本发明的目的在于提供一种牙髓干细胞冻存保护液和牙髓干细胞冻存方法，属于干细胞冻存技术领域。本发明所提供的保护液包括如下组分：40%DMEM/F12，50%FBS，10%DMSO，2.5mg/ml‑10mg/ml海雹菜多糖。本发明的有益效果在于，使用本发明冻存保护液进行牙髓干细胞冻存时，不仅可以有效的维持牙髓干细胞的活性，而且可以使牙髓干细胞具有更好的干性和成骨能力。
1.一种牙髓干细胞冻存保护液，其特征在于，所述保护液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，2.5mg/ml‑10mg/ml海雹菜多糖；
所述海雹菜多糖的制备方法包括如下步骤：（1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
（2）称取一定量的海雹菜粉末，加入20倍量的水，浸泡24h；
（3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
（4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至原体积10%，加入3倍量的95%乙醇，醇沉12h；
（5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
（6）加水溶解海雹菜粗多糖后加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖。
2.根据权利要求1所述的保护液，其特征在于，所述保护液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，5mg/ml海雹菜多糖。
3.一种用于牙髓干细胞冻存保护液的海雹菜多糖，其特征在于，所述海雹菜多糖的制备方法包括如下步骤：
（1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
（2）称取一定量的海雹菜粉末，加入20倍量的水，浸泡24h；
（3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
（4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至原体积10%，加入3倍量的95%乙醇，醇沉12h；
（5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
（6）加水溶解海雹菜粗多糖，加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖；
所述海雹菜多糖在牙髓干细胞冻存保护液中用于维持牙髓干细胞活性；
所述海雹菜多糖在牙髓干细胞冻存保护液中用于维持Oct4和Sox2基因表达；
所述海雹菜多糖在牙髓干细胞冻存液中用于维持牙髓干细胞成骨能力。
4.一种用于牙髓干细胞冻存保护液的海雹菜多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
（2）称取一定量的海雹菜粉末，加入20倍量的水，浸泡24h；
（3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
（4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至原体积10%，加入3倍量的95%乙醇，醇沉12h；
（5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
（6）加水溶解海雹菜粗多糖后加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖。
5.海雹菜多糖在制备牙髓干细胞活性维持剂中的应用，其特征在于，所述海雹菜多糖由以下制备方法制备得到：
（1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
（2）称取一定量的海雹菜粉末，加入20倍量的水，浸泡24h；
（3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
（4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至原体积10%，加入3倍量的95%乙醇，醇沉12h；
（5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
（6）加水溶解海雹菜粗多糖后加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖。
一种牙髓干细胞冻存保护液和牙髓干细胞冻存方法
技术领域
[0001] 本发明属于干细胞冻存技术领域，尤其涉及一种牙髓干细胞冻存保护液和牙髓干细胞冻存方法。
背景技术
[0002] 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。其中，牙髓干细胞是来源于牙髓腔内软组织的一类干细胞，其具有良好的增殖和分化能力。由于牙髓干细胞具有采集
方便，来源丰富，具有多向分化潜能，免疫原性低等优点，因此其在再生医学和组织工程修
复中被广泛的应用。
[0003] 伴随着干细胞的广泛应用，干细胞的冻存问题也逐渐成为了研究的热点。目前，牙髓干细胞主要用于成骨分化来修复牙齿，但是，目前尚无一种干细胞冻存液专门用于保存
牙髓干细胞使其保持活性的同时，更好的保持其干性和成骨能力。
[0004] 海雹菜是蓝藻门,藻殖段纲,念珠藻目,鞭枝藻科,海雹菜属的一种藻类，目前常用于食用或是治疗水肿。当前，尚无关于海雹菜多糖用于牙髓干细胞冻存液的相关内容。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种专用于牙髓干细胞的一种牙髓干细胞冻存保护液和牙髓干细胞冻存方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了一种牙髓干细胞冻存保护液，所述保护液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，2.5mg/ml‑10mg/ml海雹菜多糖。
