丹参酮ⅡA合酶基因及应用

摘要

本发明公开了丹参中丹参酮IIA合酶的基因及其编码蛋白，以及用于生产或提高丹参酮IIA含量的方法。本发明基因是首次从丹参等多种植物中克隆得到，所编码的蛋白能够催化隐丹参酮合成丹参酮IIA，也可以催化异隐丹参酮合成异丹参酮IIA。因此本发明在生产有效的活性物质方面具有应用价值，为大规模生产丹参酮ⅡA提供新的途径，也为工业生产其他相关的丹参酮类化合物奠定了坚实的基础。

权利要求

1.丹参酮ⅡA合酶的基因TⅡAS，其核苷酸序列如下之一：

1）SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；

2）核苷酸序列一致性与SEQ ID No.1达到99%以上的来源于丹参同源基因，且编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性。

2. 根据权利要求1所述的基因TⅡAS，其特征在于：所述的丹参酮ⅡA合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7所示。

3.一种由权利要求1或2所述的基因TⅡAS编码的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8所示。

5.含有权利要求1或2所述的基因TⅡAS的重组载体。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，是表达载体。

7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，是细菌、真菌或植物表达载体。

8.含有权利要求1或2所述的基因TⅡAS或如权利要求5所述重组载体的宿主细胞，所述细胞是细菌或真菌。

9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，为大肠杆菌或酵母细胞。

10.含有权利要求1或2所述的基因TⅡAS或如权利要求3或4所述的蛋白质在生产或制备丹参酮ⅡA或异丹参酮ⅡA中的应用。

11.利用微生物发酵催化隐丹参酮生成丹参酮ⅡA，或催化异隐丹参酮生成异丹参酮ⅡA的生产方法，其特征在于，所述微生物中导入并表达如权利要求1或2所述的基因TⅡAS；培养含有表达所述基因TⅡAS的微生物，从微生物菌体中提取丹参酮ⅡA或异丹参酮ⅡA，其中培养基中添加隐丹参酮或异隐丹参酮。

12.如权利要求11所述的生产方法，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌或酵母。

13.一种提高丹参的丹参酮ⅡA含量的方法，其特征在于，将如权利要求1或2所述的基因TⅡAS导入目标丹参中，以获得过表达所述基因TⅡAS的转基因植株。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，利用所构建的含有所述基因TⅡAS的农杆菌或根癌农杆菌菌株转化丹参，获得过表达所述基因TⅡAS的转基因丹参植株或发根，其中丹参酮ⅡA的含量得到提高。

15.利用如权利要求3或4所述的蛋白质在体外生产或制备丹参酮ⅡA或异丹参酮ⅡA中的方法，其特征在于，采用如权利要求3或4所述的蛋白质催化隐丹参酮生成丹参酮ⅡA，或催化异隐丹参酮生成异丹参酮ⅡA，且反应体系中含有α‑酮戊二酸。

2+

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，反应体系中还含有Fe 和/或抗坏血酸。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，权利要求3或4所述的蛋白质通过基因工程菌发酵后提取得到的。

18. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，催化的反应体系为pH6.5的200 nM的MES，

2+

1 mM的α‑酮戊二酸，1 mM的抗坏血酸，250 μM的Fe ，1 mM的ATP和50 μg的TⅡAS蛋白，底物隐丹参酮或异隐丹参酮浓度为50μM；反应条件为20℃，180 rpm，震荡反应30 min后取出加入两倍反应体系体积的乙酸乙酯终止反应。

19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，还包括纯化丹参酮IIA或异丹参酮IIA的步骤。

说明书

丹参酮ⅡA合酶基因及应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及药用植物基因工程领域，更具体涉及参与丹参酮类化合物合成途径的基因及其应用。

