进行高效液相分析，以获得待筛选蒜酶是否能催化裂解同型半胱氨酸的结果；其中，高效液相分析采用反相液相色谱分析，色谱条件为：色谱柱选用C18色谱柱，流动相由醋酸盐缓冲液和甲醇组成，梯度洗脱，紫外检测器检测，采用外标法进行定量分析；检测波长为350nm至400nm，流动相醋酸盐缓冲液的pH为4.5，所述梯度洗脱时甲醇在0min至16min的体积变化为2％至5％，流速为0.8mL/min至1.2mL/min，柱温为25℃至

35℃。

2.根据权利要求1所述的体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法，其特征在于进行高效液相分析时，以还原型同型半胱氨酸经过步骤(3)衍生化反应后得到的溶液作为对照溶液。

3.根据权利要求1或2所述的体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法，其特征在于步骤(1)中，氧化型同型半胱氨酸溶液与待筛选蒜酶溶液，均采用磷酸盐缓冲液溶解得到。

说明书

体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物分析方法技术领域，是一种体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法。

背景技术

[0002] 同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，或称为高半胱氨酸，是体内蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物。同型半胱氨酸在血浆中存在两种形式，一种是还原型([H]‑Hcy)，结构中含有巯基，另一种是氧化型([O]‑Hcy)，其结构是还原型以二硫键所形成的。在体内约99％的同型半胱氨酸以氧化型与蛋白结合的形式存在([O]‑Hcy)，或游离的氧化型形式存在，还有约1％的同型半胱氨酸以还原型([H]‑Hcy)形式存在。

[0003] 当血浆中同型半胱氨酸水平高于15μmol/L时，即可诊断为高同型半胱氨酸血症，高水平的同型半胱氨酸能够通过各种途径直接或间接的造成血管内皮细胞损伤，增强血小板功能活性，促使血栓形成，影响低密度脂蛋白的氧化过程，诱导和促进血管平滑肌细胞增殖，现已被公认为是心脑血管疾病的独立危险因素之一。因此，寻找降低体内同型半胱氨酸的潜在药物对心血管系统疾病的诊断与防治具有重要意义。可催化裂解同型半胱氨酸的酶，通过酶的催化裂解作用降低同型半胱氨酸的浓度，可作为预防和治疗高同型半胱氨酸血症药物的种类之一。

[0004] 同型半胱氨酸的检测方法有放射免疫法、荧光偏振免疫分析法、酶联免疫吸附测定法、循环酶法、高效液相荧光检测法、高效液相电化学检测法、氨基酸分析仪检测法、气相色谱‑质谱法、液相色谱‑质谱法等，其中最常用的是高效液相荧光检测法和循环酶法。因体内同型半胱氨酸的存在形式有氧化型、还原型及其蛋白结合物等形式，其高效液相分析方法测定的都是血浆中的总同型半胱氨酸，采用加入还原剂使氧化型同型半胱氨酸都转换成还原型同型半胱氨酸，然后用巯基衍生剂进行柱前衍生化，利用衍生化同型半胱氨酸有荧光的特点，再采用荧光检测器进行检测。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法，克服了上述现有技术之不足，其首次采用氧化型同型半胱氨酸直接参与可催化裂解同型半胱氨酸的酶的筛选，省去了以血浆样品(例如高同型半胱氨酸血浆样品)筛选可催化裂解酶的前处理繁琐步骤(即对血浆样品的前处理)，因此采用本发明所述分析方法可快速、准确的初步筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶，为开发预防和治疗高同型半胱氨酸血症潜在药物提供新思路和新方法，为体外筛选预防和治疗高同型半胱氨酸潜在药物提供了借鉴和参考。