[0007] 优选地，所述保护液包括如下组分：40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，5mg/ml海雹菜多糖。
[0008] 优选地，所述海雹菜多糖的制备方法包括如下步骤：
[0009] （1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
[0010] （2）称取一定量的海雹菜粉末，加入20倍量的水，浸泡24h；
[0011] （3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
[0012] （4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至原体积10%，加入3倍量的95%乙醇，醇沉12h；
[0013] （5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
[0014] （6）加水溶解海雹菜粗多糖后加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖。
[0015] 此外，本发明提供了一种用于牙髓干细胞冻存保护液的海雹菜多糖，所述海雹菜多糖的制备方法包括如下步骤：
[0016] （1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
[0017] （2）称取一定量的海雹菜粉末，加入20倍量的水，浸泡24h；
[0018] （3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
[0019] （4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至原体积10%，加入3倍量的95%乙醇，醇沉12h；
[0020] （5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
[0021] （6）加水溶解海雹菜粗多糖后加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖；
[0022] 所述海雹菜多糖在牙髓干细胞冻存保护液中用于维持牙髓干细胞活性；
[0023] 所述海雹菜多糖在牙髓干细胞冻存液中用于维持牙髓干细胞成骨转化能力。
[0024] 此外，本发明提供了一种用于牙髓干细胞冻存保护液的海雹菜多糖的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0025] （1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
[0026] （2）称取一定量的海雹菜粉末，加入20倍量的水，浸泡24h；
[0027] （3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
[0028] （4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至原体积10%，加入3倍量的95%乙醇，醇沉12h；
[0029] （5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
[0030] （6）加水溶解海雹菜粗多糖后加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖。
[0031] 此外，本发明提供了海雹菜多糖在制备牙髓干细胞活性维持剂中的应用。
[0032] 此外，本发明提供了海雹菜多糖在制备牙髓干细胞Oct4和Sox2基因表达维持剂中的应用。
[0033] 此外，本发明提供了海雹菜多糖在制备牙髓干细胞成骨转化维持剂中的应用。
[0034] 优选地，所述海雹菜多糖由以下制备方法制备得到：
[0035] （1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
[0036] （2）称取一定量的海雹菜粉末，加入20倍量的水，浸泡24h；
[0037] （3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
[0038] （4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至原体积10%，加入3倍量的95%乙醇，醇沉12h；
[0039] （5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
[0040] （6）加水溶解海雹菜粗多糖后加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖。
[0041] 除此之外，本发明提供了一种牙髓干细胞冻存方法，所述方法包括如下步骤：
[0042] （1）按照40% DMEM/F12，50% FBS，10% DMSO，2.5mg/ml‑10mg/ml海雹菜多糖的百分比配置冻存保护液，过滤除菌后得到牙髓干细胞冻存保护液；
[0043] （2）将牙髓干细胞与所述牙髓干细胞冻存保护液在冻存管中混合，置于冻存盒中，置于‑80℃冰箱过夜，之后转移至液氮中保存。
[0044] 本发明的有益效果是：
[0045] 本发明提供了一种用于牙髓干细胞冻存的细胞冻存液，使用本发明冻存液进行牙髓干细胞冻存时，不仅可以有效的维持牙髓干细胞的活性，而且可以使牙髓干细胞具有更
好的干性和成骨能力。
附图说明
[0046] 图1 实施例2和实施例4冻存细胞中Sox2和Oct4基因的表达水平；
[0047] 图2 实施例2和实施例4冻存细胞的ALP酶染色结果和定量结果。
具体实施方式
[0048] 为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
[0049] 实施例1
[0050] （1）将海雹菜洗净烘干，使用粉碎机进行粉碎，得到海雹菜粉末；
[0051] （2）称取100g的海雹菜粉末，加入2000ml的水，浸泡24h；
[0052] （3）过滤除去残渣后，将上清液置于离心机中，4000r/min离心20min，收集上清；