背景技术

[0002] 丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)隶属唇形科(Lamiaceae)，是传统药用植物，以根和根茎入药，广泛用于治疗心脑血管及相关疾病。丹参的药用成分主要包括两类：一类是脂溶性的二萜丹参酮类化合物，另一类是水溶性的多聚酚酸类化合物。二萜丹参酮类化合物具有较强的生物活性，在丹参中含量较高。近年来对于丹参酮类的生物合成及调控研究不断获得新的进展，丹参酮类的开发利用更具有广阔的开发潜力。

[0003] 丹参酮类生物合成途径的研究对遗传育种以及合成生物学的开发具有重要的指导意义。目前丹参酮类生物合成途径的研究，除了催化GGPP生成次丹参酮二烯的CPS和KSL，多个细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)也被鉴定，包括CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1等，分别催化次丹参酮二烯生成铁锈醇及其羟基化的丹参酮类中间产物(Guo J,Ma X,Cai Y,Ma Y,Zhan Z,Zhou YJ,Liu W,Guan M,Yang J,Cui G,Kang L,Yang L,Shen Y,Tang J,Lin H,Ma X,Jin B,Liu Z,Peters RJ,Zhao ZK,Huang L(2016)Cytochrome P450 promiscuity  leads to a  bifurcating biosynthetic  pathway for tanshinones.New Phytol 210(2):525‑534.doi:10.1111/nph.13790；Guo J,Zhou YJ,Hillwig ML,Shen Y,Yang L,Wang Y,Zhang X,Liu W,Peters RJ,Chen X,Zhao ZK,Huang L(2013)CYP76AH1catalyzes turnover of miltiradiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110(29):
12108‑12113.doi:10.1073/pnas.1218061110)。最近又有三个CYP71D家族蛋白CYP71D375、CYP71D373和CYP71D411被证明参与了丹参酮的生物合成途径，其中CYP71D375催化合成隐丹参酮(Ma Y,Cui G,Chen T,Ma X,Wang R,Jin B,Yang J,Kang L,Tang J,Lai C,Wang Y,Zhao Y,Shen Y,Zeng W,Peters RJ,Qi X,Guo J,Huang L(2021)Expansion within the CYP71D subfamily drives the heterocyclization of tanshinones synthesis in Salvia miltiorrhiza.Nature communications 12(1):685.doi:10.1038/s41467‑021‑
20959‑1)。

[0004] 在丹参的二萜化合物中，丹参酮ⅡA是最重要的活性成分之一。丹参酮ⅡA磺酸钠作为药物已经被广泛应用，对心脑血管疾病、肝脏损伤等多种疾病均具有活性，最新研究表明丹参酮ⅡA可通过降低外膜肥大细胞活性缓解动脉粥样硬化(Meim X‑D,Cao Y‑F,Che Y‑Y,Li J,Shang Z‑P,Zhao W‑J,Qiao Y‑J,Zhang J‑Y(2019)Danshen:a phytochemical and pharmacological overview.Chinese Journal of Natural Medicines 17(1):59‑80.doi:10.1016/s1875‑5364(19)30010‑x；Park YK,Obiang‑Obounou BW,Lee J,Lee TY,Bae MA,Hwang KS,Lee KB,Choi JS,Jang BC(2017)Anti‑Adipogenic Effects on 3T3‑L1 Cells and Zebrafish by Tanshinone IIA.International journal of molecular sciences 18(10).doi:10.3390/ijms18102065)，但迄今催化丹参酮ⅡA合成的催化酶仍不清楚。

发明内容

[0005] 在本发明首次公开一种丹参酮ⅡA合酶基因及其编码蛋白，具体是从丹参等多种植物中克隆到一种丹参酮ⅡA合酶基因，并研究解析丹参酮ⅡA的合成途径，同时预测该基因在丹参酮ⅡA积累过程的重要作用。本发明涉及的丹参TⅡAS基因在植物如丹参和微生物体内，以及体外验证了上述功能。