[0006] 本领域技术人员公知，血浆样品处理复杂，存在很多干扰因素，不利于快速筛选酶对同型半胱氨酸的催化裂解作用，因人体血浆中99％为氧化型同型半胱氨酸，购买的同型半胱氨酸试剂即为氧化型同型半胱氨酸，购买的同型半胱氨酸的对照品为还原型同型半胱氨酸，因此本发明以氧化型同型半胱氨酸与待筛选酶反应，再经还原和衍生化后，作为样品溶液；以磷酸盐缓冲液替代待筛选酶加入反应体系反应后作为空白对照溶液；以还原型同型半胱氨酸进行衍生化后作为对照品制作标准曲线；采用高相液相色谱法测定，可快速测定待筛选酶对同型半胱氨酸是否有催化裂解作用，并可研究酶对同型半胱氨酸催化裂解的催化动力学，未来该体外筛选方法也可做为一种同型半胱氨酸的高效液相检测新方法。本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种体外筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶的分析方法，包括以下步骤：

[0007] (1)氧化型同型半胱氨酸溶液与待筛选酶溶液进行反应，反应温度：20℃至40℃，反应时间：5min至60min，反应结束后降至室温；

[0008] (2)在步骤(1)反应结束后得到的溶液中加入还原剂进行还原反应，还原剂和氧化型同型半胱氨酸的比例为1:1至1:8，还原反应温度：25℃至50℃，还原反应时间：10min至60min，还原反应结束后降至室温；

[0009] (3)在步骤(2)还原反应结束后得到的溶液中加入衍生剂进行衍生化反应，衍生剂和还原型同型半胱氨酸的比例为1:1至1:16，衍生化反应温度为60℃至100℃，衍生化反应时间为50min至100min，衍生化反应结束后冷却10min；

[0010] (4)以步骤(3)冷却得到的溶液过滤膜后作为反应后样品溶液(供试品溶液)，将磷酸盐缓冲液替代待筛选酶依序经过步骤(1)至(3)的处理后得到空白对照溶液，并以空白对照溶液作为反应前样品溶液，分别将反应前、后的样品溶液进行高效液相分析，以获得待筛选酶是否能催化裂解同型半胱氨酸的结果。

[0011] 本发明所述分析方法中的步骤(1)至(3)提供了同型半胱氨酸和待筛选酶的反应条件和色谱分析前的样品前处理方法。

[0012] 下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

[0013] 上述步骤(1)中，氧化型同型半胱氨酸溶液与待筛选酶溶液的反应温度优选35℃，氧化型同型半胱氨酸溶液与待筛选酶溶液的反应时间优选10min。

[0014] 上述还原剂和氧化型同型半胱氨酸的优选为1:2；还原剂优选三(2‑羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。

[0015] 上述步骤(2)中，还原反应温度优选为37℃，还原反应时间优选为10min。

[0016] 上述步骤(3)中，衍生剂和还原型同型半胱氨酸的比例优选1:8，衍生化反应温度优选70℃，衍生化反应时间优选60min；衍生剂优选为7‑氟苯呋咱‑4‑硫酸铵盐(SBD‑F)。

[0017] 上述进行高效液相分析时，以还原型同型半胱氨酸经过步骤(3)衍生化反应后得到的溶液作为对照溶液。

[0018] 上述步骤(1)中，氧化型同型半胱氨酸溶液与待筛选酶溶液，均采用磷酸盐缓冲液溶解得到。

[0019] 上述步骤(4)中，高效液相分析采用反相液相色谱分析，色谱条件为：色谱柱选用C18色谱柱，流动相由醋酸盐缓冲液和甲醇组成，梯度洗脱，紫外检测器检测，采用外标法进行定量分析：具体地，

[0020] 本发明还提供了一种测定同型半胱氨酸的高效液相色谱分析方法，色谱条件为：

[0021] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，规格(4.6mm×250mm，5μm)；

[0022] 流动相：A相为pH＝4.5的醋酸盐缓冲液，B相为甲醇；

[0023] 梯度洗脱：B相的体积变化为0～16min 2％至5％；

[0024] 流速：0.8ml/min至1.2ml/min，优选0.8ml/min；

[0025] 柱温：25℃至35℃，优选25℃；

[0026] 进样量：20μL至50μL，优选20μL；

[0027] 检测器：紫外检测器；

[0028] 检测波长：350nm至400nm，优选384nm。

[0029] 本发明的有益效果：既省去了血浆样品前处理的繁琐步骤，使用该筛选体系可快速、准确的初步筛选可催化裂解同型半胱氨酸的酶；在现有测定同型半胱氨酸的高效液相色谱技术的基础上，基于紫外检测器运用较广泛，检测灵敏度较高的优点，又建立了同型半胱氨酸的高效液相紫外检测方法，该检测方法准确、灵敏、快速，简便。