[0053] （4）使用旋转蒸发器将上清加压浓缩至200ml，加入600ml 95%乙醇，醇沉12h；
[0054] （5）置于离心机中,4000r/min离心20min，去除上清，得到海雹菜粗多糖；
[0055] （6）加水溶解海雹菜粗多糖后加入Sevage试剂脱蛋白，4000r/min离心20min，重复3次，减压浓缩，冷冻干燥得到海雹菜多糖。
[0056] 实施例2
[0057] （1）按照如下配方配置冻存保护液:400ul DMEM/F12,500ul FBS,100ul DMSO，过滤除菌；
[0058] （2）将1×106个人牙髓干细胞与1ml冻存保护液混合，置于冻存盒中，置于‑80℃冰箱过夜，之后转移至液氮中保存。
[0059] 实施例3
[0060] （1）按照如下配方配置冻存保护液:400ul DMEM/F12,500ul FBS,100ul DMSO，加入2.5mg海雹菜多糖，过滤除菌；
[0061] （2）将1×106个人牙髓干细胞与1ml冻存保护液混合，置于冻存盒中，置于‑80℃冰箱过夜，之后转移至液氮中保存。
[0062] 实施例4
[0063] （1）按照如下配方配置冻存保护液:400ul DMEM/F12,500ul FBS,100ul DMSO，加入5mg海雹菜多糖，过滤除菌；
[0064] （2）将1×106个人牙髓干细胞与1ml冻存保护液混合，置于冻存盒中，置于‑80℃冰箱过夜，之后转移至液氮中保存。
[0065] 实施例5
[0066] （1）按照如下配方配置冻存保护液:400ul DMEM/F12,500ul FBS,100ul DMSO，加入7.5mg海雹菜多糖，过滤除菌；
[0067] （2）将1×106个人牙髓干细胞与1ml冻存保护液混合，置于冻存盒中，置于‑80℃冰箱过夜，之后转移至液氮中保存。
[0068] 实施例6
[0069] （1）按照如下配方配置冻存保护液:400ul DMEM/F12,500ul FBS,100ul DMSO，加入10mg海雹菜多糖，过滤除菌；
[0070] （2）将1×106个人牙髓干细胞与1ml冻存保护液混合，置于冻存盒中，置于‑80℃冰箱过夜，之后转移至液氮中保存。
[0071] 实验例1
[0072] 存活率检测
[0073] （1）实施例2‑6冻存12个月后，置于37℃水浴锅中进行细胞复苏；
[0074] （2）使用台酚蓝进行染色，计算细胞存活率，每个实施例重复3次，所得结果如下表：
[0075] 组别 复苏后存活率 P值实施例2 79.82±2.76
实施例3 87.10±3.14 0.0399
实施例4 93.50±3.29 0.0054
实施例5 94.62±2.53 0.0024
实施例6 94.47±2.56 0.0026
[0076] 从上表中可以看出，相较于实施例2，实施例3‑6的细胞存活率显著升高，且差异均具有统计学意义，说明本发明添加的海雹菜多糖能够有效的维持人牙髓干细胞的活性。其
中，实施例3,4,5的存活率差异之间无统计学意义，因此，本发明得出5mg/ml海雹菜多糖为
最适浓度。
[0077] 实验例2
[0078] Oct4和Sox2基因表达水平检测
[0079] （1）将按照实施例2和实施例4方法冻存12个月的细胞置于37℃水浴锅中进行细胞复苏；
[0080] （2）复苏后将P6代人牙髓干细胞接种于6孔细胞培养板中，按照Trizol说明书提取RNA，检测RNA质量和浓度后用于后续实验；
[0081] （2）按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书制备cDNA；
[0082] （3）按照TAKARA荧光定量PCR试剂盒配置反应试剂：
[0083] SYBR Green Premix Ex Taq（2×） 10μl，
[0084] 正向引物 0.4μl，
[0085] 反向引物 0.4μl，
[0086] cDNA模板 2μl，
[0087] ddH2O 7.2μl。
[0088] 荧光定量PCR仪的参数设置为：95℃ 5min；95℃ 15s ，60℃ 30s 40个循环，引物序列如下：
[0089]基因名称 引物序列 产物大小
Sox2 AGATGCACAACTCGGAGATCAG，SEQ ID NO.1 131
ATAATCCGGGTGCTCCTTCATG,SEQ ID NO.2
Oct4 TGGAGGAAGCTGACAACAATGA,SEQ ID NO.3 126
GGAACAAATTCTCCAGGTTGCC,SEQ ID NO.4
β‑actin GGTCATCACCATTGGCAATGAG,SEQ ID NO.5 128
TGTCCACGTCACACTTCATGAT,SEQ ID NO.6
[0090] (4)将β‑actin作为参比基因，使用2‑△△Ct方法计算基因Sox2和Oct4的相对表达量。
[0091] 实验结果图如图1所示，其中，Sox2基因的相对表达量为1.448±0.138，Oct4的相对表达量为1.540±0.199，从上述结果可以看出，海雹菜多糖的加入更有助于人牙髓干细
胞Sox2基因和Oct4基因的表达。
[0092] 实施例3
[0093] 成骨能力检测
[0094] （1）将按照实施例2和实施例4方法冻存12个月的细胞置于37℃水浴锅中进行细胞复苏；
[0095] （2）复苏后将P6代人牙髓干细胞接种于6孔细胞培养板中，添加成骨转化培养基，进行成骨诱导；
[0096] （3）培养7天后，一部分细胞加入4%多聚甲醛固定30min，固定后，使用PBS清洗，并添加ALP酶染色液进行染色，30min后清洗细胞，进行拍照；
[0097] （4）一部分细胞加入200ul的TritonX‑100裂解细胞，30分钟后，收集细胞置于离心机中，12000r/min离心收集上清，取10ul上清于96孔板中，添加40ul ALP酶检测缓冲液和
50ul显色底物，混匀后于405nm下检测OD值，设置3个重复；
[0098] 实验结果如图2所示，其中，ALP酶的相对活性为1.387±0.076，可以看出海雹菜多糖的加入能够更好的维持人牙髓干细胞的成骨能力。
[0099] 综上所述，使用本发明冻存保护液进行人牙髓干细胞冻存时，不仅可以有效的维持人牙髓干细胞的活性，而且人牙髓干细胞具有更好的干性和成骨能力。