[0006] 本发明提供一种丹参酮ⅡA合酶的基因TⅡAS，其核苷酸序列如下之一：

[0007] 1)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；

[0008] 2)由SEQ ID No.1通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性。

[0009] 3)核苷酸序列一致性与SEQ ID No.1达到80％以上、85％以上或90％以上，或95％以上，或99％以上的同源基因，编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶活性；优选地，来源于丹参、南丹参、美丽鼠尾草、三叶鼠尾草、红根草、甘西鼠尾草、毛地黄鼠尾草和佛光草。更优选地，所述的丹参酮ⅡA合酶基因为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。

[0010] 进而，本发明提供一种由所述的基因TⅡAS编码的蛋白质。具体地，所述的蛋白质的氨基酸序列一致性与SEQ ID No.2达到80％以上、85％以上或90％以上、95％以上或99％以上的同源蛋白，且仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性。优选地，其来源于丹参、南丹参、美丽鼠尾草、三叶鼠尾草、红根草、甘西鼠尾草、毛地黄鼠尾草和佛光草，更优选地氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16所示。

[0011] 本发明还提供含有所述的基因TⅡAS的重组载体，优选为表达载体，更具体为细菌、真菌或植物表达载体，更进一步为大肠杆菌、酵母表达载体。

[0012] 进一步提供含有所述的基因TⅡAS或所述重组载体的宿主细胞，更具体为细菌、真菌或植物细胞，更进一步为大肠杆菌、酵母细胞。

[0013] 本发明尤其提供含有所述的基因TⅡAS或所述的蛋白质在生产或制备丹参酮ⅡA或异丹参酮ⅡA中的应用。

[0014] 更进一步地，本发明提供利用微生物发酵催化隐丹参酮生成丹参酮ⅡA，或催化异隐丹参酮生成异丹参酮ⅡA的生产方法，其特征在于，所述微生物中导入并表达所述的基因TⅡAS；培养含有表达所述基因TⅡAS的微生物，例如大肠杆菌、酵母，从菌体中提取丹参酮ⅡA或异丹参酮ⅡA，其中培养基中添加丹参酮或隐丹参酮。

[0015] 另外，本发明还提供一种提高植物丹参酮ⅡA和/或异丹参酮ⅡA含量的方法，其特征在于，将如所述的基因TⅡAS导入目标植物，以获得过表达所述基因TⅡAS的转基因植株；更具体的是，利用所构建的含有所述基因TⅡAS的农杆菌或根癌农杆菌菌株转化丹参，获得过表达所述基因TⅡAS的转基因丹参植株或发根，其中丹参酮ⅡA和/或异丹参酮ⅡA的含量得到提高。

[0016] 本发明也提供利用所述的蛋白质在体外生产或制备丹参酮ⅡA或异丹参酮ⅡA的方法，采用所述的蛋白质催化隐丹参酮生成丹参酮ⅡA，或催化异隐丹参酮生成异丹参酮Ⅱ2+
A，优选地，反应体系中含有α‑酮戊二酸，更进一步含有Fe 和/或抗坏血酸；优选地所述的蛋白质通过基因工程菌发酵后提取得到的。在一个具体实施方式中，200nM的MES(pH6.5)，1mM
2+
的α‑酮戊二酸，1mM的抗坏血酸，250μM的Fe ，1mM的ATP和50μg的TⅡAS蛋白，底物隐丹参酮或异隐丹参酮浓度为50μM。反应条件为20℃，180rpm，震荡反应30min后取出加入两倍反应体系体积的乙酸乙酯终止反应。进一步地，还包括纯化丹参酮IIA或异隐丹参酮的步骤。

[0017] 在本发明首次公开一种参酮ⅡA合酶基因及其编码蛋白，并在体内和体外均验证其具有丹参酮ⅡA合酶基因，为大规模生产丹参酮ⅡA提供了新途径，也为工业生产其他相关的丹参酮类化合物奠定了坚实的基础。