附图说明

[0030] 附图1为衍生化[H]‑Hcy的标准曲线。

[0031] 附图2为蒜酶与[O]‑Hcy反应前后的高效液相色谱图。

[0032] 附图3为蒜酶催化裂解[O]‑Hcy反应中，底物浓度对酶促反应速度的影响(pH5.5)。

[0033] 附图4为蒜酶催化裂解[O]‑Hcy反应中，底物浓度对酶促反应速度的影响(pH6.8)。

[0034] 附图5为蒜酶催化裂解[O]‑Hcy反应中，不同底物浓度与相应反应速率双倒数拟合直线图(pH5.5)。

[0035] 附图6为蒜酶催化裂解[O]‑Hcy反应中，不同底物浓度与相应反应速率双倒数拟合直线图(pH5.5)。

[0036] 表2中，A曲线是[O]‑Hcy与蒜酶反应前溶液的HPLC的色谱图峰，B曲线是[O]‑Hcy与蒜酶反应后溶液的色谱图峰。

具体实施方式

[0037] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。

[0038] 为使得本发明能够更好的被应用于筛选可降解Hcy的酶，以下结合具体的实例，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，以下所描述的实施例，仅为运用本发明筛选酶的部分实施例，而非全部的实施例。

[0039] 以下实施例中采用的蒜酶为新疆埃乐欣药业有限公司所生产的蒜酶冻干粉。

[0040] 以下实施例中采用的[H]‑Hcy对照品、[O]‑Hcy等试剂均为市售。

[0041] 下面结合实施例对本发明作进一步描述：

[0042] 实施例1：筛选蒜酶对同型半胱氨酸的催化裂解作用

[0043] 实验步骤：

[0044] 1溶液配制

[0045] 精密称定[H]‑Hcy对照品27mg置于100mL容量瓶中，以磷酸盐缓冲液溶解定容，得320μmol/L对照品储备溶液；[O]‑Hcy加磷酸盐缓冲液溶解，得1mmol/L的[O]‑Hcy溶液。

[0046] 蒜酶适量置于量瓶中，加pH 7.0磷酸盐缓冲液，涡旋使溶解，摇匀，得蒜酶溶液。

[0047] 2色谱条件

[0048] 色谱柱：Waters公司XBridge C18(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长：384nm，流动相：A相，pH＝4.5的醋酸盐缓冲液；B相，甲醇；梯度洗脱：B相的体积变化为0‑16min2％至5％；流速为0.8mL/min，柱温25℃，进样量20μL。

[0049] 3制作标准曲线

[0050] 将[H]‑Hcy对照品储备液并一进步加磷酸盐缓冲液稀释，得4、10、20、40、80、160μmol/L的标准溶液，分别量取上述不同浓度的标准溶液，加入SBD‑F工作液，在70℃水浴反应60min，冷却10min，过滤膜后分别注入液相色谱仪进行测定，以衍生化[H]‑Hcy为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，标曲方程为Y＝6034.9X‑73769，r＝0.9990，在浓度为4μmol/L至160μmol/L范围内线性良好(见图1)。

[0051] 4样品前处理

[0052] 取1mmol/L[O]‑Hcy溶液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06mL，分别加入蒜酶溶液0.4mL，于35℃水浴反应10min；分别加入TCEP溶液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06mL，37℃水浴反应10min；再分别加入SBD‑F储备液0.12、0.24、0.36、0.48、0.60和0.72mL，70℃水浴反应60min后冷却10min，作为供试品溶液备用。另以磷酸盐缓冲液替代蒜酶溶液加入反应体系，作为空白对照。

[0053] 5测定蒜酶是否对同型半胱氨酸有催化裂解作用

[0054] 将经样品预处理后制备的供试品溶液作为蒜酶与[O]‑Hcy反应后的溶液，空白对照为蒜酶与[O]‑Hcy反应前溶液，进行高效液相测定(见图2)，分别测定其中[H]‑Hcy的含量，结果见下表1。