附图说明

[0018] 图1.大肠杆菌原核体系中丹参酮ⅡA合酶(TⅡAS)催化隐丹参酮生成丹参酮ⅡA。

[0019] 图2.大肠杆菌原核体系中丹参酮ⅡA合酶(TⅡAS)催化异隐丹参酮生成异丹参酮ⅡA。

[0020] 图3.在体外酶活反应体系中TⅡAS蛋白可催化CT生成TⅡA。

[0021] 图4.TⅡAS过表达转化丹参发根中丹参酮TⅡA的含量。1为隐丹参酮，2为丹参酮TⅡA。

[0022] 图5.TⅡAS‑RNAi转化丹参发根中隐丹参酮的积累和丹参酮TⅡA含量受到抑制。1为隐丹参酮，2为丹参酮TⅡA。

[0023] 图6.SbowTⅡAS、SmeiTⅡAS、StriTⅡAS、SpriTⅡAS、SprzTⅡAS、SdigTⅡAS和SsubTⅡAS蛋白催化的体系中CT被催化产生丹参酮ⅡA(TⅡA)。

具体实施方式

[0024] 下面通过具体实施方式对本发明做进一步的说明，以便于更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0025] 下述实施例中所用的各种试剂盒、酶均购于天根生化科技有限公司和Thermo Fisher公司。

[0026] 实施例1克隆丹参TⅡAS基因及构建相应过表达、RNAi表达载体和大肠杆菌表达载体

[0027] (1)TⅡAS基因引物设计与合成

[0028] 首先对丹参根和叶的转录组进行深度测序，然后，根据根和叶中差异表达基因的筛选确定在根中高表达的基因库，以拟南芥中已报道过的α‑酮戊二酸依赖型氧化酶(2‑ODD)蛋白序列为标准，在根中高表达基因库中通过同源比对确定候选蛋白基因序列，通过体外酶活鉴定确定了候选蛋白的功能。

[0029] 过表达和RNAi载体采用gateway的方法，原核表达载体采用酶切连接的方法构建。利用primer premier5.0(PP5)设计引物，根据PP5软件推荐设计，在TⅡAS全长基因中选取
395bp的一段设计RNAi载体，设计引物时在TⅡAS片段及全长的两端引物各自加上了Gateway重组位点和酶切位点(用下划线表示)。

[0030] TⅡASox‑F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCCACATCCAGCTTGAAAAATT[0031] TⅡASox‑R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTAGACATTGTCTTCATCTTGCAAT[0032] TⅡAS‑RNAi‑F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAAGATGCGGAGGCGAAGAAGCAGTT[0033] TⅡAS‑RNAi‑R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTGGAGAAGAATAGTTAGGAAACAA[0034] TⅡAS‑BamHI‑F：cgggatccATGGCCACATCCAGCTTGAAAAATT

[0035] TⅡAS‑NotI‑R：ataagaatgcggccgcTTAGACATTGTCTTCATCTTGCAAT

[0036] 引物由上海生工合成。

[0037] (2)TⅡAS基因的克隆

[0038] 以丹参根为材料，按照RNA提取试剂盒的说明书提取丹参根部的总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录得到丹参根部的cDNA。

[0039] 以cDNA为模板，分别以TⅡASox‑F，TⅡASox‑R；TⅡAS‑RNAi‑F，TⅡAS‑RNAi‑R和TⅡAS‑BamHI‑F，TⅡAS‑NotI‑R为引物进行扩增反应，获得TⅡAS片段及全长基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。

[0040] PCR反应体系：cDNA 1μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，phusion HF buffer 10μL，10μL dNTP mix 1μL，phusion enzyme 0.5μL，ddH2O 32.5μL。

[0041] PCR的设定程序是：1)98℃，3min；2)98℃，10s；3)55℃，20s；4)72℃，1min；5)72℃，5min。循环从2)到4)，循环数40个。

[0042] PCR扩增结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分别获得了1183bp、453bp和1146bp的基因片段及全长。

[0043] (3)构建pDonar207‑TⅡASox和pDonar207‑TⅡAS‑RNAi载体

[0044] 将(2)中的1183bp和453bp的PCR产物使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度，之后进行BP反应。

[0045] BP反应：PCR产物100‑200ng(3μL)，pDonar207 100ng(1μL)，1×TE0.5μL，BP Clonase酶0.5μL；25℃温育5h，加入0.5μL蛋白酶K，37℃温育10min，终止BP反应。

[0046] 将上述反应产物转化大肠杆菌DH10B，将菌液涂布在含有20mg/L的庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单克隆进行菌落PCR验证，将阳性克隆送到生工公司测序。根据测序结果提取质粒，得到质粒pDonar207‑TⅡASox和pDonar207‑TⅡAS‑RNAi。

[0047] (4)构建TⅡAS基因的过表达和RNAi表达载体

[0048] 针对TⅡAS基因的过表达载体使用的是pK7WG2R，RNAi表达载体使用的是载体pK7GWIWG2R，将(3)中的经BP反应得到的质粒测定浓度后，分别进行LR反应。

[0049] LR反应：BP反应质粒pDonar207‑TⅡASox和pDonar207‑TⅡAS‑RNAi 100‑200ng(3μL)，pK7WG2R和pK7GWIWG2R 100ng(1μL)，1×TE 0.5μL，LR Clonase酶0.5μL；25℃温育5h，加入0.5μL蛋白酶K，37℃温育10min，终止LR反应。将上述反应产物转化大肠杆菌DH10B，将菌液涂布在含有50mg/L的壮观霉素(Spe)的LB固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单克隆进行菌落PCR验证。

[0050] 得到的阳性克隆提取质粒即得到含有目的基因全长的过表达载体pK7WG2R‑TⅡAS和含有基因片段的植物RNAi载体pK7GWIWG2R‑TⅡAS。

[0051] (5)TⅡAS基因的原核表达载体

[0052] 将(2)中的1146bp的PCR产物使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度，之后进行酶切反应，限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自Thermo公司。

[0053] 酶切反应：反应为20μL体系。PCR产物10μL或pET32a质粒DNA 5μL，10x FastDigest缓冲液2μL；37℃温育10min，酶切产物使用天根切胶回收试剂盒回收，测定回收产物的浓度，之后进行连接反应。

[0054] 连接反应：反应为20μL体系。12μL酶切后的PCR产物和3μL酶切后的pET32a质粒DNA，加入2μL 10x T4 DNA Ligase缓冲液，加入0.25μL连接酶，16℃反应30min。

[0055] 将上述反应产物转化大肠杆菌DH10B，将菌液涂布在含有100mg/L的氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单克隆进行菌落PCR验证，将阳性克隆送到生工公司测序。根据测序结果提取质粒，得到质粒pET32a‑TⅡAS。

[0056] 实施例2在原核体系中验证丹参TⅡAS基因的蛋白可催化隐丹参酮的功能

[0057] (1)在原核大肠杆菌中表达丹参TⅡAS基因的蛋白

[0058] 将原核表达载体pET32a‑TⅡAS用化学转化的方法转入大肠杆菌Rosetta2(DE3)菌株中，得到含有目的基因的大肠杆菌菌株，同时转化含有pET32a空质粒作为阴性对照，在含有100mg/L的氨苄青霉素的LB固体培养基上37℃生长过夜，挑选阳性克隆用于后续实验。

[0059] 然后挑取阳性单克隆在2mL含有100mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃下生长过夜。再接种到50mL含有100mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下培养OD600至0.5，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，同时加入50μM的隐丹参酮作为底物，16℃180rpm下诱导目的蛋白表达及酶促反应。培养24h后收集菌体。

[0060] (2)收集菌体后，用1mL甲醇溶解菌体，超声破碎2h提取代谢产物。12000rpm离心5min取上清，用0.22μm的有机滤膜过滤，即得样品，用于UPLC检测。