[0055] 由表1可知蒜酶可使不同浓度的[H]‑Hcy含量在反应后有所降低，表明蒜酶对Hcy有一定的催化裂解作用。

[0056] 实施例2：蒜酶对同型半胱氨酸的催化动力学

[0057] 1反应时间对酶促反应的影响

[0058] 蒜酶溶液0.4mL，加入1mmol/L[O]‑Hcy溶液0.1mL，立即置35℃水浴中准确反应5、10和15min，按样品前处理方法处理之后微孔滤膜过滤，取20μL注入液相色谱仪，计算供试品中[H]‑Hcy的含量，确定最佳反应时间，结果见下表2。

[0059] 由表2得知，随着[O]‑Hcy与蒜酶反应时间的延长，转化率却不再变化，故选择反应时间为10min。

[0060] 2[O]‑Hcy、蒜酶配比

[0061] 量取[O]‑Hcy 0.1mL及不同浓度蒜酶溶液0.4mL，立即置35℃水浴中准确反应10min，按样品前处理方法处理之后微孔滤膜过滤，取20μL注入液相色谱仪，计算供试品中[H]‑Hcy的含量，确定[O]‑Hcy、蒜酶的最佳配比，结果见下表3。

[0062] 表3数据显示，[O]‑Hcy：蒜酶＝1：6.0时，即6.0U的蒜酶可催化裂解1μg的[O]‑Hcy，转化率可达到80％以上。

[0063] 3底物([O]‑Hcy)浓度对酶促反应初速度的影响

[0064] 蒜酶溶液0.4mL，加入不同浓度的[O]‑Hcy溶液0.1mL，立即置35℃水浴中准确反应10min，按样品预处理方法处理之后微孔滤膜过滤，取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取[H]‑Hcy对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中[H]‑Hcy的含量，按下式计算反应速度，以反应速度V对相对应的底物浓度作图，在直线范围内作趋势线，其斜率即酶促反应的初速度(V0)。

[0065] 当磷酸盐缓冲液的pH为5.5时，在0‑129.25μmol/L范围内，趋势线斜率为初速度，即V0＝0.09μmol/(L·min)(见图3)。

[0066] 当磷酸盐缓冲液的pH为6.8时，在0‑64.78μmol/L范围内，趋势线斜率为初速度，即V0＝0.09μmol/(L·min)(见图4)。

[0067] 4蒜酶动力学常数的测定

[0068] 以反应速度的倒数为纵坐标，[H]‑Hcy浓度的倒数为横坐标用双倒数作图法(Lineweaver–Burk)作图，该酶的Km＝4710μmol/L，Vmax＝384.62μmol/(L·min)，回归方程(见图5)：Y＝12.248X－0.0026(r＝0.9997)。当磷酸盐缓冲液的pH为6.8时，该酶的Km＝316.78μmol/L，Vmax＝22.03μmol/L·min，回归方程(见图6)：Y＝14.382X－0.0454(r＝
0.9994)。

[0069] 上述实施例证明，本发明所述分析方法可快速、准确的筛选出对同型半胱氨酸有催化裂解作用的酶，并研究其催化动力学，操作简单，结果准确，对筛选可预防和治疗高同型半胱氨酸血症的潜在药物具有重要意义。

[0070] 以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

[0071] 表1蒜酶对氧化型同型半胱氨酸的催化裂解作用

[0072]

[0073] 表2反应时间对酶促反应的影响结果

[0074] 反应时间/min 转化率/％ RSD/％5 50.46 1.41
10 50.95 1.96
15 49.66 1.29

[0075] 表3[O]‑Hcy、蒜酶的配比对转化率的影响

[0076] 配比(μg：U) 转化率(％) RSD(％)1：0.8 25.38 1.15
1：1.2 35.54 1.71
1：2.4 46.17 2.20
1：4.8 77.32 1.68
1：6.0 82.78 0.25
1：8.0 80.59 1.42
1：10.0 82.37 1.99