[0061] UPLC检测条件：安捷伦1260infinityⅡPrime LC系统，ACQUITY UPLC HSS C18(2.1×100mm,1.8μm)柱，检测波长270nm。流动相条件：流速0.5mL/min，流动相为0.1％甲酸水(A)和0.1％甲酸的乙腈(B)，柱温40℃，梯度洗脱：0‑8min，50％‑80％B；8‑8.5min，80％‑100％B；8.5‑11min，100％B；11‑11.5min，100％‑50％B；11.5‑14.5min，50％B。

[0062] 结果表明：在大肠杆菌原核体系中，结果如图1，以pET32a空载为对照，隐丹参酮(CT)为底物，不能产生新的产物；而在丹参酮ⅡA合酶催化体系中，CT被催化产生了新的产物丹参酮ⅡA(TⅡA)。结果说明丹参酮ⅡA合酶(TⅡAS)能够催化CT生成TⅡA。

[0063] 实施例3在原核体系中验证丹参TⅡAS基因的蛋白可催化异隐丹参酮的功能[0064] (1)在原核大肠杆菌中表达丹参TⅡAS基因的蛋白(具体方法与实施例2相同)。

[0065] 与实施例2不同在，诱导蛋白的同时加入50μM的异隐丹参酮(iCT)作为底物进行酶促反应。

[0066] (2)收集菌体后，提取及UPLC检测方法同实施例2。

[0067] 结果表明：在大肠杆菌原核体系中，结果如图2所示，底物异隐丹参酮(iCT)在空载pET32的反应体系中没有新产物生成，而在丹参酮ⅡA合酶(TⅡAS)的催化下生成了新产物异丹参酮TⅡA(iTⅡA)。说明TⅡAS能够催化异隐丹参酮生成异丹参酮ⅡA。

[0068] 实施例4：在体外酶活反应体系中验证TⅡAS基因的蛋白可催化隐丹参酮的功能[0069] (1)在原核大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达丹参TⅡAS基因的蛋白，具体方法参考实施例2，与实施例2不同处在于，接种到50mL含有100mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下培养OD600至0.5，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，此时不加入任何底物，16℃180rpm下诱导目的蛋白表达，培养24h后收集菌体后进行蛋白的纯化。

[0070] (2)在菌体中加入5mL Binding buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole，pH7.4)重悬菌体，并充分混匀菌体沉淀。高压破碎后，置于4℃预冷的离心机，12000rpm离心10min。取上清加入含有1mL Ni‑NAT镍珠的支撑小柱中，并置于4℃中过滤上清液，加入15mL Wash buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH7.4)，清洗镍柱。待所有wash buffer即将滤净时，向镍柱加入2mL Elution buffer(50mM NaH2PO4，
300mM NaCl，250mM imidazole，pH7.4)，将目的蛋白从镍珠上洗脱。纯化后的蛋白用10K的Millipore超滤管，于4℃预冷的离心机4000rpm离心30min，脱盐浓缩，其间以MES水溶液(1M，pH＝6.5)替换滤管中的缓冲液，获得纯化的浓缩蛋白。基于牛血清蛋白的蛋白浓度标准曲线，用Bradford法对其进行浓度检测，根据紫外分光光度计的吸收值换算得到最终的蛋白浓度。

[0071] (3)体外酶活反应体系为：200nM的MES(pH6.5)，1mM的α‑酮戊二酸，1mM的抗坏血2+
酸，250μM的Fe ，1mM的ATP和50μg的TⅡAS蛋白，底物隐丹参酮浓度为50μM。反应条件为20℃，180rpm，震荡反应30min后取出加入两倍反应体系体积的乙酸乙酯终止反应。

[0072] (4)剧烈震荡离心管以充分混合有机相与水相，将混合物置于离心机中12000rpm转速离心1min，取上层有机相转入新管中，真空干燥至挥干所有液体只保留离心管底部的丹参酮固体，在管中加入200μL甲醇复溶，离心并经0.22μm滤器过滤后检测。

[0073] (5)UPLC检测条件及方法同实施例2。

[0074] 结果表明：通过原核表达体系可成功获得目的蛋白TⅡAS(图3A)。TⅡAS可在体外酶活反应中催化隐丹参酮(CT)生成丹参酮ⅡA(TⅡA)，且反应依赖于α‑酮戊二酸(2OG)，反2+
应不依赖于Fe 和抗坏血酸(ASC)，但二者可促进酶活提高TⅡA的产量(图3B)。结果表明在体外酶活反应体系中TⅡAS蛋白可催化CT生成TⅡA。

[0075] 实施例5在丹参发根中过表达TⅡAS验证基因的蛋白功能

[0076] 使用化学转化的方法将TⅡAS过表达载体pK7WG2R‑TⅡAS转入根癌农杆菌菌株C58C1中，同时将含有CaMV 35S启动子的空质粒转入菌株作为阴性对照。

[0077] 野生型组培丹参的叶片作为转基因的外植体材料。用转基因农杆菌侵染丹参叶片外植体20min，无菌水清洗3次后用滤纸吸干水分后置于6,7‑V固体培养基中，避光共培养3d，取侵染后的外植体用无菌水清洗3次后用滤纸吸干水分置于含有羧苄青霉素(400mg/L)的除菌培养基中培养至长出发根。发根在固体培养基中培养3周后转移至6,7‑V液体培养基中，避光条件下40rpm转速培养2个月。

[0078] 取发根材料冻干过夜后研磨至粉末，精确称取0.05g于1mL甲醇超声破碎2h提取代谢产物。12000rpm离心5min取上清，用0.22μm的有机滤膜过滤，即得样品，用于UPLC检测。

[0079] UPLC检测条件同实施例2。

[0080] 结果表明，过表达TⅡAS转化丹参发根中，丹参酮ⅡA(化合物2)含量明显提高(图4)，过表达株系中TⅡA的含量可达到对照的2.8倍。说明在丹参中TⅡAS参与丹参酮TⅡA的生物合成，提高TⅡAS表达量可以促进丹参酮TⅡA的生物合成。

[0081] 实施例6在丹参发根RNAi中验证TⅡAS基因的蛋白功能

[0082] 使用化学转化的方法将RNA干扰载体pK7GWIWG2R‑TⅡAS转入根癌农杆菌菌株C58C1中，同时将含有CaMV 35S启动子的空质粒转入菌株作为阴性对照。

[0083] RNAi载体转化发根、发根的培养和化合物的提取等方法同实施例5。

[0084] UPLC检测条件：安捷伦1260infinityⅡPrime LC系统，ACQUITY UPLC HSS C18(2.1×100mm,1.8μm)柱，检测波长270nm。流动相条件：流速0.5mL/min，流动相为0.1％甲酸水(A)和0.1％甲酸的乙腈(B)，柱温40℃，梯度洗脱：0‑8min，50％‑58％B；8‑20min，58％‑70％B；20‑20.5min，70％‑80％B；20.5‑24.5min，80％‑100％B；24.5‑25min，100％‑50％B；25‑28min，50％B。

[0085] 结果表明，TⅡAS‑RNAi转化丹参发根中(图5)，丹参酮ⅡA(化合物2)的含量明显受到抑制，对照株系中TⅡA的含量为0.66mg/g(干重含量)，而干扰株系中仅为0.09mg/g(干重含量)；而作为底物的隐丹参酮(化合物1)积累提高，对照组为1.82mg/g(干重含量)，而RNAi株系中增加到8.46mg/g(干重含量)。这进一步表明在丹参中TⅡAS参与丹参酮TⅡA的生物合成。因此，提高TⅡAS表达量可以促进丹参酮TⅡA的生物合成，印证了实施例5的实验结果。

[0086] 实施例7：在原核体系中验证7种鼠尾草属植物(Salvia spp.)中TⅡAS同源蛋白的功能。

[0087] (1)基于南丹参(S.bowleyana)、美丽鼠尾草(S.meiliensis)、三叶鼠尾草(S.trijuga)、红根草(S.prionitis)、甘西鼠尾草(S.przewalskii)、毛地黄鼠尾草(S.digitaloides)和佛光草(S.substolonifera)转录组，通过blast确定这些物种中TⅡAS的同源蛋白，分别命名为SbowTⅡAS、SmeiTⅡAS、StriTⅡAS、SpriTⅡAS、SprzTⅡAS、SdigTⅡAS和SsubTⅡAS，其核苷酸和氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。原核表达载体的构建参照实施例1中酶切连接的方法，分别获得质粒pET32a‑SbowTⅡAS、pET32a‑SmeiTⅡAS、pET32a‑StriTⅡAS、pET32a‑SpriTⅡAS、pET32a‑SprzTⅡAS、pET32a‑SdigTⅡAS和pET32a‑SsubTⅡAS。所用引物如下：

[0088] SbowTⅡAS‑BamHI‑F：cgggatccATGCAGGAAGACGATCGCGTGAAGG

[0089] SbowTⅡAS‑NotI‑R：ataagaatgcggccgcTTAGACATTGTCTTCATCTTGCAAT

[0090] SmeiTⅡAS‑BamHI‑F：cgggatccATGGCCACATCCAGCTTGAAAAATT

[0091] SmeiTⅡAS‑NotI‑R：ataagaatgcggccgcTTAGACATTGTCTTCATCTTGCAAT

[0092] StriTⅡAS‑BamHI‑F：cgggatccATGGCGGCAGACGATCGCGTGGAGG

[0093] StriTⅡAS‑NotI‑R：ataagaatgcggccgcTTAGACATTGTCTTCATCTTGCAAC

[0094] SpriTⅡAS‑BamHI‑F：cgggatccATGCAGGAAGACGATCGCGTGAAGG

[0095] SpriTⅡAS‑NotI‑R：ataagaatgcggccgcTCACAAAGTGTCAGCACAAAGAGAT

[0096] SprzTⅡAS‑BamHI‑F：cgggatccATGGAGGAAGACGATCGCATGGAGG

[0097] SprzTⅡAS‑NotI‑R：ataagaatgcggccgcTCACAAAGTGTCAGCACAAAGAGAT

[0098] SdigTⅡAS‑BamHI‑F：cgggatccATGGAGGAAGACGATCGCATGAAGG

[0099] SdigTⅡAS‑NotI‑R：ataagaatgcggccgcTCACAAAGTGTCAGCACAAAGAGAT

[0100] SsubTⅡAS‑BamHI‑F：cgggatccATGCATATTTCAACCATTTTTCTGC

[0101] SsubTⅡAS‑NotI‑R：ataagaatgcggccgcCTAAGTAATAATTAACCTGAACTCA

[0102] (2)在原核体系中验证SbowTⅡAS、SmeiTⅡAS、StriTⅡAS、SpriTⅡAS、SprzTⅡAS、SdigTⅡAS和SsubTⅡAS蛋白的功能，其方法同实施例2。

[0103] 结果表明：在大肠杆菌原核体系中，结果如图6，以pET32a空载为对照，隐丹参酮(CT)为底物，不能产生新的产物；而在SbowTⅡAS、SmeiTⅡAS、StriTⅡAS、SpriTⅡAS、SprzTⅡAS、SdigTⅡAS和SsubTⅡAS等蛋白催化的体系中，CT被催化产生了丹参酮ⅡA(TⅡA)。说明与丹参近缘的物种中，如南丹参、美丽鼠尾草、三叶鼠尾草、红根草、甘西鼠尾草、毛地黄鼠尾草和佛光草等，丹参酮ⅡA合酶(TⅡAS)的同源蛋白均能够催化CT生成TⅡA。